Cistanche에서 추출한 Acteoside는 PI3K/AKT/mTOR 경로를 활성화하여 글루코코르티코이드 유발 골다공증을 개선합니다
Dec 23, 2022
추상적인
객관적인
글루코코르티코이드는 임상에서 널리 사용됩니다. 그러나 다음과 같은 부작용을 일으킬 수 있습니다.골다공증. 액티오사이드(ACT)는 Cistanche에서 다양한 질병을 퇴치하는 데 사용되었습니다. 이 연구는 글루코코르티코이드에 의한 ACT의 효능을 평가하기 위해 수행되었습니다.골다공증(GIOP) 및 그 잠재적 메커니즘.
행동 양식
덱사메타손(Dex)을 근육주사하여골다공증쥐 모델에서, ACT는 구두로 제공되었습니다. ACT는 Dex로 자극된 생체 내에서 보충되었습니다.골아세포의MC3T3-E1 세포. RT-qPCR은 mRNA 수준을 평가하기 위해 수행되었습니다.뼈 형성(Runx2, CoL1A1) 및 골 흡수(OPG 및 RANKL). 상업용 ELISA 키트를 적용하여 혈청 OC 및 CTX 수준을 평가했습니다. PI3K/AKT/mTOR 신호 전달 경로에서 단백질 수준을 평가하기 위해 웨스턴 블롯을 수행했습니다. CCK-8 분석 및 유세포 분석을 수행하여 골아세포 생존력 및 세포사멸을 평가했습니다.
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결과
ACT는 Dex에 의해 유발된 뼈 미세구조 악화를 감소시켰고, 혈청 OC 수치를 증가시켰으며, CTX 수치를 감소시켰습니다(P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and 촉진 된 세포 사멸; 그러나이 효과는 ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).
결론
에서 ACT시탕슈Dex 유발 골다공증을 완화하기 위해 PI3K/AKT/mTOR 신호 전달 경로를 활성화하여 골 보호 효과를 발휘할 수 있습니다.
키워드:액티오사이드 시탕슈글루코 코르티코이드 유발골다공증
소개
골다공증(OP)은 낮은 뼈 질량, 뼈 조직 미세 구조의 파괴 및 뼈 항상성의 불균형을 특징으로 하는 일반화된 골격 질환입니다[1]. OP는 연간 890만 건 이상의 골절을 유발하고 골다공증성 골절은 거의 3초마다 발생하며 평생 장애 또는 사망으로 이어집니다[2]. 글루코코르티코이드(GC)는 일반적으로 비감염성 염증성 질환(예: 천식 및 염증성 장 질환) 및 자가 면역 상태의 치료를 위해 투여됩니다[3]. 그러나 장기 GC 사용은 OP 사례의 30% 이상, 골괴사 사례의 10% 이상에 소인이 됩니다[4]. GC는 조골세포의 증식과 분화를 직접적으로 억제하고[5], 성숙과 활동을 감소시키며, 조골세포의 세포사멸을 유도하여 글루코코르티코이드 유도 골다공증(GIOP)을 발생시킵니다[6]. 더욱이 골아세포 기능장애가 뼈 손실의 주요 원인이라는 증거가 늘어나고 있습니다. 따라서 조골세포의 수와 기능을 증가시키는 것이 OP, 특히 GIOP를 예방하는 주요 전략인 것으로 보입니다.
약초, 특히 천연 화합물을 기반으로 한 약초는 다양한 질병의 치료를 위해 수천 년 동안 시행되어 왔습니다[7]. Cistanche는 신장 위구르 자치구 남부 지역에서 자라는 사막 인삼으로 알려진 중국 약전에 기록된 귀한 허브입니다[8]. Cistanche는 면역 강화, 신장 보호, 노화 방지, 항산화, 항 염증 및 신경 보호 효과와 같은 다양한 효과가 있음이 입증되었습니다 [9].액티오사이드(ACT)는 Cistanche의 phenyl ethanolic glucoside로 신경 세포 사멸 억제[10], 간 손상 완화[11], 항염증[12], 항산화[13]와 같은 생물학적 활성을 가지고 있습니다. , 당뇨병 예방[14], 비만[15], 관절연골의 퇴화[16]. 또한 여러 연구에서 ACT의 약동학이 보고되었으며 경구 이용률이 0.12%에 불과해도 치료 효과가 있음을 확인하였다. ACT는 생체 내 활성 대사산물을 가진 프로드러그로 간주됩니다[17].
장 외. 쥐의 난소절제술로 인한 뼈 손실에 대한 ACT의 잠재적인 보호 효과를 입증했습니다[18]. ACT는 당뇨병 쥐의 뼈 손실을 방지하기 위해 IGF-1/PI3K/mTOR 신호 경로를 조절합니다[19]. PI3K/AKT/mTOR 경로는 GIOP를 포함한 다양한 질병에서 중요한 조절 역할을 하는 것으로 보고되었습니다[20]. Naringin은 PI3K/AKT/mTOR 신호 경로를 조절하여 GIOP를 완화합니다[21]. 또한 이 신호 전달 경로는 조골세포 분화[22], 뼈 형성[23] 및 골절 치유[24]를 조절합니다. 그러나 GIOP에 대한 ACT의 잠재적인 역할과 그것이 PI3K/AKT/mTOR 신호 전달 경로의 조절에 의해 조절되는지 여부는 알려져 있지 않습니다.
본 연구의 목적은 GIOP 쥐 모델과 조골세포에서 ACT의 보호 효과를 이해하고 기본 분자 메커니즘을 밝히는 것입니다.
재료 및 방법
실험동물
무게가 280~340g인 8-주령의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐를 Shanghai Laboratory Animal Center(CAS, Shanghai, China)에서 입수했습니다. 실험 동물의 관리 절차는 Qiqihar 의과 대학 동물 윤리 위원회 제3부속 병원에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 그리고 연구는 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 동물은 병원체가 없는 동물 센터, 24 ± 2도, 12시간 명암 주기, 50 ± 5% 습도, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 동물 센터에 수용되었습니다.
GIOP 모델 구성
적응식 섭식 7일 후 난수표 방법을 사용하여 쥐를 무작위로 대조군과 모델군으로 나누고 Dexamethasone (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) 5 mg/kg을 주 2회 6주 동안 주사하였다. 모델 그룹 [25]의 쥐에서 OP를 유도하기 위해 근육 내. 대조군(n = 10)의 쥐에게 같은 양의 식염수를 주입했습니다. 6주째에 두 그룹의 쥐에서 체중의 유의한 변화가 관찰되지 않았습니다. 이후 모델군에 속한 쥐들을 모델군, ACT 저용량군(Model + ACT-L)군, ACT 고용량군(Model + ACT-H)군으로 세분하였다. ACT(HPLC 98%)는 Baoji Herbest Bio-tech., Ltd.(Baoji, China)에서 입수하여 수성 용매 현탁액으로 처리하였다. 50 mg/kg/d 및 100 mg/kg/d ACT를 저용량 그룹과 고용량 그룹(그룹당 8마리)의 쥐에게 경구 투여했습니다. 8주간 계속되었다. 이 중 표본 크기는 선행 연구[26]를 기반으로 계산하였다. 양측 유의 수준 0.05[95% 신뢰 구간(= 0.05)], 80% 검정력 및 0.5의 효과 크기를 고려하여 검정력 분석은 다음을 가정하여 그룹당 6마리의 필요한 표본 크기를 추정했습니다. 30% 골다공증의 관련 효과 수준. 또한 탈락률이 20%로 그룹당 8마리(총 32마리의 쥐)가 이상적인 것으로 간주되었습니다.
쥐 혈청 샘플
8주 후 쥐를 10% chloral hydrate(400 mg/kg, 복강내, Solarbio, Beijing China)로 마취하고 복부 대동맥에서 혈액을 채취하여 실온에서 응고하고 3500 rpm/min에서 10분 동안 원심분리하였다. 혈청은 추가로 사용할 때까지 1.5mL 원심분리 튜브에 보관했습니다.
골밀도 평가
BMD(Bone Mineral Density)는 DAX small animal bone densitometer(Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, China)를 사용하였다. 간략하게, 래트를 앙와위 자세로 놓고 뒷다리를 바깥쪽으로 위치시켰다. 쥐의 오른쪽 대퇴골을 제조업체의 지시에 따라 스캔하고 BMD 값을 기록했습니다[27].
뼈 형태 분석
실험 종료 시 과량의 클로랄 수화물을 복강 내 주사하여 쥐를 안락사시키고 대퇴골을 70% 에탄올에 고정시켰다. 그 후, 이전 연구에서 설명한 대로 VivaCT 40μCT 시스템에서 스캔을 수행하고 뼈 부피/총 부피(BV/TV), 뼈 섬유주 수(Tb.N), 뼈 섬유주 두께(Tb.Tn) 및 뼈 섬유주 분리 (Tb.Sp)를 평가하였다[28]. 안락사를 위해 10% 클로랄 수화물(350 mg/kg)을 복강내 주사하여 골 형태 분석 후 SD 쥐를 마취시켰다.
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)
상용 ELISA 키트는 쥐의 혈청에서 오스테오칼신(OC, E-EL-R0243c, Elabscience) 및 C-말단 텔로펩티드(CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) 수준을 검출하는 데 사용되었습니다. 간단히 말해서, 시약을 18-25도에서 제거하여 세척 및 표준 작업을 위한 용액을 평형화하고 준비했습니다. 효소 플레이트 표준, 블랭크 및 샘플 웰로 플레이트를 설정했습니다. 약 100 μL 샘플 희석 용액을 웰에 첨가하고, 37도에서 90분 동안 인큐베이션하고, 37도에서 60분 동안 비오티닐화된 항체로 교체하였다. 세척 후 효소 결합 작업 용액을 첨가하고 30분 동안 배양하였다. 기질 용액(90 μL)을 첨가하고 빛으로부터 보호하면서 15분 동안 배양하였다. standard well에 blue gradient가 나타나면 50 μL의 termination solution을 첨가하여 OD450의 변화를 분석하였다.
역전사 정량적 실시간 PCR(RT-qPCR)
TRlzol LS 시약을 쥐의 혈청과 ACT 처리된 MC3T3-E1 세포에 첨가하고, 실온에서 배양한 후 클로로포름을 첨가하여 총 RNA를 추출하였다. RNA 농도 및 순도는 Nanodrop ND-1000 분광광도계에서 A260/280 흡광도를 측정하여 확인했습니다. SuperScript II Reverse Transcriptase 키트는 RNA를 cDNA로 역전사하는 데 사용되었습니다. 이어서 cDNA를 주형으로 적용하고 프라이머를 첨가한 후 SYBR-Green PCR master mix kit를 혼합하여 ddH2O를 20 μL로 보충하고 Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR을 이용하여 PCR 증폭 반응을 수행하였다. 시스템(ABI, CA, USA). GAPDH는 정규화를 위한 내부 참조로 사용되었고 상대 발현 수준은 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산되었으며 3회 수행되었습니다. Runt 관련 전사 인자 2(Runx2), 콜라겐 유형 I 1(CoL1A1), 핵 인자-κB 리간드의 수용체 활성화제(RANKL), 오스테릭스 및 오스테오프로테게린(OPG)에 대한 프라이머 서열이 표 1에 제시되어 있습니다.
웨스턴 블롯 분석
1% 프로테아제 억제제를 함유한 RIPA 용해물을 세포에 첨가하고, 4도에서 5분 동안 진탕하여 세포를 용해시킨 후 각 그룹의 총 단백질을 수집하였다. 각 그룹의 단백질 농도를 정량화하기 위해 BCA 분석 키트를 사용했습니다. 그 후, 단백질 샘플을 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 완충액과 동일한 부피로 혼합하고 수조에서 95도에서 5분 동안 삶아 단백질 변성을 수행하였다. 12% SDS-폴리아크릴아미드 수직 겔을 준비하고, 겔이 고화된 후, 120mA 90분 겔 전기영동 분리를 위해 30㎍의 단백질을 샘플링하였다. 그런 다음 단백질을 90V에서 120분 동안 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. 5% 소 혈청 알부민으로 밀봉한 후, PVDF 막을 마커 및 표적 단백질 밴드의 분자량을 기준으로 절단하고 상응하는 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. p-AKT, p-mTOR 및 p-PI3K에 대한 토끼 다클론 항체를 1:1000의 비율로 희석했습니다(Proteintech, Wuhan, China). TBST를 30분 동안 세척하고 상응하는 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 블롯은 강화된 화학발광 시약을 사용하여 가시화되었습니다. 단백질 밴드의 밀도는 Image J를 사용하여 정량화되었습니다. GAPDH는 상대적인 단백질 수준을 계산하기 위한 컨트롤로 사용되었습니다.
세포 배양 및 그룹화
마우스 pre-osteoblasts MC3T3-E1은 Chinese Tissue Culture Collections(CTCC, China)에서 구입하여 10% fetal bovine serum과 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin을 포함하는 -MEM에서 배양했습니다. 37도 및 5% CO2의 가습 인큐베이터. 골분화 배양을 위해 10mM- -glycerophosphate와 50mg/mL의 ascorbic acid(Sigma-Aldrich)를 -MEM과 혼합하여 골형성 유도배지를 만들고 MC3T3-E1 세포에 첨가하여 골분화를 유도하였다. 그들의 차별화. 배지는 3일 후에 교체하였다. 14일 동안의 배양은 Alkaline phosphatase (ALP) 생존력을 위해 사용되었습니다. 또한, 세포를 PI3K 억제제 LY294002(10μM)로 30분 동안 전처리한 후 Dex 및 ACT로 처리하였다.
세포 생존율 분석
Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석은 ACT로 처리된 조골세포의 생존 능력을 평가하기 위해 수행되었습니다. MC3T3-E1 세포를 5 × 103 세포/웰로 96웰 플레이트에 접종하였다. 이전 연구[29]를 기반으로 1 μM의 Dex 양을 고려하고 ACT의 구배 농도(10-8, 10-7, 10-6 및 10-5 M)와 함께 배양했습니다. 96-웰 플레이트의 배양액은 혼합배지와 CCK-8 시약을 10:1 비율로 첨가한 후 교체하였다. 37℃에서 1시간 동안 계속 배양한 후 OD450의 변화를 평가하였다.
조골 세포 세포 사멸 번호 검출
서로 다른 처리를 거친 MC3T3-E1 세포를 EDTA가 없는 트립신을 사용하여 분해하고 원심분리하여 수집했습니다. 1× 결합 완충액으로 세척한 후, 5 μL Annexin V-FITC를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하고, 5 μL PI를 보충하고 200- 메쉬 나일론 망을 통과시켰다. FACScan 유세포 분석 시스템을 사용하여 샘플을 분석했습니다.
ALP 활성 분석
MC3T3-E1 세포를 24-well plate에 접종하고 미장 후 ACT와 Dex를 첨가하였다. 배양을 위해 세포배양액을 골분화배지로 교체하였다. 세포 용해 용액(P0012J, Beyotime Biotechnology)에 의한 세포 용해를 사용한 후, 원심분리로 상등액을 수집하고 표준 곡선을 작성하였다. ALP 활성을 평가하기 위해 ALP 키트(P0132S, Beyotime Biotechnology)를 사용하였고 OD450을 계산하였다.
통계 분석
3회 독립적인 실험을 수행한 후 데이터를 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 분석하고 평균 ± 표준 편차로 표시했습니다. ANOVA는 여러 그룹 간의 통계적 차이를 비교하기 위해 사용되었습니다. P-value < 0.05는 통계적으로 다른 것으로 간주되었습니다.
