새로운 S-황화 인간 혈청 알부민 제제는 멜라닌 합성을 억제합니다

연락하다:jaslyn.ji@wecistanche.com

인간 혈청 알부민(HSA)은 혈청에서 가장 풍부한 단백질이며 생체 적합성과 긴 혈장 체류 특성으로 인해 약물 운반체로 널리 사용됩니다[14,15]. HSA는 총 35개의 Cys 잔기를 포함하며 그 중 하나인 Cys34는 유리 티올기의 형태로 존재합니다[16]. Cys34는 반응성 티올 그룹으로 인해 약물 결합 부위의 표적이 되는 경우가 있습니다[17,18]. 예를 들어, 산화질소(NO)가 있는 경우 Cys34 티올 그룹은 S-니트로화됩니다. 우리는 이전에 S-nitrosated HSA(SNO-HSA)가 NO가 혈청에 장기간 유지되도록 한다는 것을 입증했습니다[19]. SNO-HSA는 허혈/재관류에 대한 간 보호 효과[20] 및 종양 억제 효과[21]를 포함하여 다양한 생물학적 기능을 가지고 있습니다.

결과적으로 우리는 HSA가 Cys34-SH의 S-sulfhydration을 통해 RSS 캐리어(예: SNO-HSA)로 사용될 수 있다고 가정했습니다. 다황의 공급원으로서 DATS와 DMTS는 친유성과 휘발성 때문에 제한적입니다. 따라서 상업적으로 이용 가능한 Na2Sn(Na2S, Na2S2, Na2S3 및 Na2S4)이 이 연구에서 사용되었습니다. Ogasawara et al. 이전에 제조된 황 결합 혈청 알부민은 시약의 간단한 혼합에 의해 황화나트륨(NaHS)과 반응합니다[22]. NaHS의 황을 Cys34에 첨가하고 생성된 제제는 과산화지질로 인한 간 손상을 보호했습니다. RSS 전달을 위해 Na2Sn을 사용하여 RSS 추가 HSA를 준비하기 위해 이 방법을 채택했습니다.

이 작업에서 우리는 Na2Sn 처리된 HSA의 준비와 RSS의 새로운 전달 시스템으로의 사용을 보고했습니다. 첨가된 황은 설판 유황 프로브[23]와 폴리설파이드에서 설파이드 제거[24]를 통해 분석되었습니다. 피부 미백에 대한 Na2Sn 처리 HSA의 효과를 평가하기 위해 B16 흑색종 세포주를 사용하여 멜라닌 합성에 대한 Na2Sn 처리 HSA의 효과를 연구했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 재료

인간 혈청 알부민(HSA)은 KAKETSUKEN(Kumamoto, Japan)에서 구입했으며 모든 HSA 샘플은 목탄 처리로 지방을 제거했습니다. 황화나트륨 및 사황화나트륨은 DOJINDO Laboratory(Kumamoto, Japan)에서 구입했습니다. 설판 황 프로브 4(SSP4)는 이전에 설명된 대로 준비되었습니다[23]. L-DOPA, 글루타티온(DTNB), 아스코르브산 및 나트륨 satiric Griess 시약(설파닐아미드, 나프틸에틸렌디아민-HCl)은 Nakarai Chemicals(Kyoto, Japan)에서 구입했습니다. Sephadex G-25 탈염 컬럼(φ 1.6 × 2.5 cm)은 GE Healthcare(Kyoto, Japan)에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM) 및 2,{12}}diphenyl{13}}picrylhydrazyl(DPPH)은 Wako Pure Chemical(Osaka, Japan)에서 입수했습니다. 버섯 티로시나제는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 다른 모든 화학 물질은 상업적으로 이용 가능한 최고 등급이었고 모든 용액은 탈이온수 및 증류수에서 준비되었습니다.

시스탄체 추출물

2.2. BCA 단백질 분석

단백질 농도는 BCA 단백질 분석을 사용하여 측정되었습니다. 샘플 및 소 혈청 알부민(BSA) 표준의 10μL 분취량을 25도에서 30분 동안 반응 완충액 100μL에서 인큐베이션했습니다. 반응 후 micro-plate reader를 이용하여 540 nm의 흡광도를 측정하였다. BSA는 표준 곡선을 구성하는 데 사용되었습니다.

2.3. Na2Sn 처리-HSA의 합성

HSA(300μM)를 PBS(pH 7.4)에서 1mM의 소듐 폴리설파이드(Na2Sn)와 함께 37도에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 반응 후 과량의 폴리설파이드 나트륨은 Sephadex G{8}} 컬럼으로 겔여과하여 제거하였다.

2.4. 다황화물로부터 황화물 제거법(EMSP)에 의한 황 결합율 측정

EMSP는 이전에 설명된 대로 준비되었습니다(3N NaOH 5mL에 L-아스코르브산 792mg을 첨가하여 3xEMSP)[24]. 샘플(7.5μM, 133μL)을 37도에서 3시간 동안 66.7μL의 3xEMSP와 함께 인큐베이션했습니다. 그런 다음 1% 아연 아세테이트 용액(600μL)을 반응 용액에 첨가한 다음 즉시 볼텍싱했습니다. 샘플을 8,{18}} xg에서 5분 동안 원심분리하고 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척했습니다. 상층액을 제거한 후, 탈이온수 및 증류수(200μL)를 침전물에 첨가하였다. 1% 징크 아세테이트(300μL), 50μL의 20mM N,N-디메틸-p-페닐렌디아민 및 7.2N HCl 중 20mM FeCl3를 첨가한 후, 용액을 25도에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 1분 동안 8000xg에서 원심분리하고 96-웰 플레이트로 옮기고 665 nm에서 OD를 측정했습니다. Na2S는 표준 곡선을 구성하는 데 사용되었습니다.

2.5. SSP4를 사용한 설판 유황 검출

각 샘플(20μM)을 25도에서 10분 동안 1mM 세틸트리메틸암모늄 브로마이드/PBS(pH 7.4)에서 5μM의 SSP4와 함께 인큐베이션했습니다. 인큐베이션 후, 457nm에서 여기, 490-535nm에서 방출로 분광광도계(JASCO Corporation)로 형광을 측정했습니다.

2.6. DPPH 라디칼 테스트

에탄올 중 DPPH(250μM)를 동일한 양의 MES 완충액(50mM, pH 7.4)과 혼합했습니다. 이 DPPH 용액에 Na2Sn 처리된 HSA(40μM)를 첨가하고 25도에서 30분간 배양한 후 540nm에서 DPPH 라디칼의 흡광도를 측정하였다. 소거된 라디칼 비율은 다음 공식을 사용하여 변환되었습니다.

제거된 라디칼( 퍼센트 )=(Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. NO 및 SNO 분석

Na2Sn 처리된 HSA(5{8}} μM)를 NO 공여자 NOC7(2{14}}0 μM)과 함께 25도에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 반응 후 NO와 SNO의 농도는 약간의 변형을 가한 Griess assay로 측정하였다[25]. Griess 시약 용액은 0.1% N{10}} 나프틸에틸렌-디아미드 디히드로클로라이드와 1% 설파닐아미드를 2% 인산에 혼합하여 제조했습니다. 반응 완충액은 0.1M NaCl, 0.5mM DTPA 및 10mM AcONa·AcOH(pH 5.5)로 구성되었습니다. 샘플(20μM)을 10mM Na 아세테이트(pH 5.5) 중 3mM HgCl2와 함께 반응 완충액(110μL) 중 Griess 시약 용액(60μL)과 반응시켰다. 15분 인큐베이션 후, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 540 nm의 흡광도를 측정했습니다. 나머지 NO/SNO 비율(%)을 계산하고 샘플에 대한 PBS 값과 비교했습니다.

2.8. 세포 배양

B16 흑색종 세포는 일본 암 연구 자원 은행(JCRB, Tokyo, Japan)에 의해 제공되었으며, 10% 소태아 혈청 및 항생제 용액을 함유하는 DMEM에서 배양되었다. 세포는 인큐베이터에서 5% CO2를 포함하는 가습 공기에서 37도를 유지하면서 성장했습니다(계대 번호 10-20).

2.9. 멜라닌 생성

B16 흑색종 세포를 24웰 플레이트에 2.5×1{9}}4 cells/well의 농도로 파종하고 5% CO2하에 37도에서 24시간 동안 배양했습니다. 샘플을 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 0.4mM 티로신 및 10mM NH4Cl로 처리한 다음 72시간 동안 37도에서 5% CO2하에 인큐베이션했습니다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 1N NaOH(200μL)에 용해시켰다. 60도에서 2시간 인큐베이션한 후, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 흡수(405 nm)를 측정했습니다.

Cistanche는 멜라닌 생성을 억제합니다.

2.10. 자외선

핸드 헬드 UV 램프를 사용하여 웰 플레이트에서 5cm 거리에서 샘플을 조사했습니다. 이 UV 램프는 5cm 거리에서 254nm 또는 365nm 방사선으로 각각 614 또는 743μW/cm2의 UV 강도를 제공합니다.

2.11. 세포내 ROS, NO, RSS에 대한 Na2S4-처리된 HSA의 소거 활성

B16 흑색종 세포에서 ROS 및 NO는 각각 형광 프로브인 CM-H2DCF-DA 및 DAF-FM-DA에 의해 측정되었다. B16 흑색종 세포를 {{7}웰 플레이트에 1 × 104 cells/well의 농도로 파종하고 24시간 동안 37도, 5% CO2에서 배양했습니다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS 중 CM-H2DCF-DA(5μM) 또는 DAF-FM-DA(10μM)로 교체했습니다. 프로브는 37도에서 30분 동안 배양하여 세포에 흡수되었습니다. 반응 후 상층액을 제거하고 샘플을 PBS에 희석하여 즉시 형광을 측정하였다. 세포에 15분 동안 UV 램프를 조사했습니다. 조사 후, 형광 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 형광 강도(Ex. 485 nm, Em. 535 nm)를 측정하였다.

2.12. 버섯 티로시나아제 활성 및 멜라닌 응집

Tyrosinase 및 L-DOPA 용액은 분석 직전에 PBS(pH 7.4)에서 준비되었습니다. 버섯에서 분리된 Tyrosinase는 Na2Sn 처리된 HSA의 억제 활성을 조사하는 데 사용되었습니다. 버섯 티로시나제(537U/mL) 20μL 부분과 Na2Sn 처리된 HSA(40μM) 100μL를 96웰 플레이트에서 PBS(60μL)와 잘 혼합하고 L-DOPA(5mM) 20μL를 그런 다음 추가했습니다. 30분 배양 후, OD 490 nm를 측정하여 합성된 멜라닌의 수준을 분석했습니다. 멜라닌 응집을 분석하기 위해 혼합물을 20,{19}} g, 15분 동안 3시간 동안 원심분리했습니다. 흰색 화살표는 집계된 재료를 나타냅니다. 490 nm의 OD에서 상층액의 비응집 멜라닌을 측정했습니다.

2.13. 안전 테스트

이 연구에 사용된 국소 크림은 60도에서 물(30mL) 호호바 오일(15mL)과 5g의 유화 왁스를 혼합하여 준비했습니다. 냉각 후 Na2S{5}}처리된 HSA(20μM)와 생성된 현탁액을 잘 혼합했습니다. 피부 자극 테스트는 LabCyte Epi-Model(3D 배양 인간 피부 모델)을 사용하여 OECD 테스트 가이드라인 439에 따라 수행되었습니다.

2.14. 통계 분석

수집된 자료의 통계적 유의성은 2개 이상의 평균에 대해 ANOVA 분석 후 Newman-Keuls 방법으로 평가하였다. 그룹 간의 차이는 Student's t-test에 의해 평가되었습니다. P < 0.05는="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">

3. 결과

3.1. S-황화 HSA의 제조

Na2Sn 처리된 HSA는 Na2Sn과 함께 인큐베이션하고 반응 후 겔 여과를 거친 HSA로부터 제조하였다. 샘플에서 설판 황의 양을 평가하기 위해 우리가 이전에 개발한 새로운 정량적 방법인 EMSP가 사용되었습니다[24]. 따라서 Na2S4- 처리된 HSA는 HSA와 Na2Sn으로부터 시약을 37도에서 1시간 동안 반응시켜 제조하였다. 다양한 양의 소듐 폴리설파이드가 HSA와 반응하도록 하였다. 그런 다음, HSA 샘플을 사용 당시 준비한 EMSP 용액과 함께 37도에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. EMSP 분석에 따르면, S-황화 수준은 황의 양과 무관하게 증가했습니다(그림 1A). 반면에 그림 1B에서 볼 수 있듯이 Na2S{17}} 또는 Na2S{19}}처리는 Na2S 또는 Na2S{24 }} 처리는 SSP4가 단백질의 폴리설파이드와 비선형 방식으로 반응할 수 있음을 시사합니다(그림 1B).

3.2. Na2S 처리 HSA의 항산화 및 NO 억제 효과

우리는 Na2Sn 처리된 HSA가 항산화 활성 때문에 멜라닌 생성을 억제할 것이라고 가정했습니다. 따라서 in vitro에서 항산화 활성을 분석하기 위해 DPPH 라디칼 테스트[26,27]를 수행하였다. 그 결과, Na2Sn 처리된 HSA는 첨가된 황의 농도가 상당히 더 높았다(그림 2A). NO의 효과를 설명하기 위해 NOC7(NO 공여자)을 25도에서 Na2S 처리된 HSA와 함께 배양했습니다. 30분의 인큐베이션 후, 나머지 NO 농도는 Griess 분석에 의해 정량화되었습니다. 그림 2B의 닫힌 막대에서 볼 수 있듯이 Na2S{16}}처리된 HSA는 대조군과 HSA에 비해 훨씬 더 많은 NO를 소거했습니다(그림 2B). 원소 수은(Hg)은 SNO를 줄이고 NO를 방출하는 것으로 알려져 있습니다{18}}. Na2S{20}}처리된 HSA의 용액에 Hg를 첨가하면 NO{21}}가 방출되어 Na2S{23}} 처리된 HSA가 S-nitrosation을 통해 제거되었음을 시사합니다.

3.3. Na2Sn 처리 HSA의 멜라닌 억제 효과

B16 마우스 흑색종 세포를 배양하고 배지에 티로신을 첨가하여 멜라닌 합성을 촉진시켰다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 Na2Sn 처리된 HSA는 멜라닌 합성을 억제하였으며, 그 억제 정도는 황 함량에 의존적이었다. Na2Sn 처리 HSA 적용 후 B16 흑색종 세포의 세포 이미지도 Na2Sn 처리 HSA가 멜라닌 생성 비율을 감소시키는 것으로 나타났습니다양성 세포(그림 3).

3.4. UV 조사에 의한 Na2S4-처리된 HSA의 항산화 효과

Na2Sn 처리된 HSA가 UV 유발 ROS 또는 NO의 형성을 억제하는지 여부를 조사하기 위해 B16 흑색종 세포를 모델로 사용하여 산화 스트레스 테스트를 수행했습니다. 15분 동안 2개의 다른 UV 기기를 조사하여 B16 흑색종 세포에서 Na2S{6}처리된 HSA에 의한 ROS 생성을 CMH{10}DCF-DA로 측정했습니다. 이 결과는 Na2S{13}}처리된 HSA가 254 nm 및 365 nm 조사에 의해 PBS 및 HSA에 대한 CMH{14}DCF-DA의 형광을 현저히 감소시켰음을 나타냅니다(그림 4AB). 반대로 Na2S{20}}처리된 HSA는 254nm UV 조사에 의해 B16 흑색종 세포에서 NO 생성도 억제했습니다(그림 4CD). 이러한 결과는 Na2Sn 처리된 HSA가 UV 조사에 의해 생성되는 ROS와 NO를 억제하여 멜라닌 합성을 억제함을 나타냅니다.

3.5. Na2Sn 처리 HSA에 의한 티로시나아제 및 멜라닌 응집의 직접적인 억제

일부 상업용 항멜라닌 제제는 티로시나제 활성을 직접적으로 억제하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 우리는 Na2Sn 처리된 HSA가 tyrosinase의 활성을 변경하는지 여부를 테스트했습니다. 연구 결과는 Na2Sn 처리된 HSA가 처리되지 않은 HSA보다 버섯 티로시나제를 더 많이 억제한다는 것을 나타냅니다(그림 5A). 생성된 멜라닌은 쉽게 응집되어 수질 형성을 유도합니다[28]. 따라서 우리는 다음으로 Na2Sn 처리된 HSA가 멜라닌의 응집을 억제하는지 여부에 대한 문제를 해결했습니다. 결과적으로, tyrosinase와 L-DOPA를 3시간 동안 함께 배양하면 멜라닌 색소가 응집되지만 Na2Sn 처리된 HSA는 응집을 방지하였다(Fig. 5B). 한편, HSA는 또한 응집을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 HSA 자체가 L-DOPA가 티로시나아제에 결합하는 것을 방지할 수 있음을 나타냅니다.

3.6. 3차원 배양 인간 피부를 이용한 Na2Sn 처리 HSA의 안전성 시험

Na2S{1}}처리된 HSA에 대한 피부 자극 테스트는 OECD 가이드라인에 따라 3D 배양된 인간 피부 세포를 사용하여 수행되었습니다. 그 결과, 생존 세포의 수는 국소 크림을 사용하거나 사용하지 않고 Na2S4-처리된 HSA에 의해 감소되지 않았습니다(그림 6A). 또한 LDH 세포독성 검출 키트를 사용하여 Na2S{7}}처리된 HSA에 의해 피부 세포가 손상되지 않았음을 알 수 있었습니다(그림 6B). 이러한 데이터는 Na2Sn 처리된 HSA가 이 연구에서 조사된 농도에서 인간 피부에 사용하기에 매우 안전하다는 것을 나타냅니다.

4. 토론

멜라닌은 티로신의 산화에 의해 합성됩니다. 티로신은 티로시나제의 작용에 의해 L-DOPA로 산화된 다음 도파퀴논으로 산화됩니다. 도파퀴논은 자연적으로 멜라닌으로 산화됩니다. 멜라닌은 검은색 색소와 주근깨의 생성을 유도하지만, 자외선에 의해 피부가 손상되는 것을 막아주는 역할도 합니다. 인간 피부에서 멜라닌 세포는 UV 조사에 의해 자극될 때 ROS와 NO를 생성합니다[2,29,30]. ROS는 ATP 합성효소, 페닐알라닌 수산화효소 및 MAPK의 인산화 작용을 통해 티로시나아제를 활성화하여 멜라닌 합성을 촉진합니다[31,32]. NO는 cGMP의 세포 수준을 증가시켜 티로시나아제를 활성화합니다[6]. 따라서 ROS 및 NO 제거제는 멜라닌 생성 방지제로 간주됩니다. 여기에서 우리는 Na2Sn 처리된 HSA의 항멜라닌 합성 효과를 조사했습니다. Na2Sn 처리된 HSA는 UV 복사에 의해 생성된 ROS와 NO의 세포 수준을 강력하게 억제했습니다(그림 4). 또한 Na2Sn 처리된 HSA는 tyrosinase의 작용(Fig. 5A)과 멜라닌의 응집(Fig. 5B)에 직접적인 영향을 미쳤습니다. 우리는 황산염 황이 Na2Sn 처리된 HSA에서 세포로 어떻게 전달되는지에 대한 메커니즘을 명확히 할 수 없었습니다. 따라서 Na2Sn 처리된 HSA 기능의 직접적인 효과의 특성은 아직 명확하지 않습니다. Yamashita et al. 도파퀴논이 시스테인 잔기를 통해 티올 단백질에 결합한다는 것이 입증되었습니다[33]. 종합하면, HSA 및 Na2Sn 처리된 HSA에 의한 멜라닌 응집의 억제는 또한 도파퀴논 또는 멜라닌과의 이황화 결합 형성을 포함할 수 있습니다. 한편, tyrosinase 억제는 첨가된 황 함량에 의존적이었다(Fig. 5A). GSH는 tyrosinase에 결합하여 활성을 감소시키는 것으로 알려져 있습니다[34]. S-sulfhydrated cysteine은 normal cysteine보다 반응성이 더 강하기 때문에[11], glutathione persulfide(GSSH)는 GSH보다 tyrosinase의 작용을 더 억제할 수 있다. 향후 Na2Sn 처리된 HSA가 세포 내 GSSH를 증가시키는지에 대한 추가 연구가 필요합니다.

ROS는 UV 조사나 외부 스트레스에 의해 생성되어 멜라닌 합성의 형태뿐만 아니라 DNA 손상 및 가교 콜라겐 형성으로 인한 주름 및 피부 처짐 등 노화의 징후를 유발합니다. 또한 ROS는 여드름 및 건선과 같은 다양한 유형의 염증에서 악화 요인인 것으로 알려져 있습니다. 트라넥삼산[35] 및 알부틴[36]과 같은 다양한 피부 미백제가 이러한 문제를 해결하기 위해 고안되었습니다. 그러나 이러한 화합물은 멜라닌 합성을 억제할 뿐 산화 스트레스에는 영향을 미치지 않습니다. 따라서 ROS 유발 독성의 위험은 남아 있습니다. Na2Sn 처리된 HSA를 사용하는 이점은 ROS를 효율적으로 제거한다는 것입니다(그림 2 및 4).

황화수소는 산화질소와 일산화탄소에 이어 세 번째 필수 분자로 연구되어 왔습니다. 황화수소의 치료 효과는 허혈/재관류[37], 동맥경화[38], 패혈증[39] 및 고지방식이 유발 독성[40]의 치료에 적용할 수 있는 것으로 나타났습니다. 또한 과황화수소는 황화수소보다 활성이 높습니다. 예를 들어, Na2S4는 메틸 수은을 효과적으로 해독하고 신경모세포종 세포의 분화를 억제하지만 Na2S는 그렇지 않습니다[12,41]. 따라서 Na2Sn 처리된 HSA의 미백효과 뿐만 아니라 다른 긍정적인 효과도 가능하다.

결론적으로, 우리는 혈청 알부민을 안정한 운반체로 사용하는 새로운 RSS 전달 시스템의 개발에 대해 보고했습니다. 반응성 황은 HSA와 결합될 때 HSA보다 더 강력한 항산화 효과를 가지며 흑색종 세포에서 멜라닌 합성을 억제합니다. 항멜라닌 생성 메커니즘은 ROS 및 NO 소거뿐만 아니라 티로시나제 활성 및 멜라닌 응집의 억제를 포함합니다. 따라서 Na2Sn 처리된 HSA는 안전한 피부 미백제로 사용할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

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