ACKR4a는 자가포식을 유도하여 NF-kB 신호 전달 및 세포사멸을 차단하여 Vibrio Harveyi 감염을 촉진합니다

요약

Autophagy와 apoptosis는 박테리아 침입에 대한 저항성의 두 가지 알려진 메커니즘입니다. 그러나 박테리아도 마찬가지로 면역을 회피하는 능력을 진화시켰습니다. 이 연구에서 우리는 비정형 케모카인 수용체 계열의 구성원인 ACKR4a를 NF-kB 경로의 억제제로 식별합니다. 이는 Beclin-1과 협력하여 자가포식을 유도하여 NF-kB 신호 전달을 억제하고 세포사멸을 차단합니다. 비브리오 하베이 감염. 기계적으로 V. harveyi에 의해 유도된 Ap-1는 ACKR4a 전사 및 발현을 활성화합니다. ACKR4a는 각각 Beclin-1 및 MyD88과 복합체를 형성하여 자가포식을 유도하고 MyD88을 리소좀으로 운반하여 분해하여 염증성 사이토카인 생성을 억제합니다. 한편, ACKR4a에 의해 유도된 자가포식은 카스파제8을 억제함으로써 세포사멸을 차단합니다. 이 연구는 V. harveyi가 선천성 면역을 회피하기 위해 자가포식과 세포사멸을 모두 사용한다는 사실을 처음으로 입증했으며, 이는 V. harveyi가 어류 면역에 대항하는 능력을 진화시켰음을 시사합니다. 

cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.

소개

면역 체계는 일반적으로 선천성 면역과 후천성 면역으로 구분되며, 대부분의 유기체는 생존을 위해 주로 선천성 면역에 의존합니다.1 선천성 면역은 유기체에서 형성되는 방어 메커니즘입니다. 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 인식하고 병원성 감염에 신속하게 반응하며 감염으로부터 숙주를 보호합니다.2,3 중요한 PRR로서 Toll-like Receptor(TLR) 식세포작용에서 사이토카인 생성에 이르기까지 광범위한 반응을 시작할 수 있으므로 염증 및 선천적 면역 반응을 더욱 강화할 수 있습니다.4 대부분의 경우 TLR은 주로 MyD88-의존 경로를 통해 신호를 보냅니다. 이 경로는 연쇄 반응을 통해 신호를 전달하여 핵을 활성화합니다. Factor-kappa B(NF-kB).5 NF-kB는 선천성 면역이 시작되는 핵심 요소 중 하나로 염증 반응, 선천성 면역, 세포 분화, 증식 및 생존의 조정에 필수적이며, 염증 반응의 주요 개시자로 간주됩니다.6 박테리아가 숙주를 감염시키면 사이토카인, 케모카인과 같은 선천성 면역 반응의 하류 효과인자가 합성되어 궁극적으로 염증 반응을 일으켜 박테리아의 성장을 차단합니다. 그러나 박테리아는 숙주와의 공진화 과정에서 숙주의 방어를 회피하고 전복시키기 위한 다양한 조절 전략도 개발했습니다.

자가포식과 세포사멸은 박테리아 침입에 대한 두 가지 중요한 경로로 생각됩니다.7 자가포식은 분해를 위해 비정상적인 단백질을 리소좀으로 운반하는 보존적 과정이며 박테리아 침입에 대한 진핵생물의 선천적 면역에 중요한 역할을 합니다.8,9 그러나 일부 박테리아는 포유류에서 자가포식을 이용해 면역을 회피합니다. 일반적으로 세포는 자가포식을 통해 침입한 세포외 박테리아와 세포질에 집락을 형성하는 박테리아를 제거하는 것을 목표로 하지만10 일부 박테리아는 자가 성장과 재생산을 완료하기 위해 자가포식을 '강탈'할 수 있습니다.11-13 예를 들어, 키나아제 1과 같은 Unc-51- (ULK1), Beclin1, 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3) 및 자가포식 관련 단백질(ATG)은 협력하여 자가포식소체를 형성하며, 이는 침입하는 미생물을 캡슐화하고 분해를 위해 리소좀으로 운반합니다.14-16 그러나 결핵균은 감소합니다. -Beclin-1을 조절하여 자가포식소체 형성을 방지하고, 궁극적으로 자가포식을 억제하고 감염을 촉진합니다.17 자가포식소체 형성을 억제하는 것과 대조적으로 일부 박테리아는 자가포식소체를 사용하여 자가 복제 부위를 완성하여 증식을 촉진합니다.11,18 자가포식과 마찬가지로 세포사멸은 침입하는 병원체에 대한 숙주 방어 수단이기도 합니다.7 세포사멸은 전신 환경의 안정성을 유지하기 위해 손상된 세포를 제거하는 데 사용되는 세포 사멸 패턴입니다.19 박테리아 침입 신호를 받으면 숙주는 감염된 세포의 세포사멸을 유도합니다. 세포는 박테리아 감염을 억제합니다.20 따라서 성공적인 박테리아 집락화는 세포사멸을 예방하고 박테리아 복제를 보호하는 능력에 달려 있습니다. 예를 들어, Edwardsiella tarda는 제브라피시 ZF4 세포 감염 후 세포사멸을 억제하여 생존을 보장하고, Shigella는 세포사멸을 억제하여 성공적인 집락화를 달성하며, 그룹 A 연쇄상구균(GAS)이 생산한 S 단백질은 적혈구 막에 결합하여 숙주 면역의 검출을 회피합니다. system.23 많은 박테리아가 면역을 회피하는 능력을 진화시킨 것으로 입증되었지만 해양 병원체에 대한 보고도 몇 가지 있습니다. Vibrio harveyi는 Vibrionaceae과에 속하며 해양 어류의 고병원성 병원체로 알려져 있습니다. 이는 위장염, 근육 괴사, 피부 궤양을 유발하며 해양 어류 폐사의 주요 원인 중 하나입니다.24

시스탄체 식물의 면역 체계 증가

자가포식과 세포사멸을 제외하고 일부 박테리아(예: 황색포도상구균)는 면역을 회피하기 위해 숙주의 케모카인 수용체를 사용할 수도 있습니다.25 케모카인 수용체는 주로 백혈구 표면에서 발견되는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)입니다. 여기에는 리간드 결합 및 신호 전달에 관여하고 면역 및 염증 반응의 시작 및 유지에 중요한 역할을 하는 7개의 막횡단 구조가 포함되어 있습니다.26 케모카인 연구가 진행되면서 비정형 케모카인 수용체(ACKR)가 발견되었습니다.27 다른 케모카인 수용체와 구조적으로 유사하고 리간드를 내재화할 수 있지만 '침묵 수용체'라고도 불리는 DRYLAIV 도메인이 부족하여 신호 전달 경로를 활성화할 수 없습니다.28 ACKR의 기능은 다음과 같은 방식으로 반영될 수 있습니다. : 1. 이들은 케모카인에 결합하기 위해 일반적인 수용체와 경쟁할 수 있으며 이를 통해 세포 주화성의 신호 전달을 조절할 수 있습니다. 2. 케모카인을 세포에 내재화함으로써 환경 내 케모카인의 농도가 감소되어 세포 모집에 영향을 미치고 케모카인 제거제 역할을 합니다. 3. 이들은 케모카인이 간질 세포 장벽을 통해 세포 간 수송을 완료하도록 돕습니다.29 주로 DARC,30 D6 31,32, CXCR7,33 및 CCRL1,34를 포함하는 ACKR 계열 CCRL1은 비정형 케모카인 수용체로도 알려져 있습니다. 4(ACKR4). 현재 일부 연구에서는 ACKR4가 G 단백질 독립 경로를 통해 신호 전달을 실현하는 것으로 보이며35-37 염증 및 면역 반응을 조절하는 데 중복되지 않는 역할을 하는 것으로 나타났습니다.38 적응 면역에서의 역할은 잘 알려져 있지만 선천면역의 기능은 거의 연구되지 않습니다.

선천성 면역에서 TLR 경로의 신호 전달은 무척추동물에서 포유류까지 고도로 보존되어 있습니다. TLR 신호 전달의 핵심 단백질인 MyD88은 척추동물에서 널리 연구되어 왔습니다. 또한 MyD88의 고도로 보존된 구조로 인해 어류의 상동체는 포유류의 기능과 유사한 기능을 가질 수 있습니다.39,40 제브라피시에서 MyD88은 박테리아 감염 제거에 관여합니다.41 이전 연구에서도 V. harveyi는 MyD88.42의 신호 전달을 파괴하여 면역을 회피합니다. 그러나 V. harveyi가 면역을 회피하는 메커니즘은 경골어류에서 제대로 이해되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이 연구에서 ACKR4a는 V. harveyi로 자극된 Miichthys muy에서 빠르게 상향조절되었습니다. 상향 조절된 ACKR4a는 자가포식을 유도하여 MyD{13}}매개 NF-kB 경로를 차단하고 자가포식을 유도하여 세포사멸을 차단하여 V. harveyi 감염을 강화함으로써 선천적 면역을 억제했습니다. 우리가 아는 한, 이 보고서는 V. harveyi가 선천성 면역을 회피하기 위해 자가포식과 세포사멸을 모두 사용하는 것으로 밝혀진 최초의 보고서입니다.

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결과

V. harveyi 감염은 ACKR4a 발현을 유도하여 자기 증식을 촉진합니다

V. harveyi 감염 조절에 잠재적으로 관여하는 유전자를 확인하기 위해 우리는 miiuy harveyi를 V. harveyi로 48시간 동안 처리한 다음 RNA-seq 분석을 사용하여 V. harveyi 처리된 것과 처리되지 않은 것 사이의 다양한 발현 유전자(DEG)를 스크리닝했습니다. 비장 샘플. 심층 시퀀싱 데이터에서 우리는 상향 조절된 유전자 145개와 하향 조절된 유전자 28개를 식별했습니다(그림 1A). 이를 바탕으로 우리는 클러스터링 히트맵을 위해 가장 큰 10개 DEG와 최소 10개의 DEG(접기 변화의 log2는 1.0)를 선택했으며 그 결과 V. harveyi 처리 샘플과 처리되지 않은 샘플 모두의 해당 샘플이 잘 복제되었음을 보여주었습니다(그림 1B) . ACKR4a mRNA를 조사한 결과 V. harveyi 감염 후 M 음악 뇌에서 높게 발현되는 것으로 나타났습니다 (그림 S1A). 따라서 M. muiiy 뇌 세포주(MBrC)를 후속 실험에 사용했습니다. MBrC에서 ACKR4a-si1의 녹다운 효율은 46.1%이고 ACKR4a-si2는 63.7%이므로(그림 S1B), ACKR4a-si2(ACKR4a-si로 명명)는 후속 실험에 사용되었습니다. 그 후, 우리는 면역 기능을 가질 수 있는 유전자 ACKR4a에 초점을 맞추었고, 집락 형성 단위(CFU) 분석 결과 ACKR4a가 V. harveyi 증식을 촉진하는 것으로 나타났습니다(그림 1C, 1D 및 S1C). ACKR4a가 V. harveyi 증식을 촉진하는 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 ACKR4a의 발현 패턴을 분석했습니다. MBrC 세포의 ACKR4a는 V. harveyi에 의해 조절되었습니다. 결과는 mRNA와 단백질 수준 모두에서 V. harveyi 감염에 대한 시간 의존적 방식을 보여주었습니다(그림 1E 및 1F). 또한, ACKR4a 침묵은 mRNA와 단백질 수준 모두에서 ACKR4a의 발현을 효과적으로 억제했습니다(그림 1E 및 1G). 위의 결과는 ACKR4a의 상향 조절이 V. harveyi 감염을 촉진할 수 있음을 나타냅니다.

그림 1. V. harveyi가 유도한 ACKR4a는 자가 증식을 촉진합니다.

ACKR4a는 V. harveyi에 의해 유발된 NF-kB 신호 전달을 억제합니다 

우리는 MBrC가 V. harveyi에 감염되었을 때 세포 증식 속도가 영향을 받는다는 것을 발견했으며, 이 발견을 확인하기 위해 세포 증식 분석을 수행했습니다. 결과는 V. harveyi 감염이 MBrC의 증식을 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 S1D). 후속 실험에서는 ACKR4a의 과발현이 세포 증식을 감소시키는 반면, ACKR4a 침묵은 세포 증식을 향상시키는 것으로 확인되었습니다(그림 2A 및 S1E). 여러 연구에서 NF-kB의 활성화가 세포 증식을 촉진한다는 것이 입증되었습니다. NF-kB 억제제인 ​​BAY 11-7082도 MBrC의 증식을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났습니다(그림 2A 및 S1E). 이전 보고서와 유사하게 NF-kB-luc의 증가는 시간에 따라 V. harveyi 감염과 관련이 있었습니다(그림 S1F).

그림 2. ACKR4a는 V. harveyi에 의해 유발된 NF-kB 신호 전달을 억제합니다.

V. harveyi에 의해 유발된 NF-kB 신호 전달에 대한 ACKR4a의 효과를 추가로 확인하기 위해 루시퍼라제 리포터 분석을 수행했습니다. ACKR4a는 V. harveyi 및 LPS에 의해 유발된 NF-kB 루시퍼라제 활성을 유의하게 억제했습니다. V. harveyi에 의해 유발된 IL{8}}b 및 TNFa 루시퍼라제 활성도 ACKR4a에 의해 억제되었습니다(그림 2B-2D). 내인성 ACKR4a는 선천성 면역에서의 역할을 검증하기 위해 침묵되었습니다. 그런 다음 p65 및 전염증성 사이토카인(IL-1b 및 TNFa)의 발현 패턴이 추가로 검출되었으며, ACKR4a 침묵은 p65 mRNA, IL{18}}b mRNA 및 TNFa mRNA를 대폭 증가시켰습니다(그림 2E-2G). ). MLC 및 MKC의 결과는 또한 ACKR4a가 NF-kB 신호 전달을 억제할 수 있음을 나타냅니다(그림 S1G-S1J). ELISA 결과도 비슷했습니다. ACKR4a 침묵은 TNFa를 크게 증가시켰고 ACKR4a 과발현은 TNFa를 억제했습니다(그림 2H). NF-kB의 활성화를 평가하기 위해서는 음역된 형태, 즉 인산화된 NF-kB를 분석하는 것이 더 필요하며, 이는 표적 유전자에 대한 NF-kB 활성의 척도입니다. NF-kB가 자극되면 p65는 인산화되어 핵으로 들어가 염증성 사이토카인의 전사를 조절합니다. ACKR4a에 의한 p65 인산화 조절을 탐색하기 위해 우리는 ACKR4a 침묵 및 면역 블롯에 의한 ACKR4a 과발현 후 p65의 인산화 수준을 측정했습니다. V. harveyi 감염은 p65 인산화를 강화시켰으며, 이는 V. harveyi가 NF-kB를 효과적으로 활성화한다는 것을 입증했습니다. 이를 바탕으로 ACKR4a 침묵은 p65 인산화를 향상시키는 반면 ACKR4a 과발현은 p65 인산화를 감소시켜 ACKR4a가 NF-kB 신호 전달의 억제제임을 나타냅니다 (그림 2I 및 2J). 제브라피시에서 ACKR4a의 녹다운은 p65의 인산화를 증가시켰습니다. 또한 CFU 분석에서는 BAY 11-7082가 MBrC의 증식을 크게 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 2K). 전반적으로, 이러한 데이터는 ACKR4a가 V. harveyi 감염 동안 선천적 면역을 억제하는 NF-kB 신호 전달의 음성 조절자로서 기능한다는 것을 시사합니다.

그림 3. ACKR4a는 MyD88과 상호작용하고 자가포식에서 MyD88 분해 촉진제

ACKR4a는 MyD88과 상호 작용하고 자가포식 분해를 위해 MyD88을 촉진합니다.

다음으로, 우리는 NF-kB 신호의 어떤 표적이 ACKR4a0의 억제 기능을 중재하는지 확인하려고 했습니다. NF-kB-루시퍼라제 리포터 분석은 ACKR4a의 과발현이 MyD88에 의해 용량 의존적으로 유도된 루시퍼라제 활성의 감소를 유발한다는 것을 보여주었습니다(그림 3A). 그러나 ACKR4a의 과발현은 TRAF6 또는 TAK1에 의해 구동되는 루시퍼라제 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다(그림 3B 및 3C). 면역블롯 결과는 루시퍼라제 리포터 분석과 유사했습니다. ACKR4a의 과발현은 MyD88을 용량 의존적으로 억제했지만 TRAF6 및 TAK1에는 효과가 없었습니다(그림 3D). 이러한 결과는 ACKR4a가 MyD88 수준에서 작동함을 시사합니다.

TLR3을 제외한 모든 포유동물 TLR은 적어도 부분적으로 MyD88 어댑터에 의존하여 신호를 전송하며, 이는 MyD88의 직접적인 조절을 더욱 효과적으로 만듭니다.44 그런 다음 V. harveyi 감염의 여러 시점에서 MyD88의 발현을 조사한 결과 ACKR4a 침묵이 발견되었습니다. MyD88의 발현이 향상되었고(그림 3E), ACKR4a 과발현은 시간에 따라 MyD88 발현을 억제했습니다(그림 3F). 흥미로운 결과는 ACKR4a 침묵이 V. harveyi에 의해 유발된 MyD88 발현을 향상시켰음에도 불구하고 세포가 쉬고 있을 때 이러한 향상은 존재하지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 3G 및 3H). MyD88- 매개 NF-kB 신호 전달에서 ACKR4a의 작용을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 우리는 ACKR4a가 MyD88과 상호 작용하는지 확인하기 위해 Co-IP(공동 면역 침전) 분석을 수행했습니다. Flag-ACKR4a는 Myc-MyD88로 면역침전될 수 있습니다(그림 3I 및 S1K). 이에 따라 우리는 Flag-MyD88이 내인성 ACKR4a와 상호 작용할 수 있음을 발견했습니다(그림 3J). 후속 세포 내 위치 확인 실험에서는 ACKR4a가 MyD88과 유의미한 공동 위치를 나타내지 않는 것으로 나타났습니다(그림 S1L). 따라서 이러한 발견은 ACKR4a가 MyD88과 물리적으로 상호작용하고 이들의 상호작용이 세포질에서 발생할 가능성이 높다는 개념을 뒷받침합니다. 다음으로 우리는 ACKR4a가 MyD88 발현을 억제하는 메커니즘을 조사했습니다. 자가포식-리소좀 의존성 분해 경로의 억제제인 ​​NH4Cl 또는 3-메틸아데닌(3-MA)은 ACKR4a 존재 시 MyD88의 상당한 축적을 초래했으며 MG132는 MyD88의 분해에 영향을 미치지 않았습니다. MyD88(그림 3K). 더욱이, 유사한 결과는 3-MA 및 NH4Cl이 용량 의존적 방식으로 MyD88 분해를 유의하게 차단한다는 것을 보여주었습니다(그림 3L 및 3M). 이러한 발견은 자가포식을 차단하면 ACKR4a 표적 MyD88 분해를 효과적으로 방지할 수 있음을 시사하는 것 같습니다. 자가포식 플럭스는 자가포식 활동의 신뢰할 수 있는 지표인 자가포식의 동적 과정을 나타냅니다. GFP 형광은 리소좀에서 소멸되기 때문에 자가포식 단계는 GFP와 RFP의 형광으로 판단할 수 있습니다.42 Merge 패널에서 노란색 형광을 관찰한 결과 ACKR4a가 있을 때 더 많은 빨간색 형광이 나타났습니다. 이는 ACKR4a가 GFP의 융합을 촉진했음을 나타냅니다. 자가포식소체 및 리소좀; 자가포식 억제제인 ​​클로로퀸(CQ)은 자가포식소체와 리소좀의 융합을 방지하여 더 많은 노란색 형광을 나타냈습니다(그림 3N). ACKR4a가 자가포식 분해를 위해 MyD88을 표적으로 한다는 것을 추가로 검증하기 위해 리소좀 국소화 분석을 수행했습니다. MyD88(녹색)과 리소좀(빨간색)은 MBrC 세포에 공동 국소화되었으며(그림 3O), 이는 MyD88이 리소좀으로 운반되었음을 시사합니다. 종합하면, 이러한 결과는 ACKR4a가 MyD88과 상호작용하고 자가포식 분해를 위해 MyD88을 표적으로 삼는다는 것을 시사합니다.

그림 4. ACKR4a는 Beclin을 통해 자가포식 조절에 참여합니다-1

ACKR4a는 Beclin을 통해 자가포식 조절에 참여합니다-1

일부 박테리아는 성장과 감염을 촉진하기 위해 자가포식을 사용하며, 자가포식이 없으면 복제가 감소합니다.13 V. harveyi가 MBrC 세포의 자가포식 조절에 참여하는지 여부를 테스트하기 위해 세포를 V. harveyi에 감염시킨 후 발현 패턴을 확인했습니다. LC3를 조사했습니다. MBrC 세포에서 V. harveyi 노출은 GFP-LC3 puncta의 축적으로 표시된 대로 자가포식을 증가시켰으며, 이는 V. harveyi 감염의 시간에 따른 증가를 동반했습니다(그림 4A). ACKR4a 과발현은 V. harveyi 유발 autophagy를 크게 감소시킨 ACKR4a 침묵과 대조적으로 RFP-LC3의 점점 축적의 현저한 증가로 볼 수 있듯이 V. harveyi 유발 autophagy를 향상시켰습니다(그림 4B 및 4C). 또한, ACKR4a 침묵으로 인해 V. harveyi 유발 LC{16}}II 발현이 감소했습니다(그림 4D).

ULK1, Beclin-1 및 ATG5는 자가포식의 주요 조절 단백질이었습니다. qPCR 결과에 따르면 ACKR4a는 Beclin-1의 발현을 크게 향상시켰지만 ULK1 및 ATG5는 그렇지 않았습니다(그림 4E). ULK1, ATG5 및 Beclin-1의 루시퍼라제 리포터 분석에서는 ACKR4a의 과발현이 Beclin-1루시퍼라제 활성만 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 4F). 다음으로 우리는 ACKR4a의 과발현이 Beclin-1의 발현을 향상시켰지만 ULK1 및 ATG5의 발현은 향상시키지 않았음을 확인했습니다(그림 4G). 또한 ACKR4a에 의해 유발된 자가포식은 Beclin-1-si에 의해 억제된 반면, ATG5-si는 부분적인 억제만 나타냈습니다(그림 4H). 위의 결과는 ACKR4a가 Beclin-1을 표적으로 삼았음을 나타냅니다. 따라서 ACKR4a가 매개하는 MyD88의 자가포식 분해에서 Beclin-1의 기능과 메커니즘이 조사되었습니다. V. harveyi에 감염된 zebrafish에서 ACKR4a의 녹다운은 ULK1에서 큰 변화를 가져오지 않았지만 Beclin{32}} 및 ATG5를 크게 감소시켰습니다(그림 S2B-S2D). Beclin-1은 Baf1A 및 CQ 처리를 통해 ACKR4a 유발 자가포식 플럭스를 더욱 강화했으며(그림 4I), Beclin-1은 ACKR4a에 의한 MyD88의 분해를 강화했습니다(그림 4J). 그런 다음 ACKR4a가 Beclin-1과 상호작용하는지 확인하기 위해 Co-IP 분석을 수행했으며 ACKR4a가 Beclin-1과 상호작용하고 V. harveyi 감염이 ACKR4a와 Beclin{{51 }}(그림 4K). 리소좀 국소화 분석은 ACKR4a가 리소좀과 자가포식소체 융합을 향상시키는 것으로 나타났습니다(그림 4L). 그 후, ACKR4a는 내인성 Beclin-1 발현을 증가시키고(그림 4M), ACKR4a 침묵은 V. harveyi가 유도한 Beclin-1 발현을 약화시킵니다(그림 4N). 또한, Beclin-1 침묵은 V. harveyi에 의해 유발된 p65의 인산화를 강화했으며, 이는 V. harveyi가 자가포식을 유도하여 NF-kB 신호를 부정적으로 조절한다는 것을 추가로 시사합니다(그림 4O). 우리는 다음으로 V. harveyi 감염, 특히 V. harveyi 증식 제어에서 Beclin-1의 생물학적 중요성을 확인하려고 했습니다. CFU 분석을 수행한 결과 Beclin-1 침묵과 CQ 차단 자가포식 모두 V. harveyi의 증식을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이는 V. harveyi가 자가포식을 활용하여 증식을 촉진한다는 것을 증명합니다(그림 4P). 위의 결과는 ACKR4a가 Beclin-1과 복합체를 유도하고 형성하여 자가포식을 촉진하고 V. harveyi 감염을 촉진한다는 것을 함께 보여줍니다.

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ACKR4a는 자가포식을 유도하여 세포사멸을 차단했습니다.

Autophagic 세포 사멸은 apoptosis에 대한 합리적인 대안으로 간주되며 apoptosis는 또한 알려진 항균 메커니즘입니다. 성공적인 박테리아 감염은 세포사멸을 억제함으로써 자가 복제를 완료합니다. V. harveyi에 의해 유발된 자가포식과 세포사멸 사이의 관계를 확인하기 위해 V. harveyi 감염 전후에 다양한 처리를 통해 MBrC 세포의 세포사멸이 결정되었으며 ACKR4a 침묵은 V를 증가시켰습니다. harveyi에 의한 세포사멸(그림 5A 및 5B, 왼쪽 패널). caspase3과 caspase7은 세포사멸의 시작에 중요하기 때문에 세포사멸의 신뢰할 수 있는 지표로 널리 받아들여지고 있습니다. 카스파제 Glo 3/7 분석은 ACKR4a 과발현이 V. harveyi에 의해 유도된 카스파제3/7 활성을 억제하는 반면, ACKR4a 침묵은 V. harveyi에 의해 유도된 카스파제3/7 활성을 향상시키는 것으로 나타났습니다(그림 5B, 오른쪽 패널). V. harveyi 및 외인성으로 첨가된 재조합 활성 caspase8 유도 caspase3/7 활성은 ACKR4a에 의해 억제되었으며(그림 5C), 이는 ACKR4a가 세포사멸 신호 전달을 효율적으로 차단할 수 있음을 시사합니다. ACKR4a에 의한 자가포식(autophagy)이 입증되었지만, 세포사멸을 차단하는 자가포식의 역할을 조사하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 그림 5D에서 볼 수 있듯이 ACKR4a 침묵은 효과기 카스파제(caspase7)와 개시자 카스파제(caspase8)를 크게 증가시켰습니다. 또한, ACKR4a 과발현은 caspase7 및 caspase8 mRNA를 억제했으며(그림 5E), ACKR4a 녹다운은 zebrafish에서 caspase7 및 caspase8을 크게 증가시켰습니다(그림 S2E 및 S2F). 이전 연구에서는 Beclin-1이 세포사멸과 자가포식 과정을 중재하는 분자 스위치라는 사실이 밝혀졌습니다. 따라서 세포사멸 조절에 Beclin-1이 관여하는지가 조사되었습니다. 우리 연구에서 Beclin-1 과발현은 V. harveyi 유도 caspase8을 하향 조절하는 반면, Beclin-1은 V. harveyi 유도 caspase8을 상향 조절했습니다(그림 5F). 흥미로운 결과는 V. harveyi 감염 3시간에 caspase8이 유의하게 상향조절된다는 사실을 발견했습니다. 이는 감염 기간이 증가함에 따라 다시 억제되었으며, LC{55}}II는 caspase8과 음의 상관관계가 있었습니다(그림 5G). 위 결과에 따르면, ACKR4a는 자가포식을 유도하여 세포사멸 신호를 차단하고 V. harveyi 감염을 촉진했으며 Beclin-1은 자가포식 및 세포사멸의 연쇄 과정에서 잠재적인 표적이 될 수 있습니다.

그림 5. ACKR4a는 자가포식을 유도하여 세포사멸을 차단합니다.

Ap-1는 V. harveyi 감염에서 ACKR4a에 의한 자가포식을 향상시킵니다.

이어서, V. harveyi 감염에 의해 유발된 ACKR4a 발현의 메커니즘을 조사하였다. 4개의 서로 다른 ACKR4a 프로모터 플라스미드가 프로모터 예측 서열에 따라 먼저 구성되었습니다(그림 6A). 루시퍼라제 분석 결과 ACKR4a-p-3 활성이 가장 높은 것으로 나타났습니다(그림 6B). V. harveyi 감염 중 ACKR4a 발현의 업스트림 활성제를 확인하기 위해 ACKR4a의 프로모터 영역을 분석한 결과 ACKR4a에 Sp-1 및 Ap-1의 잠재적 결합 사이트가 있음이 확인되었습니다(그림 6C). ACKR4a-luc 분석에서는 Sp-1가 루시퍼라제 활성을 향상시킬 수 없고 Ap{17}}가 루시퍼라제 활성을 향상시키는 것으로 나타났습니다(그림 6D 및 6E). 이는 ACKR4a가 Ap의 직접적인 표적이 될 수 있는 가능성을 높였습니다. -1. 이를 조사하기 위해 돌연변이 ACKR4a로 구성된 두 개의 루시퍼라제 벡터를 구축했습니다(그림 6F). 루시퍼라제 분석은 Ap-1 결합 부위가 결여된 돌연변이가 야생형과 대조적으로 루시퍼라제 활성을 억제한다는 것을 보여주었습니다(그림 6G). Ap-1가 ACKR4a 발현을 촉진하는지 확인하기 위해 과발현 또는 녹다운을 통해 Ap-1의 발현을 침묵시키거나 강화했으며, ACKR4a 발현은 형질감염된 MBrC 세포에서 평가되었습니다. Ap-1 침묵은 V. harveyi에 의해 유발된 ACKR4a 발현(그림 6H)을 크게 감소시킨 반면, Ap-1 과발현은 ACKR4a 발현을 크게 향상시켰습니다(그림 6I). 면역블롯 결과는 qPCR 결과와 일치했으며, Ap{38}} 과발현은 ACKR4a의 발현을 증가시킨 반면, Ap-1 침묵은 ACKR4a의 발현을 감소시켰습니다(그림 6J). ChIP 분석에 따르면 Ap-1는 정상적인 생리학적 조건에서 MBrC 세포의 ACKR4a 프로모터에 결합하고 V. harveyi 자극은 Ap-1와 ACKR4a 프로모터의 결합을 향상시키는 것으로 나타났습니다(그림 6K). 위의 결과는 ACKR4a가 Ap-1의 잠재적인 전사 표적임을 확인시켜 주었습니다. 그런 다음 자가포식에서 Ap-1의 기능을 탐구했습니다. Ap-1 침묵은 V. harveyi 감염으로 인한 GFP-LC3 축적을 효과적으로 감소시켰으며(그림 6L), V. harveyi 감염으로 인한 LC3-II의 상향 조절도 약화시켰습니다(그림 6M). ). CFU 분석은 V. harveyi 감염에서 Ap-1의 역할을 탐색하기 위해 수행되었으며 AP-1가 V. harveyi 증식을 촉진한다는 사실을 발견했습니다(그림 6N). 종합하면, 위의 결과는 Ap-1가 ACKR4a 전사 및 발현을 활성화하고 V. harveyi 감염에 기여한다는 것을 나타냅니다.

그림 6. V. harveyi 감염에서 Ap-1 강화된 ACKR4a 유도 자가포식

그림 7. ACKR4a가 V. harveyi 감염을 촉진하는 방법에 대한 작업 모델

논의

ACKR은 케모카인 시스템 조절, 케모카인 리간드 내재화, 세포 내 분해 및 염증 반응과 같은 여러 생물학적 과정에 관여하는 것으로 나타났습니다. 이는 적응 면역뿐만 아니라 선천성 면역 시스템의 중요한 구성 요소로도 중요합니다. .33,34 그러나 어류의 박테리아 감염에 대한 염증 반응에서 ACKR의 역할은 조사되지 않았습니다. 이 연구는 ACKR 계열의 구성원인 ACKR4a가 자가포식 및 세포사멸을 통해 경골어류에 대한 V. harveyi의 감염을 촉진한다는 것을 처음으로 보여줍니다. 기계적으로 ACKR4a의 전사는 전사 인자 AP-1에 ​​의해 상향 조절되었습니다. 그런 다음 상향 조절된 ACKR4a는 Beclin{10}}과 시너지 효과를 발휘하여 자가포식을 유도하고 분해를 위해 MyD88을 리소좀으로 운반했습니다. 한편, ACKR4a는 자가포식을 유도하여 세포사멸을 차단한 다음 V. harveyi 감염을 촉진합니다(그림 7). 선천성 면역은 내인성 및 외인성 병원성 침입으로부터 진핵생물을 보호하는 데 중요한 역할을 합니다.46 미생물에 장기간 노출된 결과, 어류는 감염으로부터 보호하기 위해 더욱 최적화된 선천성 면역이 진화했습니다.47 TLR은 박테리아 감염이 발생할 때 PAMP를 인식하고, 그리고 박테리아 감염을 제거하기 위해 전염증성 사이토카인의 생성을 유도하는 MyD88-의존적이고 독립적인 경로를 통해 선천적인 면역 반응을 시작했습니다. MyD88은 TLR 신호 전달에 필수적인 어댑터이며, TLR3을 제외하고 모든 포유류 TLR은 MyD88을 활용하여 NF-kB 신호 전달을 활성화합니다. 따라서 MyD88을 직접 조절하는 것이 가장 효과적일 수 있습니다. 예를 들어, S-1-아세틸시스테인은 MyD88의 분해를 유도하여 IL-6 생성을 억제합니다. 유사하게, 어류에서 IRF3 및 eIF3k는 MyD88을 표적으로 하여 NF-kB 신호 전달을 억제하는 것으로 보고되었습니다.42,49 또한 축적된 증거에 따르면 MyD88이 박테리아 감염 제거에 중요하다는 것이 시사되었습니다. 예를 들어, MyD88-결핍 마우스는 박테리아 성분을 인식할 수 없었고 S. aureus에 매우 취약했습니다. 50 또한, MyD88은 제브라피시에서 박테리아 감염 제거에도 관여하는 것으로 나타났습니다.41 선천성 면역 체계의 활성화는 주요 선택압을 구성하는 박테리아 제거를 촉진하여 선천성 면역을 억제하는 능력을 진화시키도록 촉진합니다. .51,52 살모넬라균이 숙주 세포를 감염시킨 후 면역 반응을 조절하고 염증 반응을 조작할 수 있다는 것이 입증되었습니다. 살모넬라 독성 SpvC는 ERK, p38 및 MAPK를 비가역적으로 탈인산화하여 전염증성 사이토카인의 전사를 억제합니다.53 이 연구에서 V. harveyi에 감염된 M. miiuy에서 상향 조절된 ACKR4a는 MyD88과 결합되어 p65 인산화를 억제했습니다. NF-kB 신호를 차단합니다. 이는 박테리아가 면역 회피를 목적으로 TLR 신호 전달에서 어댑터의 안정성을 방해함으로써 물고기의 선천적 면역을 억제할 수도 있음을 시사합니다.

Autophagy와 apoptosis는 박테리아 침입에 대한 저항성의 두 가지 메커니즘으로 인식되며, 항균성 autophagy는 침입하는 미생물에 대한 장벽이 됩니다. PRR은 숙주-박테리아 접촉의 다양한 단계에서 자가포식을 유도하고 박테리아의 세포내 성장을 억제할 수 있습니다.54 반대로 박테리아는 자가포식을 예방, 퇴치 또는 명령하는 효율적인 메커니즘도 진화했습니다. 이러한 메커니즘에는 종종 Beclin{2}}을 표적으로 삼아 자가포식을 차단하고55 자가포식소체의 성숙을 방지하며56 경우에 따라 자가포식을 활성화하여 박테리아 성장을 위한 영양분을 제공하는 일이 포함됩니다.57 이와는 다르게 우리는 V. harveyi가 Beclin을 유발한다는 것을 발견했습니다{{6} } 자가포식 분해를 위해 MyD88을 표적으로 삼는 ACKR4a를 통해 자가포식을 활성화하여 NF-kB 신호 전달을 차단하고 자가 복제를 촉진합니다. 또 다른 방어 전략은 병원체가 생존과 복제를 위해 숙주 세포를 사용할 때 활성화되는 프로그램화된 세포 사멸(세포사멸)입니다. 예를 들어, 대식세포의 마이코박테리아 감염은 세포사멸을 유발하여 세포에서 박테리아 제거에 기여합니다.58 또한, TNF-α 매개 대식세포 세포사멸은 마이코박테리움 복제의 세포내 환경을 파괴하고 감염된 마이코박테리움의 성장 속도를 감소시킵니다.59 세포사멸의 생존 압력에 따라 많은 성공적인 병원체는 숙주 세포에서 세포사멸을 억제하는 유전자를 암호화하여 병원체 복제의 생존력을 유지합니다.60 이러한 메커니즘은 포유류에서 잘 연구되었지만 어류에서 박테리아의 세포사멸 억제에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 우리 연구에서 V. harveyi에 의해 유도된 자가포식은 세포사멸 단계에서 역할을 하며 세포사멸 신호전달을 차단합니다. 세포사멸과 자가포식은 서로를 촉진하기도 하고 길항하기도 합니다. 세포사멸 전 단계에서 세포는 세포사멸 경로를 차단하고 자가포식을 통해 세포사멸 수준을 감소시켜 이점을 유지합니다. 자가포식은 세포사멸 초기 단계에서는 세포 사멸을 유발하지 않지만 세포 생존도 촉진합니다.61 세포사멸 후기 단계의 자가포식은 세포사멸을 촉진할 수 있으며, 이후 증가된 세포사멸은 p53 및 BH3 경로의 이동을 통해 자가포식의 발생을 억제합니다.62 자가포식과 세포사멸의 상호작용을 포함하여 생물학적 과정은 엄격하게 규제됩니다. 수많은 조절 유전자가 세포사멸과 자가포식의 상호작용 반응 메커니즘에 관여하며, Beclin-1이 그 중 하나입니다.63 자가포식 개시 조절 외에도 Beclin-1은 세포사멸 조절에도 관여합니다.45 ,64 연구에 따르면 Beclin-1은 활성화된 카스파제에 의해 절단된 후 세포사멸에 저항하는 능력을 상실합니다.65 이는 Beclin-1이 규제에서 '분자 스위치'로서 중요한 역할을 한다는 것을 의미합니다. 자가포식과 세포사멸.

cistanche tubeulosa - 면역 체계를 향상시킵니다.

V. harveyi는 해양 양식업의 건강에 심각한 위협을 가하는 해양 그람 음성 박테리아입니다. V. harveyi 감염은 어류에서 수막염과 뇌염을 유발하고66 V. harveyi 감염은 그루퍼에서 뇌울혈을 유발합니다.67 박테리아 감염에 대한 선천적 면역 및 염증 반응은 어류의 주요 방어 시스템입니다. 그러나 박테리아는 숙주와의 공생을 통해 면역을 회피하는 능력도 진화했습니다. 요약하면, 우리의 결과는 어류의 V. harveyi 면역 회피 메커니즘을 보여줍니다. ACKR4a는 자가포식을 유도하여 NF-kB 신호 전달을 억제하고 세포사멸을 차단하며, 이는 경골어류 어류에서 V. harveyi 감염을 촉진합니다. 또한, 그람 음성균이 자가포식을 통해 선천성 면역과 세포사멸을 동시에 조절하여 면역을 회피하는 것으로 밝혀진 것도 이번이 처음입니다. 이 연구는 경골어류의 숙주-박테리아 상호작용에 대한 자가포식의 효과를 이해하는 데 대한 통찰력을 제공하고 박테리아 감염에 대한 포유류의 저항성에 대한 관점을 제공합니다.

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