Spectrum-Effect Relationship Analysis And Network Pharmacology에 기반한 Cistanche Tubulosa의 활성 성분 스크리닝을 위한 새로운 전략 Ⅱ

3. 결과 및 논의

3.1. HPLC 지문

3.1.1. 방법 검증

HPLC 방법에 대한 검증은 방법 정밀도, 재현성 및 안정성에 대한 상대 표준 편차(RSD)가 상대 피크 면적(n= 11) 및 0.77%에 대해 2.85% 미만인 것으로 나타났습니다. 상대 보존 시간(n = 11). 동일한 샘플 솔루션의 정밀도는 상대 시간에 대해 0.05–{{10}}.77% 및 0.28– 범위 내에서 나타났습니다. 공통 피크의 상대 면적에 대해 2.70%. 실험의 재현성은 상대 시간의 경우 0.03~0.20%, 공통 피크의 상대 면적의 경우 0.23~2.59% 범위 내였다. 샘플 안정성은 상대 머무름 시간의 경우 0.09~0.24%, 공통 피크의 상대 면적의 경우 0.75~2.85%였습니다. 이러한 결과는 확립된 지문이 만족됨을 나타냅니다. 게니포시드산에 대한 선형 관계,에키나코사이드, 액티오사이드, 튜불로시드 A, 그리고아이소액티오사이드표 S4에 나와 있습니다. R 제곱의 값은 1.0000로 좋은 선형성을 나타냅니다. 샘플 회수 결과는 geniposidic acid, echinacoside,액티오사이드, 튜불로시드 A, 그리고아이소액티오사이드100.37%, 103.59%, 98.46%, 100.81%, 101.19%였으며, 시료 회수율의 RSD는 2.68% 미만이었다.

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3.1.2. 피크 면적(PA) 및 상대 체류 시간(RRT)

C. tubulosa 11개 배치의 HM, WE 및 HR의 기준 지문 및 지문이 그림 2에 나와 있습니다. 우수한 분리 및 분해능을 나타내는 11개의 피크가 HM, WE 및 HR 사이에서 공통 피크로 식별되었습니다. 5개의 표준 화합물은 게니포시드산(A2)으로 확인되었고,에키나코사이드(A8),액티오사이드 (A9), 튜불로사이드A(A10) 및아이소액티오사이드(A11). 표준 화합물,에키나코사이드모든 크로마토그램(평균 머무름 시간 12.86분)에 적절한 피크 면적과 우수한 안정성으로 존재하는 를 기준 피크로 선택하여 다른 10개의 상대 머무름 시간(RRT)을 계산하는 데 사용했습니다. 일반적인 봉우리. 이러한 다양한 형식의 RRT는 0.16–1.51 범위에 있습니다. 이러한 공통 피크의 PA 및 분산 계수(CV 백분율)는 표 S5–S7에 나열되어 있습니다. 데이터에서 다양한 형태의 PA에 대한 CV 백분율 값은 HM, WE 및 HR에 대해 각각 25.78% -142.02%, 23.36% -150.38% 및 28.91% -112.78%입니다. 이 결과는 각각의 농도에서 상당한 차이를 나타냅니다.Cistanche tubulosa다른 형태 사이의 합성. HM, WE 및 HR의 지문은 그림 3에 나와 있습니다.

그림 2 표준 시료의 HPLC 지문

3.1.3. HM, WE 및 HR의 콘텐츠

5가지 표준 구성 요소C. tubulosa측정되었다. 주요 구성 요소의 내용은 표 1에 나와 있습니다. HM, WE 및 HR 간의 비교는 표 2 및 그림 4에 나와 있습니다. C. tubulosa의 PhG는 생물학적으로 활성이지만 열에 민감합니다. 물에 용해되는 열에 민감한 성분은 합리적인 방법을 사용하여 효율적으로 추출할 수 있습니다. 일반적으로 Cistanche herba는 물로 추출한 다음 다음 화학 분석을 위해 농축 용액으로 증발시킵니다 [26, 27, 30]. 추출 및 농축 후 분무 건조 기술이 사용되었으며 이전 기사에서 절차가 수정되었습니다. 액체 증기에서 물을 빠르게 제거한 다음 식물에서 원료의 건조 추출물을 얻었습니다. 이 단계에서 말토덱스트린을 첨가하는 것은 분산을 향상시키고 저장 시간을 연장하기 위한 공통 담체로 간주됩니다. 일련의 제조 공정을 통해 허브 식물을 첨가제와 함께 공식 과립으로 압축했습니다. 부형제를 추가하는 이 단계는 실험에 포함되지 않았습니다. 일반적으로 당사의 생산 공정에는 섹션 2.2에 설명된 대로 포뮬러 과립 생산 공정과 병행하여 추출, 농축 및 분무 건조가 포함됩니다. 이러한 반제품을 생산하기 위해서는 위의 세 단계를 거쳐야 합니다. WE를 형성하는 과정에는 농축 및 분무 건조가 포함되어 열에 민감한 성분의 손실이 쉽게 발생하지만 HR은 HM의 추출 및 건조 후에 얻습니다. 활성 구성 요소가 HR에 남아 있는 것이 가능한지 궁금합니다. 우리의 결과에 따르면, verbascoside의 함량은 HMs에서 WEs 및 HRs(각각 및 )로 크게 감소했습니다. 버바스코사이드의 열적 안정성은 가열 과정에서 HPLC를 통해 피크 면적의 변화를 모니터링하여 조사하였다. 4시간 동안 가열한 후, 41.6%의 버바스코사이드가 남습니다. 그것은 verbascoside가 열에 민감하다는 것을 나타냅니다[31]. WE의 Isoacteoside, tubuloside A 및 echinacoside는 복잡한 처리 절차 후에도 안정적으로 유지되었습니다. 장기간의 건조 과정 동안 PhGs의 축적은 상당한 감소를 보였으며, 이는 이러한 열 민감성 구성 요소의 열 분해에 기인할 수 있습니다[32]. 다른 대상 구성 요소의 경우 HR과 WE는 verbascoside를 제외하고 크게 다르지 않았습니다. 이러한 차이점에 대한 우리의 이해는 향후 약초 찌꺼기에 대한 더 나은 품질 기준을 개발하고 제품으로 발전시킬 수 있게 할 것입니다.

표 1 C. tubulosa 11개 배치의 내용물

표 2 주요 구성 요소의 내용물 비교(n = 11).

,

그림 4 서로 다른 형식(n = 11)의 5개 구성 요소에 대한 함량 결정. , ns: 중요하지 않음.

3.1.4. 지문 유사도 분석

세 개의 C. tubulosa 그룹 간의 유사성을 평가했습니다. 한약재-물추출물, 한약재-잔사물, 물추출물-잔사물 유사도 값은 0.943~0.994, 0.847~{ {9}}.995 및 0.938–1.000 각각(표 3).

표 3 C. tubulosa의 11개 배치에 대한 HM-WE, HM-HR 및 WE-HR의 유사성.

3.2. 항산화 활성 테스트 결과

다양한 형태의 C. tubulosa의 항산화 활성은 DPPH, 및 소거능 분석을 사용하여 결정되었으며 관련 결과는 그림 5에 표시됩니다. 표 S8에서 DPPH 및 소거능 분석 결과의 범위는 { {2}}.04–37.80, 0.98–843.90 및 0.32–27.65 mg/mL(C. tubulosa의 11개 배치 중 세 가지 다른 형태). 세 가지 항산화 활성 테스트에서 HM과 WE는 가까운 억제 활성을 보인 반면 HR은 가장 약한 억제를 보였습니다.

분무 건조된 WE는 낮은 농도에서도 상당한 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. 이전 보고서에서는 분무 건조된 Vernonia amygdalina WE가 0.17 mg/mL에서 50% 소거 억제를 달성했다고 밝혔습니다[33]. 긴 추출 시간과 높은 온도를 적용하는 것은 양날의 검입니다. 한편으로는 추출 시간과 분무 건조 입구 온도를 높이면 수율과 효율성이 향상됩니다. 또한 추출물은 식물보다 강력한 항산화 활성과 더 높은 농도의 생물학적 성분을 달성합니다 [34]. 반면에 지나치게 뜨거운 유입 공기는 생체 활성 화합물을 분해합니다. 이러한 상승된 공기 입구 온도는 항산화제 Bidens pilosa 추출물 활성의 손실로 이어졌으며 페놀 화합물의 감소에 기인했습니다[35]. 현재 결과는 앞서 언급한 보고서와 일치합니다. 예를 들어, S6의 WE는 HM과 HR보다 약한 라디칼 억제 능력을 보였습니다. 또한, S5의 HR은 HM 및 WE보다 더 강한 DPPH 및 슈퍼옥사이드 음이온 소거 능력을 나타냈다. PhG의 구조는 글리코시드 결합과 효소 작용 하에서 쉽게 가수분해되거나 고온에서 분해되는 아세틸 그룹으로 구성됩니다. 이러한 반응은 대규모 생산 중 일부 주요 구성 요소의 감소를 설명할 수 있습니다. 그러나 특정 성분의 가수분해 또는 이성체화는 다른 성분의 합성을 가속화할 수 있습니다. 이러한 변형은 Cistanches 허브를 처리할 때 일반적입니다[36-38]. 수용성인 PhG는 대부분의 생물학적 성분이 물 추출을 통해 활용될 수 있음을 의미합니다. 대부분의 활성 성분이 WE에 남아 있다는 주장은 수십 년 동안 지속되었으므로 젖은 잔류 물질을 추출 후 폐기할 수 있다고 가정하는 것이 타당해 보입니다. 그러나 C. tubulosa의 HR을 폐기물로 간주하는 것은 올바르지 않습니다. 연구자들은 PhG가 불안정하고 효소나 가수분해에 취약하다고 지적합니다[39]. 가공 중 식물 의약품 내 생물학적 성분의 감소에 기여하는 가수분해 또는 이성체화 반응은 동시에 HR을 활용할 수 있는 새로운 기회를 제공할 수 있습니다. 전통적인 추출 방법을 전환함으로써 약용 잔류물을 보다 효과적으로 개발하고 활용할 수 있습니다. Panax 인삼 잔류물을 모노당으로 전환시키기 위해 효소적 가수분해를 수행하였다. 설탕, 숙신산, 인삼다당류, 진세노사이드 등 다당류와 진세노사이드의 수율이 증가하였다[40]. Sophora flavescens 잔류물은 에틸 아세테이트로 초음파에 의해 재추출됩니다[41]. 허브 잔류물을 활용하기 위한 업데이트된 기술은 Huang et al. [42].

PLSR 및 BCA 결과를 기반으로, 가장 중요한 피크를 식별하기 위해 DPPH, 슈퍼옥사이드 음이온 및 하이드록실 라디칼 소거 분석을 사용하여 서로 다른 형태의 상위 5개 피크를 스크리닝했습니다. 결과는 벤 차트(그림 7)에 나와 있습니다. A2, A6, A8 및 A10은 슈퍼옥사이드 음이온 및 하이드록실 라디칼 소거 분석에서 HM, WE 및 HR(그림 7(a) 및 7(c))이 공유하는 공통 피크인 반면 HM, WE 및 HR은 DPPH 분석 피크를 공유하지 않습니다. 한편, BCA 모델은 A1, A2, A3 및 A6이 HM, WE 및 HR이 공유하는 공통 피크임을 보여줍니다(그림 7(d)–7(f)). 특히, Venn 다이어그램의 중첩은 BCA 모델이 PLSR 모델보다 더 적합해 보이며 전자가 더 많은 반복을 나타냄을 나타냅니다. BCA 모델 계수와 항산화 능력 IC50 값은 RDA를 통해 분석되었습니다. 그림 8에 표시된 RDA와 같이 HM 및 HR의 A1, A3 및 A6은 A3가 히드록실 라디칼 소거 능력과 음의 관계를 갖는 것을 제외하고는 항산화 지수와 양의 관계가 있습니다. WE의 A1 및 A6은 DPPH 및 슈퍼옥사이드 음이온과 강한 상관관계가 있습니다. 다양한 형태에서 확인된 A6 피크는 DPPH, 수퍼옥사이드 음이온 및 하이드록실 라디칼과 가장 강한 연결을 나타냅니다. A1과 A3도 비슷한 연관성을 보입니다.

그림 7

PLSR 및 BCA 모델의 벤 다이어그램: (a) DPPH 분석. (b) 청소 분석. (c) 소거 검정은 PLSR 모델에 의해 분석되었다. (d) DPPH 분석. (e) 소거 분석. (f) 스캐빈징 분석은 BCA 모델에 의해 분석되었다. 겹치는 부분은 HM, WE, HR의 공통 피크 샤드였습니다.

3.4. 네트워크 약리학 기반 분석

3.4.1. CT 네트워크 구축

GeneCards 데이터베이스와 OMIM 데이터베이스에서 항산화 활성과 관련된 총 4359개의 표적을 얻었습니다. 동시에 TCMSP 데이터베이스와 SwissTargetPrediction 데이터베이스에서 활성 구성 요소를 선별했습니다. 그런 다음 UniPort 데이터베이스를 통해 198개의 대상을 수집하고 표준화했습니다. 활성 성분과 항산화 관련 질병이 공유하는 159개의 표적 유전자가 있었습니다(그림 S1 참조). CT 네트워크는 화합물과 주요 유전자 표적 사이의 상관관계를 설명하기 위해 구성되었습니다(그림 9).

그림 9 CT 네트워크. 네트워크는 활성 구성 요소와 주요 유전자 표적 간의 상관 관계를 보여주었습니다.

3.4.2. PPI 네트워크 구축 및 핵심 대상 선별

PPI는 STRING 데이터베이스를 사용하여 시각화되었습니다(그림 10). 네트워크에는 159개의 노드와 2528개의 에지가 포함되었습니다. 전체 상호 작용 네트워크에서 연결 구성 요소 또는 더 많은 대상 지점이 있는 노드는 C. tubulosa에서 항산화 역할을 하는 핵심 구성 요소 또는 대상 유전자일 수 있습니다. 결과는 다운로드되어 시각화를 위해 Cytoscape에 도입되었습니다. DC 값이 높을수록 색상이 진해지고 합산 점수 값이 클수록 가장자리가 두꺼워집니다. 우리는 RAC-알파 세린/트레오닌-단백질 키나아제(AKT1), 인터루킨-6(IL6), 종양 괴사 인자(TNF) 및 혈관 내피 성장 인자 A(VEGFA)가 중앙에 위치한다는 것을 발견했습니다(그림 11). 활성 성분이 항산화 효과를 발휘할 때 핵심 표적임을 나타냅니다. 에치나코사이드는 MAPK(mitogen-activated protein kinases)와 AKT 및 이들의 인산화 형태의 조절을 통해 미토콘드리아 기능 장애를 감소시키는 것으로 보고되었습니다[43]. 연구자들은 C. tubulosa 배당체의 항당뇨병 효과가 IL-6 및 TNF-[44]와 같은 전염증성 사이토카인을 하향 조절함으로써 PhG의 항산화 활성 때문일 수 있다고 추측했습니다. 또한, 에키나코사이드는 VEGFA의 발현을 하향 조절하여 혈관 신생을 억제함으로써 난소암 세포 성장을 손상시킬 수 있으며[45], 이는 ROS가 VEGF 신호의 발현을 유도하는 ROS 시스템과 밀접하게 관련되어 있습니다[46].

그림 10 PPI 네트워크.

3.4.3. 농축 분석 및 CTP 네트워크 구축

잠재적인 항산화 화합물은 BP, CC 및 MF를 포함한 수많은 생물학적 기능에 작용했습니다. 그림 12(a)에는 상위 10개의 경로가 표시되어 있습니다. PPI 네트워크에서 예측된 대상은 주로 유기 고리 화합물, 생체이물 자극, 무기 물질, 산소 수준 및 세포 구성 요소 이동의 양성 조절과 같은 많은 생물학적 과정에 반응했습니다. 세포 성분 분석 결과 유전자는 주로 막 뗏목, 세포외 기질, 분비 과립 내강, 전사 조절인자 복합체 및 세포의 정단부와 관련이 있는 것으로 나타났다. 이러한 표적은 또한 DNA 결합 전사 인자 결합, 단백질 동종이량화 활성, 단백질 도메인 특이적 결합 및 사이토카인 수용체 결합을 비롯한 많은 분자 기능에 관여합니다.

그림 12 농축 분석: (a) GO 농축 분석. (b) KEGG 농축 분석.

이러한 주요 허브의 생물학적 기능을 조사하기 위해 경로 강화 분석이 수행되었습니다. KEGG 농축 결과에서 상위 20개 경로를 표시하기 위해 버블 다이어그램이 그려졌습니다. 반점이 클수록 더 많은 유전자가 경로에 포함되었습니다. 그림 12(b)에서 볼 수 있듯이 C. tubulosa의 주요 경로는 암, 지질 및 죽상경화증의 경로, 당뇨병 합병증의 AGE-RAGE 신호 경로, 화학적 발암-수용체 활성화 및 MAPK 신호 경로와 관련이 있었습니다. C. tubulosa가 세포사멸과 세포 산화환원 항상성에 미치는 영향을 조사하였다. 데이터는 C. tubulosa가 항결장암 치료의 유망한 후보가 될 수 있음을 시사합니다[47]. C. deserticola 추출물은 노인에게서 발견됩니다[48].

그림 13은 경로와 관련 표적 사이의 상관 관계와 중첩 표적 유전자와 C. tubulosa의 생물학적 활성 성분 사이의 관계를 보여줍니다. 12개의 성분, 159개의 표적 및 20개의 경로로 구성된 CTP 네트워크의 전체적인 관점이 생성되었습니다. 대부분의 표적은 후보 활성 화합물에 의해 공유되었습니다. 상호 연결도가 높은 이러한 후보 활성 성분은 CTP 네트워크, 특히 퀘르세틴(= 131도)의 높은 상호 연결성을 담당했습니다. AKT1, IL6, TNF 및 VEGFA와 같은 대부분의 표적은 암의 경로와 관련된 KEGG 경로에 매핑되었습니다.

그림 13 CTP 네트워크.

4. 결론

본 연구에서는 주로 HM, WE, HR 사이의 스펙트럼 효과 관계를 고려할 때 복잡한 상황을 조사했습니다.C. tubulosa. HPLC 지문 및항산화 분석의 Hs, WEs 및 HR 간의 차이점을 식별하는 데 사용되었습니다.C. tubulosa. HPLC 지문에 따르면 Hs, WEs 및 HR의 11개 배치에서 11개의 피크가 공통적으로 나타났습니다. 게니포시드산,에키나코사이드, 버바스코사이드, 튜불로시드 A, 그리고아이소액티오사이드이 봉우리들 사이에서 확인되었습니다. 이 다섯 가지 구성 요소의 내용이 결정되었습니다. 또한, 항산화 효과는C. tubulosaHs, WEs 및 HRs는 복잡한 제조 조건으로 인한 화학 조성의 변화로 인해 다양했습니다. 다양한 통계 모델을 기반으로 한 스펙트럼 효과 관계 연구는 피크 A6가 세 가지 형태의C. tubulosa. 이 연구는 네트워크 약리학을 기반으로 잠재적 메커니즘을 탐색했습니다.C. tubulosa~에항산화화합물 스크리닝, 핵심 타깃 예측, 네트워크 구축, 농축 분석을 통해 우리의 결과는 허브 잔류물을 재활용하기 위한 이론적 근거와C. tubulosa의 치료에서항산화 관련 질병.