상염색체 열성 가성저알도스테론증 제2형의 원인인 새로운 동형접합성 KLHL3 돌연변이가 노년기에 진단됨
Nov 02, 2023
개요 소개:
가성저알도스테론증 II형(PHA II)은 고칼륨산증과 낮은 혈장 레닌 수치를 특징으로 하는 멘델 장애로, 일반적으로 고혈압과 관련이 있습니다. WNK1, WNK4, CUL3 및 KLHL3의 돌연변이는 PHA II를 유발하며, WNK1, WNK4 및 CUL3에는 우성 돌연변이가 있고 KLHL3에는 우성 또는 열성 돌연변이가 있습니다. 열성 KLHL3 돌연변이가 있는 14개 가족이 보고되었으며, 일반적으로 정상적인 신장 기능을 가진 개체에서 3개월~56세 사이에 진단되었습니다.
방법: 우리는 고칼륨혈증 환자를 대상으로 임상 및 유전적 조사를 수행하고 분자 역학 시뮬레이션, COS7 세포의 이종 발현 및 웨스턴 블롯을 사용하여 KLHL3 후보 질병 돌연변이가 WNK4 단백질 발현에 미치는 영향을 조사했습니다.
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결과: 환자는 혈연가족의 58-세 여성으로 고혈압, 심한 근육통과 관련된 지속적인 고칼륨산증, 신장결석증, 만성신장질환(CKD), 관상동맥심장질환을 보였습니다. 히드로클로로티아지드 치료로 고칼륨혈증, 고혈압, 근육통이 교정되었습니다. 유전자 분석 결과 고도로 보존된 KLHL3 위치에서 동형접합성 p.Arg431Trp 돌연변이가 밝혀졌습니다. 시뮬레이션에서는 돌연변이 단백질의 안정성이 감소한 것으로 나타났으며 이는 웨스턴 블롯으로 확인되었습니다. 야생형 KLHL3과 비교하여, p.Arg- 431Trp KLHL3의 공동형질감염은 WNK4 단백질 수준을 증가시켰으며, 이는 티아지드에 민감한 담체 및 PHA II를 통해 NaCl 재흡수를 증가시키는 것으로 추론됩니다.
결론: 노년기에 CKD가 있는 환자라도 레닌 수치가 낮고 고칼륨산증 및 고혈압이 CKD 단계에 적합하지 않은 경우, 특히 의심스러운 가족력이 있는 경우 PHA II를 의심해야 합니다.
소개
전신 동맥 고혈압은 전 세계적으로 11억 명 이상의 성인에게 영향을 미치며[1] 전 세계적으로 모든 원인의 질병률 및 사망률에 대한 가장 중요한 수정 가능한 위험 요소로 간주됩니다[2]. 성인 환자의 약 90%는 다인성 유전자 환경 병인을 지닌 소위 원발성 또는 본태성 고혈압을 앓고 있는 반면[2], 나머지에서는 고혈압의 근본 원인을 확인할 수 있습니다. 이차성 고혈압의 일반적인 원인은 원발성 알도스테론증, 폐쇄성 수면 무호흡증, 실질 신장 질환, 신동맥 협착증입니다[3]. 드문 경우지만 고혈압은 단일 유전자 형질로 유전됩니다. 영향을 받은 환자는 일반적으로 혈장 레닌 수치가 낮지만 알도스테론과 전해질 수치는 근본적인 병인에 따라 다릅니다[4]. 멘델의 고혈압 형태는 종종 유년기나 청소년기에 나타납니다. 단일 유전자 고혈압에 대한 성인의 조사는 거의 이루어지지 않습니다. 따라서 일반 인구에서의 유병률은 아직 알려지지 않았습니다. 선택된 코호트(적어도 하나의 포함 기준: 발병 연령 35세 이하, 저항성 고혈압, 전해질 이상을 동반한 고혈압, 호르몬 이상, 비정상적인 영상 결과 또는 암시적인 임상 징후 중 하나)에서 37개의 후보 유전자를 스크리닝했습니다. 병원성 또는 병원성 가능성이 있는 변이체는 1,179건 중 33건(2.8%)에서 확인되었습니다[5].
이 연구는 고칼륨산증과 낮은 혈장 레닌 수치를 특징으로 하는 멘델 고혈압의 한 형태인 가성저알도스테론증 유형 II(PHA II)에 중점을 둡니다[6]. PHA II는 가족성 고칼륨성 고혈압으로도 알려져 있습니다. 이는 정상적인 신장 기능에도 불구하고 심한 고혈압과 고칼륨혈증이 있는 젊은 남성에게서 1964년 Paver와 Pauline에 의해 처음 기술되었으며[7] Stokes와 동료[8], Arnold와 Healy[9]에 의해 추가로 특성화되었으며 낮은 것으로 나타났습니다. 혈장 레닌. Gordon 등은 1970년에 저신장, 고혈압, 심각한 고칼륨혈증, 경미한 산혈증, 주기성 마비 및 레닌 억제가 있는 10-세 소녀에 대한 보고를 따릅니다. [10], 이 증후군은 때때로 고든 증후군(Gordon's Syndrome)이라고도 불립니다.
2001년에 WNK(with-no-lysine) 세린-트레오닌 키나제 유전자 WNK1 및 WNK4의 돌연변이가 PHA II의 원인으로 확인되었으며[11], KLHL3(켈치 유사 3을 암호화함) 및 CUL3(켈치 유사 3을 암호화함)의 추가 돌연변이가 확인되었습니다. cullin 3) 유전자는 2012년에 기술되었다[12, 13]. WNK1, WNK4 및 CUL3의 돌연변이로 인해 발생하는 PHA II 하위형은 상염색체 우성 질환인 반면, KLHL3 돌연변이는 상염색체 우성 또는 상염색체 열성 방식으로 유전될 수 있습니다[12]. KLHL3은 N 말단 BTB 도메인, BACK 도메인 및 소위 켈치 유사 반복으로 구성된 C 말단 6개의 블레이드 프로펠러 구조를 특징으로 합니다(그림 1d, 2a 참조). 우성 KLHL3 돌연변이는 프로펠러 블레이드 내부 또는 사이에 모여 있는 반면, 열성 돌연변이는 단백질 전체에 분포합니다[12]. 열성 사례는 지배적 사례보다 덜 일반적입니다. 열성 KLHL3 돌연변이가 있는 14개 가족 중 총 21명의 환자가 발표되었습니다[12-15](표 1).
PHA II에서 고혈압의 근본적인 병태생리학은 신장의 원위 세뇨관에서 티아지드에 민감한 운반체(Na-Cl 공동수송체, NCCT)를 통한 NaCl 재흡수 증가이며, 티아지드 치료는 PHA II 환자의 고혈압과 전해질 이상을 모두 교정합니다. [16]. 즉, WNK1과 WNK4는 OSR1(산화 스트레스 반응 유전자 1)과 SPAK(Ste20-관련 프롤린-알라닌 풍부 키나제)를 인산화한 다음 NCCT를 인산화하고 활성화시킵니다[17, 18]. KLHL3은 유비퀴틴 리가제 CUL3의 기질 어댑터입니다. KLHL3-CUL3 복합체는 WNK 키나제를 유비퀴틴화하여 분해를 촉진합니다[19]. 유비퀴틴 리가제 기능의 상실 또는 WNK 키나제에 대한 결합 장애는 WNK 풍부도를 증가시키고 NCCT 인산화를 증가시키며[18] 원위 세뇨관에서 NaCl 흡수를 증가시킵니다. 네프론의 후기 부분에서는 ENaC(상피 나트륨 채널)를 통한 NaCl 재흡수와 ROMK(신장 외부 수질 칼륨 채널)를 통한 K+ 분비가 감소됩니다[20, 21]. KLHL3 녹아웃 마우스는 원위 세뇨관의 형성 저하, WNK1 및 WNK4의 수준 증가, 신장의 OSR1, SPAK 및 NCC 인산화 증가를 나타냅니다. 또한 고칼륨혈증, 고염소혈증 및 대사성 산증을 나타냅니다[22]. 여기에서는 상염색체 열성 PHA II 환자를 보고하고 근본적인 유전적 돌연변이와 병태생리학을 특성화합니다.
재료 및 방법
DNA 준비 및 Sanger 시퀀싱 DNA는 제조업체의 지침에 따라 QIAamp DNA Blood Maxi Kit(Qiagen)를 사용하여 말초 정맥혈 샘플로부터 준비되었습니다. KLHL3[13], WNK1, WNK4[11] 및 CUL{5}}F(5'-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3')에 대해 공개된 프라이머를 사용하여 게놈 DNA의 표준 PCR 및 직접 양방향 Sanger 시퀀싱을 수행했습니다. 및 CUL3에 대한 CUL{9}}R(5'-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3') 프라이머. Sanger 시퀀싱은 Eurofins Genomics에서 수행되었습니다.
서열 정렬
상동 단백질 서열은 NCBI Protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 및 eggNOG 데이터베이스(http://eggnogdb.embl.de)를 사용하여 식별되었습니다. 표시된 서열에는 인간 KLHL3 및 그 오솔로그인 Homo sapiens(NP_059111.2), Mus musculus(NP_001349344.2), Gallus gallus(XP_015149442.1), Danio rerio가 포함됩니다. (XP_021328460.1), Ciona enteris (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) 및 Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . 인간 파라로그는 문헌 연구에 의해 확인되었으며 온라인 보충 표 1에 표시된 대로 KLHL1 ~ KLHL42를 포함합니다(모든 온라인 공급 자료는 www.karger.com/doi/10.1159/000521626 참조)[23]. 서열은 Jalview 버전 2.10.5[24]를 사용하여 정렬되었습니다. 도메인 구조는 UniProt(Q9UH77, 2021년 4월 13일 액세스)에서 왔으며 DOG[25]를 사용하여 시각화되었습니다.
플라스미드 및 부위 지정 돌연변이 유발
pTRE2hyg WNK4 및 pFN21A KLHL3 플라스미드는 우치다 신이치 박사(도쿄 의과 치과 대학)의 친절한 선물이었습니다. p.R431W 돌연변이를 도입하기 위해 Primer X(https://www.bioinformatics.org/primerx)를 사용하여 프라이머를 설계했습니다. 5'- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGGG -3' (KLHL3_ R431W{{10} }F) 및 5'- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3' (KLHL3_R431W_1R). 돌연변이 잔기는 굵은 글씨로 표시됩니다. 제조업체의 지침에 따라 PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)가 포함된 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit를 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발을 수행했습니다. cDNA는 Eurofins Genomics에서 Sanger 서열분석되었습니다. 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit를 사용하여 준비되었습니다.
조직 배양, 일시적 형질감염 및 웨스턴 블롯
COS7 세포를 DMEM + L-글루타민, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(모두 Gibco, Thermo Fisher)에서 배양했습니다. 형질감염을 위해 세포를 1.9 × 105개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩하고 약 90% 밀도로 성장시켰습니다. 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 세포를 1μg pTRE2hyg WNK4 및 2μg pFN21A(빈 벡터 또는 KLHL3 야생형[WT]) 또는 KLHL3 R431W cDNA로 형질감염시켰습니다. 형질감염을 위해 각각 2개의 독립적인 클론을 사용했습니다. 형질감염 48시간 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 완전 프로테아제 억제제 칵테일(Roche, Merck)을 함유한 1% NP40에 용해시켰습니다. 용해물을 20000g에서 30분 동안 4도에서 원심분리하고 상층액을 -20도에 보관했습니다. 단백질 농도는 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석(Pierce, Thermo Fisher)에 의해 이중(표준) 또는 삼중(샘플)으로 결정되었습니다. 약 20μg의 총 단백질을 SDSPAGE로 분별하고 PVDF 막으로 옮겼습니다(1.5시간, 100V). 막은 TBST의 2% 분유에서 차단되었습니다. 웨스턴 블롯은 다클론 토끼 항-HaloTag(Promega #G9281, 1:500, 4도 밤새)를 사용하여 수행한 후 세척하고 당나귀 IgG 항-토끼 IgG(H+L)-HRPO(Jackson ImmunoResearch #{{46)로 배양했습니다. }}, dianova, 1:20,000, 실온에서 1시간), 세척 및 강화된 화학발광 검출(Amersham ECL Prime Western Blotting 검출 시약, GE Healthcare). ROTIFree Stripping Buffer 2.0(Carl Roth)을 사용하여 블롯을 제거하고 TBST에 포함된 2% 분유에서 밤새 4도에서 차단한 다음 단일클론 마우스 항-FLAG M2(SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69} }, 실온에서 1.5시간), 이어서 당나귀 IgG 항-마우스 IgG(H + L)-HRPO(Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 실온에서 1시간 온도), ECL 감지, 스트리핑 및 차단은 위와 같습니다. 그런 다음 블롯을 단클론 마우스 항{71}}액틴(Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5,000, 실온에서 1시간) 및 당나귀 IgG 항-마우스 IgG와 함께 배양한 후 다시 ECL 검출을 수행했습니다. 밴드는 ChemiDoc XRS+(Bio-Rad)의 Image Lab 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다. 항-HaloTag 항체 및 항-FLAG M2 항체에 의해 각각 검출된 밴드의 강도를 항- - 액틴 항체에 의해 검출된 밴드의 상응하는 강도로 나누었다. KLHL3의 발현 수준을 평가하기 위해, 세포는 위와 같이 0μg, 0.5μg, 1μg, 2μg, 4μg 및 8μg의 pFN21A KLHL3 WT 또는 R431W를 사용하여 형질감염되었습니다. 위와 같이 겔 전기영동과 블로팅을 수행하였다. 사이클로헥시미드 추적 분석의 경우, 세포를 위와 같이 시딩하고 위와 같이 2μg pFN21A KLHL3 WT 또는 4μg KLHL3 R431W로 형질감염시켰습니다. 형질감염 48시간 후, 100 μM 시클로헥시미드를 첨가하고, 표시된 시점 후에 세포를 용해시켰습니다. 추가 분석 단계는 위와 같습니다.
그림 2. WT 및 p.Arg431Trp(R431W) KLHL3 Kelch 도메인의 MD 시뮬레이션. 프로펠러 블레이드(K1–K6)로 색상이 지정된 Kelch 도메인(PDBID: 4CH9)의 하향식 보기. 돌연변이 부위는 노란색 별표로 표시되고 관심 영역은 회색(잔류물 425-465)으로 표시되며 WNK4 펩타이드(시뮬레이션에 포함되지 않음)는 투명하고 회색으로 표시됩니다. b 단백질 백본에 매핑된 Kelch 도메인의 MSF 차이. 돌연변이 부위는 노란색 별표로 표시됩니다. 빨간색은 단백질의 더 역동적인(덜 안정적인) 부분을 나타냅니다. c 3개의 독립적인 시뮬레이션 복제본(굵은 선, 실행 평균)에 대한 결정 구조의 전체 단백질(상단), 잔기 425-465(중간) 및 WNK4- 결합 포켓(하단)의 RMSD. d K3(잔류물 425-441)과 K4(442-465) 사이의 h본드(왼쪽)와 COM 거리(가운데)의 바이올린 플롯 - 프로펠러 블레이드와 바인딩 포켓 정전기(오른쪽). e 실험/초기 모델(검은색)을 사용하여 각 복제본(WT, 파란색, R431W, 회색)의 최종 프레임(1.1μs)에서 K3-K4 인터페이스의 구조적 오버레이. 단백질 백본은 만화로 표시되고 잔기 431은 막대기로 표시됩니다. MSF, 평균 제곱 변동.
분자 역학 시뮬레이션
WT 모델은 WNK4 펩타이드 단편과 복합체를 이루는 인간 Kelch 도메인의 X선 결정 구조(PDBID: 4CH9)를 기반으로 했습니다[26]. 누락된 원자와 말단 캡은 시각적 분자 역학 버전 1.9.3[27]의 psfgen 유틸리티를 사용하여 추가되었습니다. 돌연변이(R431W) KLHL3 모델은 Modeller 버전 9.18을 사용하여 생성되었습니다[28]. 각 시스템의 최종 잔류 범위는 300–585였습니다. WT 및 R431W 모델의 N- 및 C-말단은 각각 아세틸화 및 N-메틸아미드화에 의해 중화되었습니다. PROPKA 버전 3.0을 사용한 분석에 따라 각 적정 잔류물에 기본 양성자화 상태가 할당되었습니다[29]. WNK4 펩타이드는 초기 평형 시뮬레이션 후 KLHL3으로부터의 해리로 인해 생산 시뮬레이션에서 제거되었습니다.
모든 시뮬레이션은 GROMACS 소프트웨어 패키지 버전 2021 [30]을 사용하여 수행되었습니다. CHARMM36m 역장 매개변수는 단백질 원자에 사용되었습니다[31]. 이온은 기본 CHARMM 매개변수를 사용하여 설명되었으며 물에는 TIP3P 모델이 사용되었습니다[32]. 초기 평형 단계에는 1fs의 통합 시간 단계가 사용되었으며 모든 후속 시뮬레이션에는 2fs가 사용되었습니다. 수소와 관련된 모든 결합은 LINCS를 사용하여 제한되었습니다[33]. 비결합 반 데르 발스 상호작용은 컷오프 반경이 1.2nm인 Lennard-Jones 전위를 사용하여 계산되었습니다. 힘은 1.2-1.0 nm 범위에서 원활하게 꺼졌습니다. 모든 정전기는 1.2 nm의 실제 공간 차단 거리를 갖는 평활화된 입자-메시 Ewald [34] 방법을 사용하여 계산되었습니다. 등온 등온 앙상블(NVT)의 초기 시뮬레이션에 이어 모든 후속 시뮬레이션은 속도 재조정 온도 조절기[35]를 사용하여 0.5 ps의 시간 상수를 사용하여 310.15 K의 온도에서 등압 등온 앙상블(NPT)에서 수행되었습니다. 온도 조절 장치는 단백질과 용매(즉, 물과 이온)에 별도로 적용되었습니다. 동일한 그룹이 질량 중심(COM) 동작 제거에 사용되었습니다. Berendsen [36] 또는 Parrinello-Rahman [37] 기압장치를 사용하여 5 ps의 시간 상수를 갖는 등방성 방식으로 1 bar의 압력을 가했습니다.
WT 및 R431W 모델은 초기 치수가 1.2 x 1.2 x 1.2 nm3인 입방형 상자에서 용매화되었습니다. 각 시스템은 150 mM NaCl로 중화되었습니다. 초기 급강하 에너지 최소화 후 각 시스템은 모든 단백질 원자에 대한 위치 제한을 사용하여 5ns 동안 NVT 앙상블에서 평형을 이루었습니다. 후속 평형 단계는 이전 단계와 동일한 제한 사항을 사용하여 5ns 동안 NPT 앙상블에서 수행되었습니다. 최종 5-ns 평형 시뮬레이션을 위해 모든 측쇄에서 위치 제한이 제거되었습니다. 모든 위치 제한이 제거된 WT 및 R431W 시스템의 독립적인 생산 시뮬레이션을 위해 최종 평형 단계에서 세 가지 초기 구조가 생성되었습니다. 각 생산 반복은 1.1μs 동안 시뮬레이션되었습니다. 처음 0.1 µs는 분석에서 제거되었습니다.
시뮬레이션 과정에서 구조적 안정성을 평가하기 위해 전체 단백질의 C 원자와 K3-K4 경계면(잔기 425-465) 및 결정 구조의 RMSD(평균 제곱근 편차)를 계산했습니다. WNK4- 바인딩 포켓(잔류물 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 및 577). RMSD 추적의 실행 평균이 계산되어 원시 데이터와 중첩되었습니다.
구조적 안정성에 대한 돌연변이의 효과는 단백질 C 원자의 평균 제곱 변동의 차이를 계산하고 프레임과 복제본에 대해 평균을 계산하고 WT 단백질 구조에 매핑함으로써 시각화되었습니다. 모든 단백질 시각화는 ChimeraX [38]를 사용하여 생성되었습니다. K3(잔기 425-441)에서 K4(잔기 442-465) 인터페이스에 대한 R431W 돌연변이의 효과는 수소 결합(H-결합) 분석과 두 그룹 간의 COM 거리를 특징으로 합니다. GROMACS 도구 gmx hbond를 사용하여 각 프레임에서 거리 및 각도 컷오프가 각각 3.5Å 및 30도인 H-결합을 평가했습니다. COM 거리는 각 프레임에서 유사하게 평가되었습니다. Hbonds와 COM 거리의 분포는 바이올린 플롯으로 시각화되었습니다. 평균은 궤적과 복제본에 대해 계산되었습니다.
WNK4-바인딩 포켓의 정전기는 g_elpot[39]을 사용하여 계산되었습니다. 바인딩 포켓에서 정전기 전위의 시간 경과는 바인딩 포켓을 구성하는 잔류물의 기하학적 중심을 중심으로 반경 8Å의 구형 부피를 정의하여 평가되었습니다. 정전기의 변화를 평가하기 위해 50-ns 블록 평균을 계산했습니다. WT 및 R431W 돌연변이에 대한 결합 포켓 내의 정전기 전위 분포는 바이올린 플롯으로 시각화되었으며 평균은 50-ns 블록 및 궤적에 대해 계산되었습니다.
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