동형 접합 Dab1−//는 생쥐 신장 및 요로의 상염색체 열성 선천성 기형의 잠재적인 새로운 원인입니다
Feb 28, 2022
소개
Dab1 유전자의 돌연변이를 자발적으로 획득하여 얻은 Yotari 돌연변이 생쥐는 중추 신경계에서 조직학적 이상을 보이며[1,2], 이는 릴러(reelin//) 생쥐와 매우 유사하여 릴린과 DAB1에 속함을 시사합니다. 동일한 신호 경로 [1-4]. Reelin/DAB1 경로의 이상은 다양한 정신 장애와 관련이 있는 것으로 보고되었습니다[5-7]. 흥미롭게도, 중추신경계 외에 DAB1 및 릴린 단백질의 존재가 말초신경계 및 일부 신경외 조직에서도 확인되었습니다. DAB1의 존재는 마우스 족세포[8]와 인간 태아에서 발견되었습니다.신장[9] 릴린 발현은 마우스 및 인간 태아 발달 동안뿐만 아니라 성체 마우스의 혈관을 따라 일부 내피 세포에서 보고된 바 있습니다[9-11]. 표준 릴린/DAB1 경로는 NOTCH2 수용체를 포함한 별개의 다운스트림 단백질을 유발할 수 있으며, 이는신장개발 [12–14]. NOTCH2 수용체는 근위 세뇨관과 족세포를 형성하는 데 필요하지만[13], 일단 네프론 성숙이 달성되면 이 경로는 대부분 침묵됩니다[15]. 급성 상태에서신장 질환,NOTCH2의 증가된 발현은 잠재적으로 재생에 기여할 수 있는 반면 지속된 발현은 인과적으로 간질 섬유화 및 사구체 경화증과 관련이 있습니다[15]. NOTCH 신호전달의 하향 조절은 자가포식을 크게 감소시키고 발달 동안 족세포 분화 손상을 유발할 수 있습니다[16].
결과적으로, 기능 장애 족세포는 사구체 질환, 특히 인간 특발성 신증후군[17,18] 및 최소 변화 신증후군(MCNS)[19]에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 autophagy는 정상적인 생리적 조건에서 세포 항상성을 유지하는 반면 병리학 적 조건에서는 autophagic 죽음으로 진행될 수 있습니다 [20]. 널리 사용되는 자가포식 바이오마커는 자가포식소체막의 구조 단백질인 LC3B이다[21]. autophagy와 apoptosis 사이의 복잡한 누화는 또한 세포의 미세 환경에 대한 반응으로 항상성 균형을 유지하는 데 기여합니다. apoptotic 이벤트의 수가 증가한다는 것은 잘 알려져 있습니다.신장발달 [22] 다음 조건을 제외하고 성숙이 끝나면 크게 감소합니다.신장 손상[23]. 부정할 수 없이, apoptosis는 여러 경로의 상호작용을 통해 조절되는 복잡한 메커니즘이지만 대부분 caspase3(CASP3)의 활성화로 끝납니다.
이 보고서에서 우리는 Dab1 유전자 기능적 침묵이 어떻게 영향을 미치는지 분석하는 것을 목표로 했습니다.신장출생 후 마우스에서 형태 및 릴린, NOTCH2, LC3B 및 절단된 CASP3 단백질의 발현 및 위치신장. 우리는 이러한 단백질이 출생 후 마우스에서 발현된다고 가정합니다.신장,그리고 그들의 기능적 상호작용은 구조와 기능의 유지에 기여합니다. 또한, DAB1의 존재는 태아 인간 동안 확인되었으므로신장발달 [9], 그것의 비활성화는 선천성 기형의 넓은 스펙트럼에서 장애를 일으킬 수 있다고 추정할 수 있습니다.신장및 요로(CAKUT).
키워드:요타리; 신장 기능; 출생 후 신장 발달; 면역형광 염색; 투과 전자 현미경
CISTANCHE는 신장/신장 기능을 향상시킵니다.
재료 및 방법
샘플 컬렉션Dab1 null 기존 돌연변이로서 우리는 이전에 Howell et al.에 의해 설명된 yotari(Dab1/ ) 마우스를 사용했습니다. [24]. 마우스의 유전형 분석에 사용된 PCR 프라이머는 yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT 및 CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, Dab1 유전자좌의 야생형: GCCCTTCAGCATCACCATGCT 및 CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT[5]. C57BL/6 N 마우스를 사육하고 12시간 조명이 있는 온도 제어(23 ± 2℃) 방에서 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 표준 폴리카보네이트 케이지(각 유전자형 중 하나 이상 포함)에 그룹 수용했습니다. 다크 사이클. 생후 4, 11, 14일(P4, P11, P14)에 마우스를 펜토바르비탈로 깊게 마취하고 인산완충식염수(PBS, pH 7.2) 및 4% 파라포름알데히드(PFA)로 1{23}}분 동안 경심관류했습니다. ) 0.1M PBS에서.신장기존의 조직학적 분석(헤마톡실린-에오신(H&E), 면역조직화학 및 면역형광 염색) 및 2% PFA + 2.5% 글루타르알데히드(GA) 혼합물의 경우 1M PBS에서 밤새 제거하고 4% PFA로 고정했습니다. 전자현미경 검사용. 고정 후 조직은 이전에 설명한 대로 추가 조직학적 검사를 위해 준비되었습니다[25,26].
면역형광 및 면역과산화효소 염색탈파라핀화 및 재수화 후 섹션을 물 증기선의 0.01M 시트레이트 완충액(pH 6.0)에서 2{1}}분 동안 가열한 후 실온으로 냉각했습니다. 불특정 염색을 배제하기 위해 차단 완충액(ab 64226, Abcam, Cambridge, UK)을 30분 동안 적용했습니다. 그런 다음 섹션을 1차 항체와 함께 습도 챔버에서 밤새 인큐베이션했습니다(표 1). PBS로 세척한 후 2차 항체(표 1)를 1시간 동안 도포하고 다시 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 핵을 2분 동안 4060 -디아미디노{10}}페닐린돌(DAPI)로 염색하고 PBS로 세척하고 커버슬립했습니다. 각각의 1차 항체에 해당 펩타이드를 사용하고 이들의 조합을 절편에 적용하도록 사전 흡착 테스트를 수행했습니다. 결과는 항체 염색을 나타내지 않았습니다. 또한, 2차 항체의 비특이적 결합 수준을 결정하기 위해 1차 항체를 생략한 대조군을 수행하였다.
면역과산화효소 염색을 위해 토끼 다클론 항-CASP3(1:1{5}}0 희석, ab13847, Abcam, Cambridge, UK)를 0.1로 절편을 처리한 후 습도 챔버에서 1시간 동안 일차 항체로 적용했습니다. 퍼센트 H2O2. PBS에서 세척한 후, 배경 과염색을 피하기 위해 주의 깊게 제어된 링크 및 스트렙타비딘 퍼옥시다제(DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) 및 디아미노벤지딘(Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369)을 각각 15분 동안 사용하여 2차 검출을 수행했습니다. 핵을 헤마톡실린으로 염색하고, 수돗물로 10분 동안 헹구고, 오름차순 에탄올 용액에서 간단히 탈수하고, 커버슬립시켰다.
투과 전자 현미경(TEM)을 위한 조직 준비2% PFA와 2.5% GA의 혼합물로 0.1M PBS에서 2시간 동안 고정한 후, 샘플을 PBS로 세척하고 2% 사산화 오스뮴 수용액에서 2시간 동안 후고정했습니다. 모든 샘플을 PBS에서 2회 세척하고 에탄올의 오름차순으로 탈수하고 Epon 812(TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK)에 포매했습니다. 일련의 섹션(두께 70 nm)을 Ultracut UCT 울트라마이크로톰(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)에서 절단하고 1% 우라닐 아세테이트 및 시트르산 납으로 염색했습니다.
데이터 수집 및 분석분석은 DP71 디지털 카메라(Olympus)가 장착된 표면형광현미경(Olympus BX51, Tokyo, Japan), 80kV에서 작동하는 JEM 1400 투과전자현미경(JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 수행하였고 JEOL 전하- 결합 장치(CCD) 카메라 시스템(Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, USA)과 마지막으로 명시야 현미경(BX40, Olympus, Tokyo, Japan)이 있습니다. 분석된 모든 이미지는 ImageJ 소프트웨어와 Adobe Photoshop(Adobe, San Jose, CA, USA)으로 처리되었습니다. 조사 그룹당 3~4마리의 동물을 사용했습니다. 모두 수집신장5 µm 두께의 섹션으로 절단되었으며 최대신장 length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, 우수한 일치를 나타냅니다[27].
통계 분석야생형과 요타리 동물의 PCT, DCT 및 G 사이의 평균 직경의 차이를 분석하기 위해 양측 t-검정을 수행했습니다. 직경은 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되었습니다. 유의 수준은 p < 0로="" 설정되었습니다.05.="" 양방향="" anova="" 테스트에="" 이어="" tukey의="" 다중="" 비교="" 테스트를="" 사용하여="" 모든="" 시점에서="" pct,="" dct="" 및="" 사구체="" 간의="" 양성="" 세포="" 백분율="" 차이를="" 조사했습니다.="" 양성="" 세포의="" 백분율은="" 평균="" ±="" 평균의="" 표준="" 오차(sem)로="" 표현되었습니다.="" 유의="" 수준은="" p="">< 0.05로="" 설정되었습니다.="" 분석은="" graphpad="" 소프트웨어(graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="" usa)에서="">
결과
헤마톡실린-에오신 염색(H&E) 및 신장 직경 측정중간 시상 부분의 H&E 염색신장모든 조사 시점에서 작은 강조 표시신장야생형에 비해 yotari 마우스의 표현형(그림 1a). 4P 평균에서신장yotari 동물의 직경은 약 75μm보다 약 55μm였습니다. 또한, 이 차이는 더 느린 성장으로 인해 후기 시점에서 눈에 띄게 나타났습니다.신장요타리의 점진적인 성장에 비해신장야생형 동물에서. 전반적인 감소 여부를 확인하려면신장크기는 네프론 세그먼트 크기의 감소로 인해 발생했으며 그룹당 PCT, DCT 및 G의 직경을 평균화했습니다. 실제로, 야생형에 비해 yotari 그룹에서 평균 직경 G, PCT 및 DCT가 감소했습니다(그림 1b, p < 0.05).="" 또한="" h&e="" 염색은="" 더="" 얇은="">신장yotari 동물의 골반 확장 및 14P에서 약간 확산 된 DCT. 사구체 성숙의 기본 구조와 패턴은 조사된 두 동물 그룹에서 동일합니다.
TEM 현미경 사진을 기반으로 한 기술적인 조직학적 분석현미경 사진에 TEM에 의해 얻은, 야생형 마우스의 사구체는 정상적으로 발달하고 인식할 수 있는 여과 장벽의 모든 부분의 전형적인 모습을 보여주었습니다(그림 2a). 족세포, 족세포 발 돌기 및 척추경, 여과 슬릿, 사구체 기저막 및 천공 내피가 있는 모세관 내강은 쉽게 구별할 수 있었습니다(그림 2a). 반면에 요타리 생쥐의 사구체에서는 발 돌기 소실과 여과 슬릿 부족으로 진행되는 족세포 손상이 관찰될 수 있었습니다(그림 2b-d). 이러한 미세구조적 변화는 모든신장검사된 사구체의 대부분을 검사하고 관련시킵니다. 야생형 동물보다 yotari 마우스의 PCT 또는 DCT에서 이상이 관찰되지 않았습니다(그림 2e-h). PCT에서는 세포막의 불규칙성과 이웃과의 세포 맞물림으로 인해 세포 계면이 제대로 정의되지 않았습니다. 세포질은 풍부하고 잘 구별되는 핵, 길쭉한 미토콘드리아, 기저 내측 접힘, 그리고 정점 막에서 브러시 경계를 형성하는 미세 융모 사이의 많은 관형 구덩이를 포함하고 있습니다. 더 높은 배율은 긴 미세 융모를 포함하는 PCT 상피 세포의 정점 표면을 나타내어 브러시 경계와 이웃하는 관형 상피 세포의 내강 세포 경계 사이의 단단한 접합을 형성합니다(그림 2e,f). 반면에, DCT 상피 세포의 정점 표면은 짧은 미세 융모와 수많은 소포를 포함했습니다(그림 2g,h).
그림 2. 야생형과 요타리의 투과전자현미경(TEM) 현미경 사진신장.야생형 동물의 사구체(a)는 모세혈관(C), 기저막(BM), 발세포(P)와 척추경(PE) 및 여과 슬릿(FS)의 천공 내피(E)가 있는 정상적으로 발달된 여과 장벽을 보여주었습니다. ). 에서신장yotari 동물의 경우, pedicles의 소실 및 fifiltration 슬릿의 부족이 발견될 수 있었습니다(별표, b-d). 야생형 동물(e-h)과 비교하여 요타리 마우스의 근위 세뇨관(PCT) 또는 원위 세뇨관(DCT)에서는 이상이 관찰되지 않았습니다. PCT에서 세포질은 풍부하여 잘 구별된 핵(N), 길쭉한 미토콘드리아(M), 기저 내측(BI), 미세 융모 사이에 많은 관형 구덩이(TP)를 포함하여 브러시 경계(BB)를 형성했습니다. 정단막(e,f). 더 높은 배율은 긴 미세 융모를 포함하는 PCT 상피 세포의 정점 표면을 나타내어 인접 관형 상피 세포(e,f)의 내강 세포 경계 사이에 브러시 경계와 단단한 접합(TJ)을 형성합니다. 한편, DCT 상피세포의 정단면은 짧은 미세융모와 수많은 소포를 포함한다(g,h). 이미지(a–d) 및 삽입(e–h)의 눈금 막대는 1 µm입니다. 이미지(e–h)의 눈금 막대는 2 µm입니다.
Reelin 및 DAB1의 현지화 및 공동 현지화Reelin은 관찰된 모든 시점에서 모든 조사 동물의 사구체 및 DCT에서 경증 내지 중등도의 반응성으로 약하게 발현되었습니다(p < 0.05,="" 그림="" 3a).="" yotari="" 마우스의="" pct에서만="" 양성="" 세포의="" 비율이="" 야생형="" 동물보다="" 유의하게="" 높았습니다(p="">< 0.05,="" 그림="" 3a).="" 사구체="" 세포에서="" 염색의="" 국소화는="" 핵주위였으며="" pct="" 및="" dct에서는="" 세포질="" 전체에="" 흩어져="" 있었습니다(그림="" a,="">
igure 4. 산후 요타리의 면역형광 염색신장릴린 마커(a) 및 출생 후 야생형의 이중 면역형광 염색으로신장DAB1 및 릴린 마커 포함(b). (a, b) DAB1과 병합된 핵 DNA DAPI 염색 및 릴린 면역형광은 병렬로 표시됩니다(병합). 관찰된 시점은 P4, P11, P14였습니다. 사구체(G), 근위 회선 세뇨관(PCT) 및 원위 회선 세뇨관(DCT)에서 검사된 마커의 발현은 화살표로 표시되고, 별표는 세포외 기질(a)에서 릴린의 발현을 나타냅니다. 삽입물은 이미지에서 가장 두드러진 표현을 보여줍니다. DAPI 핵 염색은 대부분 DCT(화살촉)에서 DAB1 및 릴린의 공동 국소화 불량을 나타냅니다. 스케일 바는 20 µm이며 모든 이미지를 나타냅니다.
P4에서 사구체 및 야생형 동물의 PCT에서 DAB1의 면역 반응성은 거의 없었고, P11 및 P14에서 약한 반응성을 갖는 양성 세포의 비율(표 2)이 유의하게 증가했습니다(p < 0.05,="" 그림="" 3b).="" dct에서="" dab1은="" 강한="" 반응성으로="" 세포막의="" 정점="" 및="" 측면="" 부분에서="" 주로="" 발현되었습니다(그림="" 4b)(표="" 2).="" 양성="" 세포의="" 비율은="" 특히="" 황반="" 덴사에서="" 약="" 60%(그림="" 3b)로="" 이전="" 구조보다="" 훨씬="" 높았습니다(그림="" 4b).="" p14(화살촉,="" 그림="" 4b)에서="" 야생형="" 동물의="" dct를="" 제외하고="" dab1과="" 릴린의="" 공동="" 국소화는="" 거의="" 없었습니다.="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" of="" 14="" 그림="" 4.="" 산후="" 요타리의="" 면역형광="">신장릴린 마커(a) 및 출생 후 야생형의 이중 면역형광 염색으로신장DAB1 및 릴린 마커 포함(b). (a,b) DAB1과 병합된 핵 DNA DAPI 염색 및 릴린 면역형광은 병렬로 표시됩니다(병합). 관찰된 시점은 P4, P11, P14였습니다. 사구체(G), 근위 회선 세뇨관(PCT) 및 원위 회선 세뇨관(DCT)에서 검사된 마커의 발현은 화살표로 표시되고, 별표는 세포외 기질(a)에서 릴린의 발현을 나타냅니다. 삽입물은 이미지에서 가장 두드러진 표현을 보여줍니다. DAPI 핵 염색은 대부분 DCT(화살촉)에서 DAB1 및 릴린의 공동 국소화 불량을 나타냅니다. 축척 막대는 20 µm이며 모든 이미지를 나타냅니다. P4에서 사구체 및 야생형 동물의 PCT에서 DAB1의 면역 반응성은 거의 없었지만, 약한 반응성을 갖는 양성 세포의 비율(표 2)은 P11 및 P14에서 유의하게 증가했습니다(p < 0.05,="" 그림="" 3b).="" dct에서="" dab1은="" 강한="" 반응성으로="" 세포막의="" 정점="" 및="" 측면="" 부분에서="" 주로="" 발현되었습니다(그림="" 4b)(표="" 2).="" 양성="" 세포의="" 비율은="" 특히="" 황반(그림="" 4b)에서="" 약="" 60%(그림="" 3b)로="" 이전="" 구조보다="" 상당히="" 높았습니다.="" p14에서="" 야생형="" 동물의="" dct를="" 제외하고="" dab1과="" 릴린의="" 공동="" 국소화는="" 거의="" 없었습니다(화살촉,="" 그림="">
NOTCH2 및 LC3B의 공간적 및 시간적 표현 패턴NOTCH{0}}양성 세포의 비율은 관찰된 모든 시점에서 두 동물 유전자형의 사구체에서 2{11}}% 미만이었습니다. P14에서만 양성 세포의 백분율이 야생형 동물보다 요타리 동물의 사구체에서 유의하게 더 높았습니다(p <0.05, 그림="" 3c).="" 염색="" 강도는="" 경미하거나="" 보통이었고(표="" 2),="" 대부분="" 핵="" 주위에="" 위치했습니다(그림="" 5a-f).="" 두="" 동물="" 유전자형의="" pct="" 및="" dct에서="" 양성="" 세포의="" 백분율은="" 시간이="" 지남에="" 따라="" 증가했습니다.="" p14에서="" 양성="" 세포의="" 백분율은="" 야생형="" 동물의="" pct="" 및="" dct보다="" yotari="" 동물의="" pct="" 및="" dct에서="" 유의하게="" 더="" 높았습니다(p="">< 0.05,="" 그림="" 3c).="" 관찰된="" 모든="" 시점에서="" 신호="" 강도는="" 경미하거나="" 보통이었고(표="" 2)="" 세포질="" 전체에="" 흩어져="" 있습니다(그림="" 5a-f).="" 그림="" 5.="" 산후="" 야생형="" 및="" 요타리의="" 면역형광="">신장NOTCH2 및 LC3B 마커 및 절단된 카스파제3(CASP3) 마커를 사용한 면역과산화효소 염색. (a-f) 핵 DNA DAPI 염색은 NOTCH2 및 LC3B와 병합됩니다. 관찰된 시점은 P4, P11, P14였습니다. 사구체(G), 근위 세뇨관(PCT) 및 원위 세뇨관(DCT)에서 NOTCH2 및 LC3B 마커의 발현은 화살표로 표시됩니다. 특히 강한 LC3B 반응성은 썩어가는 사구체(별표, e)의 Bowman 캡슐에서 관찰될 수 있습니다. 삽입물은 이미지에서 가장 두드러진 표현을 보여줍니다. CASP3는 관찰된 모든 시점에서 제대로 발현되지 않았습니다. 유일하게 유의미한 발현은 P14(화살표)의 요타리 생쥐의 사구체에 있었습니다. 스케일 바는 20 µm이며 모든 이미지를 나타냅니다. 14 3.4의 생체분자 2021, 11, 609 9. NOTCH2 및 LC3B의 공간적 및 시간적 발현 패턴 NOTCH{22}}양성 세포의 비율은 관찰된 모든 시점에서 두 동물 유전자형의 사구체에서 20% 미만이었습니다. P14에서만 양성 세포의 비율이 야생형 동물보다 요타리 동물의 사구체에서 유의하게 더 높았습니다(p < 0.05,="" 그림="" 3c).="" 염색="" 강도는="" 경미하거나="" 보통이었고(표="" 2),="" 대부분="" 핵="" 주위에="" 위치했습니다(그림="" 5a-f).="" 두="" 동물="" 유전자형의="" pct="" 및="" dct에서="" 양성="" 세포의="" 백분율은="" 시간이="" 지남에="" 따라="" 증가했습니다.="" p14에서="" 양성="" 세포의="" 비율은="" 야생형="" 동물의="" pct="" 및="" dct보다="" yotari="" 동물의="" pct="" 및="" dct에서="" 유의하게="" 더="" 높았습니다(p="">< 0.05,="" 그림="" 3c).="" 관찰된="" 모든="" 시점에서="" 신호="" 강도는="" 경미하거나="" 보통이었고(표="" 2)="" 세포질="" 전체에="" 흩어져="" 있습니다(그림="">
그림 5. 산후 야생형 및 요타리의 면역형광 염색신장NOTCH2 및 LC3B 마커 및 절단된 카스파제3(CASP3) 마커를 사용한 면역과산화효소 염색. (a-f) 핵 DNA DAPI 염색은 NOTCH2 및 LC3B와 병합됩니다. 관찰된 시점은 P4, P11, P14였습니다. 사구체(G), 근위 세뇨관(PCT) 및 원위 세뇨관(DCT)에서 NOTCH2 및 LC3B 마커의 발현은 화살표로 표시됩니다. 특히 강한 LC3B 반응성은 썩어가는 사구체(별표, e)의 Bowman 캡슐에서 관찰될 수 있습니다. 삽입물은 이미지에서 가장 두드러진 표현을 보여줍니다. CASP3는 관찰된 모든 시점에서 제대로 발현되지 않았습니다. 유일하게 유의미한 발현은 P14(화살표)에 있는 요타리 생쥐의 사구체에 있었습니다. 스케일 바는 20 µm이며 모든 이미지를 나타냅니다.
두 동물 유전자형의 사구체와 DCT에서 LC3B 양성 세포의 비율은 시간이 지남에 따라 증가했습니다(p < 0.05,="" 그림="" 3d).="" p11과="" p14에서="" 양성="" 세포의="" 비율은="" 야생형="" 동물의="" 사구체보다="" 요타리="" 동물의="" 사구체에서="" 유의하게="" 더="" 높았습니다(p="">< 0.05,="" 그림="" 3d).="" yotari="" 동물의="" 사구체에서="" 염색="" 강도는="" 관찰된="" 모든="" 시점에서="" 핵="" 주위="" 및="" 핵="" 공간(그림="" 5a-f)에="" 위치한="" 대부분="" 중등도에서="" 강함(표="" 2)인="" 반면,="" 야생형="" 마우스의="" 사구체에서는="" 강도가="" 대부분="" 보통(표="" 2).="" yotari="" 및="" 야생형="" 동물의="" pct는="" 관찰된="" 모든="" 시점에서="" 약="" 20%의="" 양성="" 세포를="" 포함했습니다(p="">< 0.05,="" 그림="">
절단된 CASP-3 표현식활성화된 CASP{0}}의 표현은 거의 없었습니다.신장관찰된 모든 시점에서 야생형 동물의 yotari 마우스의 PCT 및 DCT에서 여러 개별 세포가 CASP{1}}양성이었습니다(그림 3e). P14에서 요타리 신장의 사구체에서만(그림 5e), 양성 세포의 비율이신장야생형 마우스(p < 0.05, 그림 3e).
논의
신장형태 형성과 발달은 수많은 유전자의 상호 작용을 통해 정확하게 조정되는 복잡한 과정입니다. 선천적 기형신장요로(CAKUT)는 이러한 모든 결함의 23%를 구성하고 말기의 주요 원인을 나타내는 가장 흔한 선천적 결함입니다.신장 질환어린이 [28,29]. 단일 유전자 장애가 CAKUT의 주요 원인일 수 있으며, 지금까지 20개 이상의 유전자 돌연변이가 CAKUT의 원인으로 확인되었습니다[30]. 우리의 이전 작업은 정상적인 태아 인간 동안 DAB1의 큰 발현을 보여 주었기 때문에신장발달 [9], 우리는 DAB1이 포유류에서 중요한 역할을 할 수 있다고 가정했습니다.신장개발. 우리의 가설을 증명하기 위해 우리는신장Dab1 녹아웃 마우스에서 릴린, NOTCH2, LC3B 및 활성화된 CASP3 단백질의 형태 및 발현 패턴.
CISTANCHE는 신장/신장 통증을 개선합니다
요타리 마우스를 통한 단면화신장더 얇은 피질과 상당히 더 작은 평균을 나타냈다신장야생형 동물과 비교한 PCT, DCT 및 G 직경. 감소신장불충분한 네프론 기부로 인한 크기는 다음과 같이 알려져 있습니다.신장성인 발병 고혈압 및 만성 신장 질환을 일으키는 가장 흔한 CAKUT 장애 중 하나인 저형성증[31]. 또한, TEM으로 캡처한 현미경 사진에서 yotari 마우스는 발 돌기 소실 및 여과 슬릿 부족으로 현저한 족세포 손상을 나타냈다는 것이 밝혀졌습니다. 손상 후 족세포는 소실 과정을 거쳐 구조가 손실되어 여과 장벽 기능이 감소합니다[32]. 모든 형태의 신 증후군과 국소 분절 사구체 경화증(FSGS)은 족세포 구조 또는 기능의 결함이 특징입니다[33].
우리의 현재 연구는 DCT의 세포막의 정점 및 측면 부분에서 DAB1의 가장 높은 발현을 보인 반면, REELIN은 PCT의 세포질 전체에 대부분 흩어져 있습니다. 조사된 시점에서 요타리 생쥐의 세뇨관에서는 형태학적 변화가 관찰되지 않았지만 세뇨관 간질 구획에서 DAB1의 역할을 설명하기 위해서는 추가 조사가 필요합니다. 주로 DCT에서 DAB1 및 REELIN 단백질의 때때로 공동 국소화가 있었습니다. 이러한 발견은 태아 인간 동안 이 두 단백질의 발현에 관한 우리의 이전 연구를 따르는 것입니다.신장개발 [9]. 이것은 DAB1과 릴린이 인간과 마우스에서 유사한 역할을 한다는 것을 암시할 수 있습니다.신장Crk, MAPK 및 PI3K/Akt/mTOR 신호 전달 캐스케이드와 같은 일부 다운스트림 경로를 활성화하여 [34-36]. 우리의 데이터는 또한 yotari 생쥐의 사구체에서 증가된 릴린 발현을 보여주었습니다. 흥미롭게도, 이전 연구에서는 사구체에서 DAB1 인산화와 릴린 발현 증가가 Ang II 주입 쥐에서 고혈압, 단백뇨 및 족세포 손상을 동반한다는 것을 보여주었습니다[10].
또한, 면역형광 염색은 P14 요타리 생쥐의 사구체에서 NOTCH2 수용체의 증가된 발현을 나타내었다. NOTCH2 발현은 다음 조건을 제외하고는 일단 네프론 성숙이 달성되면 하향 조절된다는 것은 잘 알려져 있습니다.신장 손상,당뇨병성 신증 및 FSGS와 같은 [15,37]. Adriamycin에 의해 유발된 신증후군이 있는 쥐는 또한 섬유화증을 개선하는 활성화된 NOTCH2의 발현 증가를 보였습니다[38]. 조사된 시점에서 우리는 증가된 섬유화를 눈치채지 못했지만, 출생 후 요타리에서 발현된 NOTCH2의 정확한 역할을 해명하는 것이 남아 있습니다.신장.섬유화 변화가 후기 단계에서 발생하는지 여부에 대한 추가 관찰이 필요할 것입니다. 그러나 증가된 NOTCH2 활성화의 단기 효과가 당뇨병성 신증과 같은 장기 모델에서 손실되는 손상된 족세포에 대한 강력한 생존 이점과 관련되어 있음을 시사하는 일부 연구 결과가 이미 있습니다[39].
P11 및 P14 yotari 생쥐의 사구체에서 더 높은 LC3B 발현은 아마도 족세포에서 자가포식소체의 축적을 반영했을 것입니다. autophagy가 가속화되었음을 명확하게 보여줍니다. LC3-II와 LC{5}}I 단백질 발현의 비율을 분석할 필요가 있습니다. 정상적인 조건에서 autophagy는 정상 상태에 필요합니다.신장 기능[40], 특히 족세포에서. 세포 분열 및 대체 능력이 제한되어 있기 때문에 높은 기본 수준의 자가포식을 나타냅니다[41]. 이러한 발견에도 불구하고 LC3B 발현의 증가는 프로레닌 수용체 조건부 녹아웃 마우스에서 볼 수 있듯이 주로 발 돌기 소실 및 신 증후군 발달과 관련하여 여러 사구체 질환 [42-44]에서보고되었습니다 [45,46]. 이러한 모든 연구는 자가포식이 족세포 손상으로부터 보호하기 위해 활성화되는 Adriamycin으로 유도된 신병증[43]과 노화에 따른 사구체 질환이 지연되는 연령 의존적 사구체 질환의 발견에 의해 추가로 뒷받침되는 병리학적 상태에서 강화된 자가포식의 보호 역할을 제안합니다. 점진적인 기능 저하신장 기능[40]. 인간의 분석신장생검은 또한 특발성 신증후군의 가장 흔한 원인 중 하나인 최소 변화 신 증후군(MCNS)을 포함한 여러 사구체 질환에서 발 돌기 소실과 관련된 자가포식 증가의 증거를 보여주었습니다[19]. 당뇨병성 신증 및 지질다당류에 의한 급성의 상태에서신장 손상,PI3K/AKT/mTOR 경로의 억제를 통해 일부 치료제로 자가포식을 강화하면 신장 기능이 개선됩니다[47,48]. 이 모든 발견은 autophagy가 스트레스 적응에 필수적인 세포 보호 역할을 한다는 것을 암시합니다.신장 손상, 그리고 그것의 조절은 유망한 치료 전략일 수 있지만, 어떤 상황에서는 자가포식이 또한 해로울 수 있고 세포 사멸로 진행될 수 있습니다.
CISTANCHE는 신장/신부전을 개선할 것입니다
자가포식의 증가를 제외하고, P14 요타리 마우스의 사구체에서도 증가된 세포자멸사 수준이 관찰될 수 있었습니다. Autophagy는 일반적으로 apoptosis를 방지하지만 특정 병리학 적 상황에서는 apoptosis를 강화하고 촉진하여 세포 생존에 반대 효과를 줄 수도 있습니다 [42]. 출생 후 세포의 세포자멸사신장의 조건을 제외하고는 크게 감소합니다.신장 손상,질병 발병에 기여하는 특발성 신증후군과 같은 [23]. 상염색체 열성 선천성 기형의 잠재적인 새로운 원인신장및 요로. 그러나 DAB1의 주요 역할은신장개발은 여전히 불분명합니다. 또한, 이 마우스는 발 과정 이상과 사구체에서 릴린, NOTCH2, LC3B 및 절단된 CASP3 단백질의 증가된 수준을 나타내어 저형성증과 관련하여 잠재적인 사망 원인이 될 수 있는 신증후군과 같은 사구체 손상을 유발할 수 있습니다 이유 기간 동안 이 동물들의 이 가설을 확인하려면 혈청 크레아티닌, 알부민 및 단백질 수준과 같은 혈압 및 기타 임상 실험실 매개변수에 관한 추가 정보를 제공해야 합니다.