루푸스 신염 환자의 신장에서 T 세포에 풍부하고 인접한 새로운 염증성 수지상 세포
Feb 24, 2022
루푸스 신염(LN) 발적 동안 국소 염증성 손상을 촉진하는 메커니즘은 크게 알려져 있지 않습니다. 신내 염증을 유발하는 주요 면역 세포를 이해하면 질병 발병기전에 대한 지식을 발전시키고 림프절 관리를 위한 새로운 치료법의 개발을 알릴 것입니다. 이 연구에서 우리는 분석신장 증식성 림프절 환자의 생검을 통해 림프절에서 고도로 발현되는 새로운 염증성 수지상 세포(infDC) 집단을 확인했습니다.신장, 그러나 건강한 인간에게는 최소한으로 존재신장.면역 전사체 발현의 불가지론적 평가 동안신장증식성 림프절 환자의 경우, 분리된 사구체에서 가장 풍부하게 과발현된 전사체는 Fc 수용체 감마 사슬(FcR)을 인코딩하는 FCER1G였습니다. 에 침윤하는 FcR을 발현하는 세포 유형을 확인하기 위해신장LN에서 연구를 수행했습니다.신장공초점 면역형광(IF) 현미경을 사용한 활성 LN 환자의 생검. 이것은 FcR이 사구체 주위(PG) 영역에 풍부하게 존재함을 보여주었다.신장그리고 세뇨관간질(TI)에서 더 적은 정도로. 이들 세포의 표면 마커에 대한 추가 조사는 이들이 FcR 플러스, MHC II 플러스, CD11c 플러스, CD163 플러스, CD5, DC-SIGN 플러스, CD64 플러스, CD14 플러스, CD16 플러스, SIRP 플러스, CD206, CD68, CD123임을 보여주었다. , CD3 및 CD11bV는 세포가 infDC임을 시사합니다. infDC의 정량화는 LN에서 평균 10-배 더 높은 수준의 infDC를 보여주었습니다.신장건강한 것에 비해신장. 중요하게도, IF는 LN의 PG 공간에서 이러한 infDC에 인접한 CD3 플러스 T 세포를 식별했습니다.신장,두 세포 유형 모두 건강한 신체에는 최소한으로 존재합니다.신장.따라서 우리는 루푸스에서 이전에 설명되지 않은 DC를 식별했습니다.신장이는 신장내 T 세포와 상호작용할 수 있고 의 발병기전에 역할을 할 수 있다.신장 손상LN 플레어 동안.
키워드:염증성 수지상 세포, 루푸스 신염, 신장, 자가면역, 적응 면역 반응, T 세포, SLE
소개
루푸스 신염(LN)은 상당한 이환율 및 사망률과 관련된 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 심각한 합병증입니다. LN 환자의 최대 30%가 말기 진행신장병(ESKD) (1). LN을 치료하기 위해 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 특정 치료법이 없으며 현재 치료법은 상당한 세포독성으로 차선의 반응률을 생성합니다(2). 우리와 다른 연구자들은 분자 병리학을 탐구해 왔습니다.신장활성 LN 동안 병인을 더 잘 이해하기 위해신장 손상LN 및 LN을 치료하기 위해 구체적으로 표적화될 수 있는 경로.
CISTANCHE는 신장/신장 기능을 향상시킵니다.
레이저 미세 해부에서 전사체 발현의 불가지론적 평가 과정에서신장임상 LN 생검의 조직에서 우리는 사구체 구획에서 가장 풍부하게 과발현된 전사체가 Fc 수용체 감마 사슬(FcR)을 인코딩하는 FCER1G라는 것을 발견했습니다. 이 전사체는 면역 세포에 침투하는 것을 반영하는 것으로 추정되었습니다.신장활성 LN 동안, 이 작업은 과발현된 FcR이 나타내는 세포 유형을 식별하기 위해 수행되었습니다. 따라서 이 연구에서는 전사체 발견을 사용하여 공초점 면역형광(IF) 연구를 안내하여 세포에 존재하는 주요 침윤성 면역 세포를 특성화했습니다.신장LN 플레어 동안. 우리는 사구체 주위(PG) 공간에 있고 infDC와 T 세포 집단 사이의 잠재적인 누화를 나타내는 CD3 플러스 T 세포에 인접한 FcR을 발현하는 염증성 수지상 세포(infDC)의 고유한 집단을 확인했습니다.
재료 및 방법
실험적 설계이 작업의 목적은 전사 분석 및 IF를 수행하는 것이었습니다.신장LN 플레어에서 생검을 수행하여 체내에 존재하는 주요 침윤성 면역 세포를 식별합니다.신장LN 플레어 당시. 전사 분석은 다음에서 수행되었습니다.신장2007년과 2013년 사이에 증식성(Class III/IV ± V) LN을 가진 58명의 환자로부터 LN flare에서 얻은 생검. 보관 생검은 임상 테스트가 완료된 후 사용되었습니다. 레이저 포획 미세 해부(LCM)를 수행하고 사구체와 세뇨관 간질(TI)을 별도로 분리했습니다. 착상 전 살아있는 기증자신장생검(n=10)은 건강한 대조군(HC)으로 사용되었으며 LN 생검과 병행하여 분석되었습니다. 동일한 신장 전문의(AM)가 모든 환자를 치료했으며 한 명의 숙련된 신장 병리학자(VA)는 다음과 같이 말했습니다.신장생검. 병원 Fernandez(부에노스 아이레스) 윤리 위원회와 오하이오 주립 대학 기관 검토 위원회는 조사를 승인했습니다.신장생검.
RNA 추출 및 분석
전사체 분석에 사용된 생검은 포르말린 및 파라핀 포매(FFPE)에 고정되었습니다. 파라핀 블록에서 각 생검에서 10μm 섹션이 절단되었습니다. 탈파라핀화 후, 이용 가능한 모든 사구체 및 TI를 레이저 미세해부(PALM MicroBeam, Zeiss Labs, Bernried, Germany)로 분리하고, 포획하고, 프로테이나제 K로 소화시켰다. DNA를 DNase로 제거하였다. RNA를 침전시키고 RNeasy MinElute 스핀 컬럼(Qiagen, Redwood City, CA, USA)으로 추출하고 RNase가 없는 물에서 용리했습니다. NanoString nCounter 플랫폼 및 GX 인간 면역학 전사 패널[NanoString Technologies, Seattle, WA, USA; (3-5)]. 인간 면역학 패널 v2는 579개의 면역 반응 유전자, 6개의 양성 대조군 유전자 및 6개의 음성 대조군 유전자로 구성되었다. 이 유전자의 전체 목록은 우리 그룹의 이전 간행물에서 찾을 수 있습니다(6). 공초점 IF 현미경의 경우 동결신장활성 클래스 IV LN을 가진 4명의 환자의 생검 조직은 Ohio State Nephropathology Biorepository에서 얻었습니다. 3개의 동결된 신장 절제 샘플을 HC로 사용했습니다. 신장 절제술은 다음과 같은 환자에서 수행되었습니다.신장세포 암종. 분석을 위해 얻은 조직을 암 조직에서 분리했습니다. 분석에 사용된 주변 조직은 조직학적 분석에서 건강한 것으로 나타났습니다. 냉동 샘플이 필요하고 생체 저장소에 냉동 이식 기증자 조직이 저장되어 있지 않았기 때문에 신장 절제술을 대조군으로 사용했습니다.
항체
IF에 사용된 1차 항체(Abs)는 모두 보충 표 1에 나열되어 있습니다. 이 연구에 사용된 항체는 인간 림프절을 사용하거나 인간 간을 양성 대조군으로 사용하여 IF에 대해 검증되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 사용된 이소타입 대조군은 ChromoPure 정상 토끼 IgG, 정상 마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), 마우스 IgG1κ(BioLegend, San Diego, CA, USA) 및 마우스 IgG2bκ(Jackson ImmunoResearch)입니다. IF에 사용된 이차 항체는 Invitrogen(Thermo Fisher)의 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG 488(Jackson ImmunoResearch) 및 염소 항-토끼 IgG 568, 염소 항-토끼 IgG 488 및 염소 항-토끼 IgG 647이었습니다. 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬).
CISTANCHE는 신장/신장 질환을 개선할 것입니다
면역형광냉동 신 절제술 및 LN신장생검을 절편(슬라이드당 5μm 절편)하고 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드인산완충식염수(PBS)에 고정하고 PBS(0.02% 아지드화나트륨 포함)로 세척했습니다. 절편을 PBS 중 5% 우유로 차단한 다음 1차 Ab와 밤새 인큐베이션했습니다. PBS로 1시간 동안 세 번 세척한 후, 섹션을 형광 태그가 지정된 이차 Ab와 함께 실온에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하고, 핵을 10분 동안 DAPI(100ng/ml)로 염색했습니다. 그런 다음 섹션을 커버슬립 아래에 Prolong Gold(Invitrogen)로 장착했습니다. 대조 Ab는 각각의 이차 Ab와 함께 이소타입 Ab의 목록을 나타냅니다. 이미지는 실온에서 x60 오일 침지 렌즈와 함께 형광색소(FV1000 스펙트럼)를 보다 정밀하게 분리하기 위한 스펙트럼 검출 시스템이 장착된 Olympus FluoView 1000 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Olympus Corp., Tokyo, Japan)을 사용하여 얻었습니다.
정량 현미경LN 및 HC에서 infDC의 발현 수준신장항 CD163을 사용하여 infDC에 대해 염색된 이미지로부터 정량화되었습니다. infDC 발현에 기반한 CD163의 총 강도는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 계산되었습니다. CD163 강도는 이소형과 2차 Ab-염색 이미지에서 배경 형광을 뺀 후 앞서 설명한 CD163 항체를 사용하여 infDC에서 나오는 녹색 픽셀의 면적과 평균 형광 강도를 측정하여 얻었습니다(7).
통계 분석전사체 분석의 경우 기술 통계는 평균 ± 표준 편차 또는 백분율로 표시됩니다. 임상 변수에 대해서는 t-검정, ANOVA 또는 Wilcoxon 순위 합 검정을 적절하게 적용했습니다. 범주형 임상변수는 Fisher's exact test를 사용하였다. 나노스트링 데이터의 경우 원시 카운트를 양성 스파이크-인 대조군으로 정규화한 다음 log2를 변환했습니다. 기술적 편향을 줄이기 위해 평균 이하의 발현 수준에 음성 대조군의 2개의 표준 편차를 더한 유전자를 여과 제거했습니다. 분위수 정규화는 나머지 전사체에 적용되었습니다(사구체의 경우 522개, TI의 경우 502개). 사구체 샘플은 TI 샘플과 별도로 분석되었습니다. LN에서 차등 발현, 사구체 및 TI 전사체 발현을 결정하기 위해신장대조군과 비교하였다. A 1.5-배수 변경 및 p < 0.05는="" 스크립트가="" 차등적으로="" 표현된="" 것으로="" 간주되는="" 데="" 필요했습니다.="" 공초점="" 현미경의="" 통계적="" 분석을="" 위해="" 양측="" 스튜던트="" t-검정을="" 두="" 그룹="" 비교에="" 사용했으며="" p="">< 0.05가="" 유의한="" 것으로="" 간주되었습니다.="" 모든="" 분석은="" origin="" pro="" 버전="" 2020(originlab="" corp.,="" northampton,="" ma,="" usa)을="" 사용하여="">
결과
LN 플레어에서 신장 생검의 전사체 분석은 LN 플레어에서 사구체 및 TI에서 FCER1G의 상당한 과발현을 나타냅니다우리는 사구체와 TI에서 분리된 RNA에 대해 LCM을 사용하여 전사체 분석을 수행했습니다.신장증식성 림프절 발적(n=58)에서 얻은 생검. 착상 전 살아있는 기증자신장 이식생검을 HC로 사용했습니다(n {0}}). 579개의 면역 전사체에 대한 전사체 분석은 FCER1G가 가장 현저하게 과발현된 사구체 전사체임을 보여주었지만[폴드 변화(FC): 3.6, p-값(p): 1E-10] TI(FC: 1.7, p=0.001) HC와 비교한 LN 플레어(그림 1 및 보충 표 2). 또한, FCER1G 발현은 NIH 조직학적 질병 활성 지수(r=−0.43, p=0.01)와 상관관계가 있었습니다.
신장 FcR은 LN 플레어에서 높게 발현되고 사구체 주변 영역에 국한됩니다FCER1G를 발현하는 면역 세포를 특성화하기 위해, 본 발명자들은 FCER1G 코딩 단백질인 Fc 수용체 감마 사슬[FcR ; (8)] 인간 LN 및 HC에서신장특정 항체를 사용하여 IF 현미경 분석에 의해 조직. IF 분석은 FcR이 사구체(족세포 마커, 시냅토포딘으로 확인됨)에서 최소한으로 발현되지만 LN 플레어 생검의 PG 및 TI 영역에서 풍부하게 발현된다는 것을 보여주었습니다. FcR을 발현하는 세포는 현미경으로 볼 때 PG 영역에서 세포 침윤의 전형적인 외관을 갖는 것으로 보였다(도 2). IF 분석은 LN 플레어 동안 세포 침윤의 존재로 인해 PG 영역이 확장되는 반면 그림 2의 병합된 이미지에서 볼 수 있듯이 HC에서 PG 영역은 얇고 세포 침윤이 없음을 보여주었습니다.
및 보충 그림 4. 가장 중요하게, 우리는 동시에 처리된 이소타입 항체 대조군을 사용하여 LN 및 HC에서 FcR의 약한 발현을 보았습니다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 데이터는 FCER1G가 FcR을 코딩하고 증식성 LN 플레어에서 풍부하게 과발현된다는 전사체 발견을 뒷받침합니다.
대식세포 마커 CD11b 및 CD68은 인간 LN 신장에서 FcR과 함께 국소화되지 않았습니다
LN(9-11)의 간질 백혈구에 대한 이전 설명을 기반으로 FcR 발현 세포가 대식세포일 것으로 예측했습니다. 우리는 대식세포 마커 CD68, CD206 및 CD11b에 대한 항-FcR 항체 FcR 항체로 생검 섹션을 이중으로 염색했습니다. 뜻밖에도 M{6}}특정 대식세포 마커, CD11b 및 CD206에 대한 염색[(12); 데이터는 표시되지 않음], LN에서 약한 발현을 보임신장.한편, 범대식세포 마커 CD68(13)은 사구체 발현을 나타내었고; 따라서 M1 대식세포가 주로 사구체 내에서 발견되었음을 시사합니다. 그러나 CD68 염색은 FcR에 대한 PG 및 TI 염색과 일치하지 않았습니다(그림 3). 이 데이터는 FcR 발현 세포가신장대식세포가 아닙니다. CD206, CD68 및 CD11b에 대한 항체는 LN에서 약한 신호를 주었거나 신호가 없었습니다.신장, 그들은 건강한 인간 간에서 Kupffffer 세포를 강력하게 염색하여 항체의 신뢰성과 특이성을 확인했습니다 [(14); 데이터가 표시되지 않음].
LN 신장에서 기존의 수지상 세포 마커 CD11c 및 MHCII와 함께 국소화된 FcR
FcR 발현 세포가 수지상 세포(dendritic cell, DC)인지 확인하기 위해 기존의 DC marker인 CD11c와 MHCII를 이용하여 3색 IF 현미경을 통해 모든 인간 DC에서 높게 발현되는 것으로 알려진 MHCII(15, 16)와 더불어 다른 골수 세포. 정성적 분석은 FcR 발현(공초점 현미경에서 적색 방출 색상을 나타내는 Alexa{5}} 염료 접합된 이차 항체(Invitrogen)이 뒤따르는 항-FcR 항체를 사용하여 표지됨)이 CD11c 및 MHCII 둘 다와 공동 국소화됨을 입증했습니다. CD11c/MHCII는 CD11c/MHC II 항체를 사용하여 라벨링한 후 Alexa{9}} 염료 접합 이차 항체(Invitrogen)를 사용하여 공초점 현미경 검사법에서 녹색 방출 색상을 나타냈습니다(그림 4). Colocalization으로 인해 형광 FcR(빨간색)과 CD11c/MHCII(녹색)의 존재를 반영하는 노란색이 XY 차원의 동일한 위치/세포에서 동시에 발생했습니다(그림 4). CD11c의 염색 패턴은 PG 및 TI 영역에서 FcR(그림 4)과 일치했으며 항체는 사구체 내에서 염색되지 않았습니다. CD11c에 따라 MHCII(그림 4, 맨 아래 행)도 PG에서 강하게 염색되어 FcR과 함께 국소화됩니다. 그러나 강한 PG 염색 외에도 MHCII는 사구체 내에서 약한 염색을 보여 골수 세포일 수 있는 약한 MHCII 발현 사구체 세포의 존재를 시사합니다.
FcR은 형질세포양 수지상 세포 마커 CD123과 공동 국소화되지 않았지만 단핵구 유래 수지상 세포 마커 DC-SIGN과 공동 국소화
FcR-발현 DC의 어느 부분집합이 LN 플레어 동안 PG 영역에서 발견되는지 확인하기 위해, 생검 조직을 형질세포양 DC(pDC)의 특정 마커인 CD123에 대해 염색했습니다(16, 17). CD123 플러스 세포는 TI 영역에서 발견되었지만(그림 5, 맨 위 행) LN의 사구체와 PG 영역에는 없었습니다.신장. CD123 플러스 세포는 드물었고 TI에서의 CD123 염색은 FcR 염색과 일치하지 않았습니다. 이것은 LN에서 신장내 FcR-발현 DC가 pDC가 아님을 시사한다. 신호 조절 단백질 알파(SIRP) 발현은 FcR과 함께 국소화되어(그림 5, 중간 행), PG DC가 골수성 기존 유형 1 DC(cDC1)가 아님을 시사합니다(16). 나머지 가능성은 PG DC가 골수성 기존 유형 2 DC(cDCs2) 또는 단핵구 유래 DC(moDC)라는 것이었습니다. 이러한 DC 하위 집합을 구별하기 위해 DC-SIGN 발현, 즉 moDC에 특이적인 마커를 평가했습니다. DC-SIGN은 PG 영역에서 FcR과 함께 국소화되어(그림 5, 하단 패널) PG DC가 moDC임을 시사합니다.
FcR은 신장의 사구체 주위 영역에서 CD64, CD16 및 CD14와 함께 국소화되고 DC가 확인됨
LN에서 발견신장at Flare Are moDCs FcR을 발현하는 DC가 moDC임을 확인하기 위해 CD64, CD16 및 CD14를 포함하여 moDC에 존재하는 것으로 알려진 추가 세포 표면 마커의 존재를 평가하여 추가로 특성화했습니다. 이 마커 각각은 LN에서 발견되었습니다.신장조직 및 FcR과 함께 국소화되었습니다(보충 그림 1).
이전에 확인된 순환 infDC 마커 CD163 및 CD163 발현과 함께 국소화된 FcR이 LN 플레어에서 과발현됨
그 후, 여기에서 볼 수 있는 moDC 집단이 최근에 기술된 순환 infDC일 수 있는지 확인하기 위해 FcR을 사용한 CD163의 공동국재화 분석이 수행되었습니다(18). 그림 6은 PG 영역(그림 6A) 및 TI(그림 6B)에서 FcR(빨간색)과 CD163 colocalization(녹색)을 확인하여 moDC 하위 집합이신장LN flflare 동안 실제로 infDC입니다. infDC는 CD5(18)를 표현하지 않기 때문에신장조직은 CD5에 대해 염색되었습니다. CD를{1}}발현하는 세포가신장, 그들은 PG 영역에 근접하지 않고 FcR과 함께 국소화되지 않았으며(보충 그림 2), 이는 이러한 infDC에 CD5 발현이 부족함을 시사합니다. LN 및 HC에서 infDC의 차이를 정량화하려면신장, infDC는 항-CD163 단일클론 항체로 염색한 후 CD163 발현 면적과 CD163의 평균 형광 강도를 측정하여 정량화하였다. 4개의 LN 플레어에서 16개의 사구체 이미지 사용신장3개의 HC에서 얻은 18개의 사구체 이미지신장, 우리는 HC에 비해 LN 신장에서 9-에서 21-배 더 높은 수준의 infDC를 발견했습니다(그림 6C). infDC가 이전에 CD11b를 발현하는 것으로 나타났기 때문에(19, 20), 우리는 인간 LN을 추가로 분석했습니다.신장래트 항-인간 CD11b mAb(클론 M1/70)와 항-CD163 항체로. 이 원고(그림 3)의 이전 결과와 일치하여 클론 M1/70은 infDC에서 약하거나 없는 신호를 제공했습니다(보충 그림 3).
염증성 수지상 세포는 LN 플레어에서 T 세포와 근접하게 존재했습니다
루푸스 신염신장섹션은 T 세포 마커 CD3, 및 FcR 및 CD163에 대한 항체로 공동 염색되어 T 세포 및 infDC를 공간적으로 국소화했습니다. infDC 마커를 사용한 CD3 공동 염색은 항-CD3 항체(마우스 mAb UCHT1 및 토끼 mAb SP7)의 2개의 상이한 클론 및 2개의 infDC 마커를 사용하여 2가지 방식으로 수행되었습니다. CD3 mAb UCHT1 및 항-FcR 염색은 LN의 PG 영역에서 FcR 플러스 infDC에 인접하여 존재하는 CD3 플러스 T 세포의 존재를 보여주었다신장(그림 7A). 항-CD163 + CD3 mAb SP7로 염색(그림 7B)은 infDC가 인간 LN에서 CD3 + T 세포에 매우 근접하게 존재함을 확인했습니다.신장.infDC 마커를 사용한 CD3의 동시 염색은 두 세포 유형에 대해 주로 별개의 녹색 및 적색 염색을 나타내었지만, 몇 곳에서는 적색 및 녹색 염색이 겹쳤습니다.
논의 이 연구에서 우리는 침투하는 새로운 infDC 인구를 식별했습니다.신장LN 플레어에서. 이러한 infDC는 침투하여 PG 및 TI 공간에 국한되며 그 표현은 LN 플레어에서 10-배 더 큽니다.신장HC에 비해 이것이 새로운 것이라는 증거는 FcR 플러스 , MHCII 플러스 , CD11c 플러스 , CD163 플러스 , CD5 , DC-SIGN 플러스 , CD64 플러스 , CD14 플러스 , CD16 플러스 , SIRP 플러스 , CD206 , CD68 , CD123 인 표면 마커를 기반으로 합니다. , CD3 및 CD11bV . 특히, 이러한 infDC는 PG 영역의 T 세포에 근접하게 존재했습니다.신장LN 플레어 동안. 이 조사의 관찰은 실험적 사구체신염의 다양한 마우스 모델에서 PG DC 침윤을 검출한 이전 연구에 의해 뒷받침됩니다(21, 22). 그러나 infDC가 PG 공간에 정착하는 이유는 불분명하다. 이전 문헌은 다음과 같이 제안합니다.신장DC는 사구체에서 시작하여 PG의 T 세포에 항원을 제시하기 위해 사구체 다발과 림프관을 통해 사구체에서 시작하여 배수 림프절로 횡단합니다(23). 이 경우,신장DC는 사구체에서 시작될 수 있지만 LN이 임상적으로 분명해질 때까지 이러한 DC는 이미 사구체 밖으로 이동하여 PG 공간에 정착했습니다. 그러면 억제 신호가 방출되어 infDC로의 단핵구 분화에 필요한 사이토카인/케모카인을 차단할 수 있으며, 이는 생검 시 LN 사구체로부터 infDC의 부재를 설명합니다. 또는 DC 화학주성 인자가 다음에서 직접 방출될 수 있습니다.신장침윤성 DC(24)를 유인하는 관형 세포. 우리는 둘 다 염증 자극에 대한 반응으로 발생하여 LN 동안 infDC의 PG 및 TI 축적을 초래한다고 추측합니다.
이 조사는 PG DC가 형질세포양 또는 기존 DC가 아님을 확인했습니다. 이전에 보고된 단핵구 마커 CD14, CD64 및 CD16의 발현은 이러한 PG DC가 moDC를 나타내는 것으로 확인되었습니다(16, 25, 26). 활동성 염증 또는 감염 상황에서 moDC를 infDC라고 합니다(27). 이러한 moDC의 추가 특성화는 이전에 인간 LN에서 설명되지 않은 독특한 infDC 집단을 드러냈습니다. 그러나 특히 SLE 환자의 말초 혈액 면역 세포에 대한 최근의 전사체 연구에서 CD163 plus , CD14 plus 및 CD5h 인 infDC 서명이 확인되었으며, 이는 여기에 보고된 신장 내 infDC 집단과 유사합니다(18). 최근에는 단일 세포 RNA-Seq를 사용하여 면역 세포에 대한 광범위한 평가가 수행되었습니다.신장LN 플레어(28)에서 생검. 여러 단핵구 클러스터가 이 연구에서 여기에 설명된 infDC와 유사한 CD163 plus , CD14 plus , CD16 plus , CD64 plus 및 DC-SIGN plus 서명을 발현하는 하나의 단핵구 클러스터로 식별되었습니다. 또한, 특성화 된 단핵구 계통은 건강한 세포에서 최소한으로 발현되기 때문에 침윤 단핵구 하위 집합으로 생각되었습니다.신장. 이러한 IF 연구는 혈통 마커 발현 수준의 정확한 측정을 제공하지 않으며, 이는 단핵구에서 DC 전환 dDFOult로의 전환 단계를 식별할 수 있지만, 이러한 발견은 특성화 및 공간적 방향을 허용하여 추가 정량적 연구를 알릴 수 있습니다.
이 새로운 infDC 집단은 또한 리스테리아에 감염된 마우스(CD64 + CD11c + MHCII + )의 림프절(27) 및 체강 질병의 장 점막(29)에서 이전에 보고된 infDC와 유사합니다. InfDC는 류마티스 관절염 환자의 관절염 활액에서도 이전에 설명되었습니다(20). 그러나 LN에 설명된 infDC신장활액액 infDC와 다릅니다. 즉, 활액 infDC에 존재하는 대식세포 마커 CD11b 및 CD206이 부족합니다. 이것은 여기에 설명된 infDC 집단이 적어도 일부 다른 자가면역 질환에서 볼 수 있는 infDC와 다르며 고유할 수 있음을 시사합니다.신장LN 플레어 동안. 또한, 초기 연구에서 FcεRI가 확인되었습니다[(19, 30); 항FcεRI 항체(eBioscience, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 항체 결합 부위 확인] infDC를 구별하는 최고의 마커
그림 6|Fc 수용체 감마 사슬은 이전에 확인된 순환 염증성 수지상 세포(infDC) 마커 CD163과 함께 국소화되고 CD163 발현은 HC에 비해 인간 LN에서 과발현됩니다. (A) 3개의 인간 LN을 나타내는 3가지 색상 IF 이미지신장녹색에서 CD163의 colocalization을 보여주는 그림 6|(fifirst) PG 영역에서 빨간색(가운데)의 FcR이 있습니다. 두 번째 행은 점선 사각형으로 강조 표시된 맨 위 행 이미지의 확대된 부분을 보여줍니다. 세 번째 열은 핵(파란색)의 DIC 및 DAPI 염색과 함께 fifirst 2의 병합을 보여줍니다. (B) 3개의 인간 LN을 나타내는 3가지 색상 IF 이미지신장세뇨관 간질(TI) 영역에서 빨간색(가운데)의 FcR과 녹색(첫 번째)의 CD163의 공동 국재화를 보여줍니다. (C) 막대 그래프는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 3개의 다른 HC의 18G 이미지와 4개의 다른 LN 샘플의 16개 사구체 이미지에서 안티-CD163 염색의 녹색을 사용하여 CD163 발현을 기반으로 하는 infDC의 정량화를 나타냅니다. CD163(녹색)의 면적 x 평균 형광 강도(왼쪽 그래프) 및 면적 x 평균을 측정하고 평균 ± SD로 표시했습니다. 데이터는 각 측정값을 이용하여 unpaired t-test(one-tailed)로 분석하였고, p-value는 막대그래프로 나타내었다. 그림 7|행은 3가지 다른 LN을 나타내는 3색 IF 이미지를 나타냅니다.신장PG 영역에서 크게 확대된 CD163(초록색 infDC 마커)에 인접한 CD3(빨간색 팬 T 세포 마커)의 존재를 보여줍니다. 맨 아래 행은 오른쪽에 있는 첫 번째 2개 열의 병합된 이미지와 왼쪽에 있는 핵(파란색)의 DIC 및 DAPI 염색과 함께 처음 2개 열의 병합된 이미지를 보여줍니다. 유동 세포 계측법에 의해 대식 세포 및 cDC에서. 우리의 연구는 FcεRI, Fc RI, Fc RIIIa 및 Fc RI뿐만 아니라 GPVI, OSCAR 및 TREM(8)과 같은 다른 면역 수용체를 포함한 다중 FcR이 기능하는 세포질 감마 소단위인 FcR이 신뢰할 수 있는 것으로 제안합니다. 환자 생검 샘플에 대한 IF 연구용 마커. LN의 infDC가신장FcR의 존재는 간접적으로 FcεRI를 포함한 다중 수용체의 존재를 암시하기 때문에 Fc RI 및 Fc RIIIa(보충 그림 1)와 유사한 FcεRI를 발현합니다.
CISTANCHE는 신장/신장 질환을 개선할 것입니다
CD163을 발현하는 신내 세포 유형을 특성화하는 것의 중요성은 우리 그룹의 최근 발견에 의해 강화되었으며, 이는 소변 CD163 수준이 신외 SLE 또는 비활성 SLE에 비해 활성 LN에서 상당히 더 높다는 것을 보여줍니다(31). 소변 CD163은 질병 중증도 및 조직학적 활성 지수와 상관관계가 있습니다. Mejia et al(31)의 연구 동안. CD163이 M2 대식세포에서 유래한다고 제안했지만, 우리는 이제 소변 CD163이 infDC에서도 유래한다고 제안하여 소변 CD163이 LN의 질병 활동을 반영하는 바이오마커라는 아이디어를 뒷받침합니다.
이러한 infDC의 기원과 관련하여 단핵구 마커의 발현은 infDC가신장면역 복합체를 포함한 다양한 자가면역 자극에 의해 유발되는 염증 동안. 반면에 루푸스 순환이 있는 환자에서 CD163 + CD14 + infDC의 존재는(18) 말초 순환의 infDC가 세포로 유입됨을 시사합니다.신장LN에서. 두 메커니즘 모두 다음을 설명하는 것도 가능합니다.신장infDC. infDC가 인간 LN 동안 T 세포와 상호 작용하는 메커니즘은 현재 알려져 있지 않습니다. infDC 마커와 함께 CD3의 공동 염색이 주로 근접한 두 세포 유형의 개별 집단을 보여주지만(그림 7B), 면역학적 시냅스 형성 및 LN에서 이러한 infDC와 T 세포 사이의 상호 작용을 암시하는 일부 중첩의 증거도 있습니다신장.그러나 T 세포는 2차 림프 기관으로 이동할 태세입니다. 최근 보고서는 LN 및 쥐 LN 환자에서 3차 림프 구조(TLS)로 구성된 면역 응집체의 존재를 보여주었습니다신장유전자 서명 및 세포 구성에 의해 림프절과 유사합니다(32). 이것은 LN에서 T- 및 B-세포 응집체로 배중심을 식별한 이전 보고서와 일치합니다.신장(33). LN에서 infDC를 식별하는 맥락에서 이러한 결과를 고려합니다.신장PG와 TI의 infDC가 LN 신장 내에서 국소 적응 면역 반응의 중요한 동인이 될 수 있음을 시사합니다. 이러한 T 세포가 상주 T 세포인지 프라이밍된 T 세포인지는 아직 명확하지 않지만, infDC는 다양한 질병 조건에서 주요 T 보조 세포 하위 집합, 즉 Th1, Th2 및 Th17의 발달을 촉발하는 능력을 갖는 것으로 알려져 있습니다(20 , 34, 35). 시험관 내 연구에서 infDC가 Th17 반응의 개시 및 유지에 관여한다고 제안하지만(19), 새로운 LN에 대한 추가 연구는신장 나염증 자극과 조직 미세 환경이 제자리에서 infDC 기능을 결정하기 때문에 nfDC가 필요합니다(36).
결론
결론적으로, 우리는 LN에서 이전에 설명되지 않은 새로운 infDC 집단을 식별했습니다.신장.이러한 infDC는 PG 영역에 있으며 침투하는 T 세포에 인접해 있습니다. SLE에서 순환하는 CD163과 infDC를 식별하는 최근 문헌과 LN에서 질병 활동의 가치 있는 마커로 소변 CD163을 식별하는 최근 문헌과 결합된 우리의 발견은 infDC와 T 세포 파트너가 활성 LN 동안 국소 적응 면역 반응을 유도하는 주요 기여자가 될 수 있음을 시사합니다. infDC 옆에 있는 T 세포 하위 집합을 정의하고 PG infDC가 LN의 국소 염증을 유도하기 위해 T 세포와 통신하는 메커니즘을 이해하려면 추가 연구가 필요합니다.