4.6. 티오바르비투르산 반응성 물질(TBAR)

TBARs의 함량은 지질 과산화의 지표로 사용되었습니다. 뇌 조직에서 50mM 인산염 완충액(pH 7.4)을 25mg/mL(w/v)의 농도로 첨가하고 현탁액을 10초 동안 초음파 처리하여 균질화시켰다. 30 μL의 균질액에 250 μL의 1% 인산과 75 μL의 0.6% 티오바르비투르산(TBA)을 첨가했습니다. 시약 혼합물을 수조에서 100°C로 45분 동안 배양한 후 얼음 수조에서 냉각한 다음 4°C에서 10분 동안 3000×g로 원심분리했습니다. 각 샘플에서 150μL의 상청액을 채취했습니다. FLUOSTAR 마이크로플레이트 판독기(BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Germany)를 사용하여 여기 필터를 485nm(대역폭 5nm)로 설정하고 방출 필터를 530nm(대역폭 5nm)로 설정하여 형광을 측정했습니다. Malondialdehyde(MDA)를 표준물질로 사용하여 검량선을 작성하였다. 결과는 pmol MDA/mg 단백질로 표현되었습니다.

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA의 함량을 감소시키며 정자 막 기능에 대한 특정 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력이 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼로 인한 콜라겐 분해를 방지하는 능력이 있으며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.

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4.7. 주요 항산화 효소의 효소 활성

뇌 조직에서 효소 활성을 측정하기 위해 50mM 인산완충액(pH 7.4)과 항프로테아제(1mM EDTA, 1mM PMSF, 1g/mL pepstatin 및 1g/mL leupeptin)를 포함하는 용해 완충액을 50mg/mL(w/v)의 농도. 그런 다음 현탁액을 ice bath에서 30초 동안 초음파 처리하고 균질액을 10000×g에서 15분 동안 4 ◦C에서 원심 분리했습니다. 항산화 효소의 효소 활성 측정을 위해 상등액을 수집하였다.

SOD(Superoxide dismutase) 활성은 420 nm에서 pyrogallol autooxidation의 억제에 따라 측정되었습니다[69]. 효소 1단위는 피로갈롤 자가산화율을 50% 억제하는데 필요한 효소량으로 정의하였다. SOD 효소 활성은 국제 단위(IU)/mg 단백질로 표현하였다. 카탈라아제(CAT) 활성은 Triton-X-100(1%, v/v) 처리된 상청액에서 240nm에서 과산화수소(H2O2)가 사라지면서 측정되었으며[70], 효소 활성은 기질로 보고되었습니다( µmol H2O2) 변환/분 · mg 단백질. 총 글루타티온 퍼옥시다제(GPx)는 과량의 GR, GSH 및 쿠멘 하이드로퍼옥사이드의 존재 하에 340nm에서 NADPH 산화 후에 측정되었습니다[71]. GPx 활성은 기질(nmol NADPH) 형질전환/min mg 단백질로 표현되었습니다. 글루타티온 환원효소(GR) 활성은 GSSG의 존재 하에 340nm에서 NADPH 산화 후 분석되었고 [72] 기질(nmol NADPH) 변환/분 · mg 단백질로 표현되었습니다. GR 및 두 GPx 활동은 생물학적 샘플이 없는 경우(효소가 없는 경우) 자발적인 반응에 대해 보정되었습니다.

4.8. BACE1 활동 테스트

BACE1 테스트 프로토콜은 두 개의 리포터 분자, 즉 EDANS와 DABCYL에 접합된 세크레타제 특이적 기질(펩티드)을 사용하여 형광 신호를 방출합니다[73,74]. BACE1 활동은 피질과 해마 용해물 모두에서 측정되었습니다. 반응은 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)에서 10μM 기질을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 수행되었습니다. 형광 강도 측정은 여기 필터가 360nm(대역폭 5nm)로 설정되고 방출 필터가 530nm(대역폭 5nm)로 설정된 FLUOSTAR 마이크로플레이트 판독기(BMG LABTECH, Ortenberg, BadenWürttemberg, Germany)를 사용하여 수행되었습니다. 세크레타제 효소 활성의 수준은 형광 측정 반응에 비례하며, 데이터는 배경 대조군(기질 또는 조직이 없는 반응)에 비해 형광의 x배 증가로 표현됩니다. BACE1 활동은 단백질 농도로 정규화되었습니다. 퀘르세틴 또는 루틴 처리된 마우스의 BACE1 활성은 TgAPP 대조군 마우스의 활성 백분율로 표현되었습니다.

4.9. 주요 항산화 효소인 APP, BACE1, ADAM10, Caspase-3 및 Caspase-6와 염증성 사이토카인의 RT-PCR 유전자 발현

4.9.1. 총 RNA 추출 및 정제

우리는 -80 ◦C에 저장된 뇌의 다른 영역, 즉 피질과 해마를 분석했습니다. 알려진 양의 뇌 조직에 Triomol® 용해 완충액을 1:10(w/v)의 비율로 첨가했습니다. 무선 모터(Pellet pestle, Sigma-Aldrich)를 사용하여 샘플을 30초 동안 균질화하고 25°C에서 5분 동안 배양하여 핵단백질 복합체를 완전히 분리했습니다. 그런 다음 사용된 Triomol® 용해 버퍼 각 mL에 대해 0.2mL의 클로로포름을 추가했습니다. 튜브를 15초 동안 격렬하게 흔들고 25℃에서 3분 동안 배양하였다. 그런 다음 11,000×g에서 4 ◦C에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, RNA가 상부에 있는 3개의 상을 얻었다.

RNA를 분리하기 위해 상부 상을 다른 튜브로 옮기고 0.5 mL 이소프로판올을 첨가하여 침전시켰다. 이소프로판올과 수용액을 뒤집어 완전히 섞은 후 침전을 촉진시키기 위해 상온에서 10분 동안 배양하고 4 ◦C에서 12,000×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고 4oC에서 5분 동안 7500xg에서 원심분리했습니다. 펠릿을 실온에서 건조시키고 50μL의 DEPC 처리수에 용해시켰다. DNA의 흔적을 제거하기 위해 2.5 µL의 DNase(RNase-free)를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양했습니다. 마지막으로 샘플을 64℃에서 5분 동안 배양하여 DNase를 비활성화시켰다.

이어서, UV-VIS 분광광도계(BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Germany)에서 260 nm에서 RNA의 농도를 측정하고 260 및 280 nm에서의 흡광도 비율(A260/A280)을 고려하여 순도를 평가하였다.

RNA 무결성 및 순도의 측정은 GelRed로 염색된 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 수행되었으며 UV 광 아래에서 시각화되었습니다. 여기서 RNA가 손상되지 않은 경우 리보솜 RNA(28S 및 18S)에 해당하는 두 개의 위쪽 밴드와 두 개의 아래쪽 밴드가 나타납니다. tRNA(transfer RNA)와 5S 리보솜 RNA에 해당하는 것을 관찰해야 했다.

4.9.2. 상보적 DNA(cDNA) 합성

cDNA는 RNA보다 훨씬 안정적이므로 보다 편리하고 안전한 시료 취급이 가능합니다. cDNA는 RT-qPCR용 First Strand cDNA 합성 키트(Fermentas Life Sciences)를 사용하여 역전사에 의해 mRNA로부터 합성되었습니다.

2 μg의 RNA에 cDNA 합성을 위한 역전사를 수행하기 위해 11 μL의 DEPC 처리수와 1 μL의 10X Random 프라이머를 첨가했습니다. 그런 다음 혼합물을 65oC에서 10분 동안 배양하여 RNA를 변성시켰다. 이 시간이 지나면 RNA의 재생을 피하기 위해 튜브를 즉시 4℃에서 5분 동안 두었습니다. cDNA 합성을 위한 시약 혼합은 표 S1(보충 데이터)에 나와 있습니다.

8μL의 반응 혼합물을 각 샘플에 첨가했습니다. 전체 부피를 튜브 바닥으로 가져와 42 ºC에서 60분 동안 배양했습니다. 마지막으로 역전사효소를 70℃에서 10분간 가열하여 불활성화시켜 반응을 정지시켰다.

4.9.3. 실시간 PCR

Real-Time PCR의 주요 특징은 형광을 결정하여 증폭 과정에서 생성물의 분석이 이루어진다는 것입니다. 이러한 방식으로 증폭 및 검출 프로세스는 추가 조치 없이 동일한 튜브 또는 바이알에서 동시에 발생합니다. 실시간 PCR의 경우 형광을 증폭하고 동시에 검출할 수 있는 열 순환기(thermal cycler)가 사용됩니다. 우리는 LightCycler 실시간 열 순환기(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 활용했습니다.

표 S2(보충 데이터)는 검출 시스템으로 서열별 프라이머 및 DNA 결합 염료(SYBR Green I, Roche Molecular Systems, Inc., Rotkreuz, Switzerland)를 사용하여 실시간 PCR에 필요한 시약을 나열합니다.

다양한 정량화된 마커에 대한 프라이머 설계를 위해 Primer3Plus 생물 정보학 프로그램이 사용되었으며 이를 위해 Medline 오픈 액세스 데이터베이스에서 관심 유전자의 cDNA 서열을 가져왔습니다. 프라이머는 Merck(Sigma-Aldrich)에 의해 공급되었습니다. 혼성화 온도와 사용된 다른 프라이머의 순서는 표 S3(보충 데이터)에 나와 있습니다.

관심 유전자의 증폭을 위한 반응 조건은 표 S4(보충 데이터)에 나와 있습니다.

마지막으로 샘플을 용융 프로그램에 적용했습니다: 95ºC에서 15초, 65ºC에서 30초, 최대 98ºC에서 0.1ºC/s의 속도로 연속 형광 기록을 했습니다.

cDNA 수준의 정량화를 위해 GADPH를 하우스키퍼로 사용하여 주기 역치(Ct) 비교 방법[75]을 사용했습니다. 가사도우미의 증폭은 분석된 유전자와 병렬로 이루어졌다. Ct 값은 LightCycler(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)에서 제공하는 4.0 소프트웨어를 사용하여 계산되었습니다. 이 소프트웨어를 사용하면 샘플 증폭으로 인한 형광과 배경을 구별할 수 있습니다. 용융 곡선도 기록되었습니다. 증폭된 단편의 용융 온도를 측정하여 증폭된 제품의 특성을 파악할 수 있었습니다. 밴드의 크기는 1.5% 아가로스 젤에서 확인했습니다.

퀘르세틴 또는 루틴 처리로 연구 중인 유전자 발현의 변화는 대조군 TgAPP(처리하지 않은 마우스)의 함수로 표현되었고 이 발현을 GADPH 수준으로 정규화했습니다. Change Fold(2−∆∆Ct)는 대조군 마우스와 관련된 특정 처리 하에서 관심 있는 유전자가 변형되는 횟수를 나타냅니다.

4.10. 통계 분석

모든 테스트는 적어도 중복으로 그리고 세 가지 다른 실험에서 수행되었습니다. 얻은 결과는 평균 ± 표준 오차로 표현됩니다. 단방향 분산 분석(ANOVA)은 데이터가 테스트되고 정규 분포에 맞는 것으로 입증되면 수행되었습니다. Newman-Keuls 다중 비교 사후 테스트를 실행하여 그룹 간의 평균 차이를 조사했습니다. p < 0.05의 값이 중요한 것으로 간주되었습니다. SigmaPlot 11.0 소프트웨어는 통계 분석에 사용되었습니다.

5. 결론

식이 습관과 보충은 세포 산화환원 상태에 영향을 줄 수 있습니다. 이를 바탕으로 우리는 무증상 알츠하이머병에서 세포 산화환원 상태와 프로테아좀 의존성 아밀로이드 특징 사이의 상호작용을 고려하여 아밀로이드 병리를 완화하기 위해 케르세틴 또는 루틴을 포함하는 플라보노이드 식이로 AD 마우스 모델에서 세포 산화환원 항상성을 개선하는 것을 목표로 했습니다. 우리의 데이터 세트는 TgAPP 마우스 모델에 표시된 플라보노이드 효과가 우리의 체외 및 생체 외 모델에서 이전에 보고된 것과 일치하기 때문에 관련이 있습니다.

결론적으로, 우리의 연구 결과는 무증상 단계 또는 AD 유사 증상의 시작에서 식이 요법을 시작하면 APP 발현 및 BACE1 활동의 동시 정규화를 통해 세포 산화환원 상태 및 APP 생리학적 처리를 회복시킬 수 있음을 보여줍니다.

우리의 발견을 인간의 상태에 외삽하는 것은 어렵지만 미래의 치료법에 대한 인간의 반응에 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다. 두 가지 플라보노이드 중 생체 내 효과가 전반적으로 더 두드러지는 루틴은 뇌의 세포 내 산화환원 항상성의 증가에 기반하여 AD의 보조 요법으로 매일 식단에 포함되기에 가장 적합한 것으로 보입니다.

보충 자료:다음 지원 정보는 웹 사이트에서 다운로드할 수 있습니다. 참조 [76]은 보충 자료에 인용되어 있습니다.

저자 기여:PB-B. 그리고 SM-A. 아이디어와 실험 설계를 구상하고, 실험을 돕고, 얻은 결과를 해석하고, 원고를 썼습니다. KLJ-A. 실험을 수행하고, 데이터 분석을 수행하고, 얻은 결과를 해석했습니다. JB는 원고의 데이터 분석 및 수정을 도왔습니다. 모든 데이터는 사내에서 생성되었으며 제지 공장은 사용되지 않았습니다. 모든 저자는 무결성과 정확성을 보장하는 작업의 모든 측면에 대해 책임을 지는 데 동의합니다. 모든 저자는 원고의 출판된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.

자금 조달:이 연구는 의학 연구 재단 «Mutua Madrileña»(의학 연구 프로젝트 보조금 제4판), 스페인 교육 과학부(Ref. AGL2008-04892-C03-02) 및 스페인 과학혁신부(Ref. CTQ2010-16170).

기관 검토 위원회 성명서:동물 프로토콜은 Complutense University of Madrid의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/과 동물 복지에 관한 스페인 법률을 완전히 준수했습니다( Royal Decree 53/2013, 2013년 2월 1일).

정보에 입각한 동의서:적용되지 않습니다.

데이터 가용성 진술:이 연구 결과를 뒷받침하는 데이터는 합당한 요청 시 해당 작성자에게 제공됩니다.

감사의 말:우리는 KLJA에 대한 박사 전 보조금에 대해 Folch 재단에 감사드립니다.

이해 상충:저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

약어

AD, 알츠하이머병; ADAM-10, A 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인 함유 단백질 10; APP, 아밀로이드 전구체 단백질; APPswe, 아밀로이드 전구체 단백질의 스웨덴 돌연변이; A, 아밀로이드-; BACE1, -부위 APP 절단 효소 1; CAT, 카탈라아제; GPx, 글루타티온 퍼옥시다제; GR, 글루타티온 환원효소; GSH, 환원된 글루타티온; GSSG, 산화 글루타티온; SOD, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제.

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