아나스타틴 유도체는 항산화 특성을 통해 심근 허혈-재관류 손상을 완화합니다
Mar 20, 2022
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추상적인:(±)-Anastatins A와 B는 Anastatina hierochuntica에서 분리된 플라보노이드입니다. 이전 연구에서 24개의 이치환 및 삼치환된 신규 유도체인 24개의 이치환 및 삼치환된 신규 유도체가 설계되었고 이들의 예비 항산화 활성이 평가되었습니다. 본 연구에서는 심근 허혈 재관류(I/R)의 보호 효과와 24개 유도체의 체계적인 항산화 능력에 대해 더 연구했습니다. 화합물 13은 연구된 모든 화합물 중에서 가장 강력하여 H9c2 세포의 생존을 80.82%까지 증가시켰습니다. 화합물 13의 항산화능은 철환원 항산화력, 2,2'-azino-bis({16}}에틸벤조티아졸린{17}}술폰산) 라디칼 소거, 2,{19}}디페닐{19} {20}}피크릴히드라질 분석. 화합물 13은 심근 I/R 손상이 있는 쥐에서 경색 부위를 유의하게 감소시키고 조직병리학적 및 심전도 변화를 개선하는 것으로 관찰되었습니다. 또한, 화합물 13은 쥐의 심근 조직에서 혈청 젖산 탈수소효소, 크레아틴 키나제 및 말로닐 디알데히드의 누출률을 감소시켰고심근 I/R 손상쥐에서. 종합하면, 우리는 화합물 13이 광범위한 항산화 활성으로 인해 시험관 내 및 생체 내 모두에서 심근 I/R 손상에 대한 강력한 심장 보호 효과가 있다고 결론지었습니다.
키워드: 플라보노이드 유도체; H9c2 세포; 저산소증/재산소화; 심장 보호 효과
1. 소개
허혈성 심장병(IHD)은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다[1]. 적시에 혈류를 회복하면 질병의 임상 결과를 효과적으로 개선할 수 있습니다. 그러나 재관류 자체에 의한 세포 손상의 정도 때문에 재관류에 위험이 없는 것은 아닙니다. 따라서 심근 허혈 재관류(I/R) 손상에 대한 효과적인 치료 전략을 개발하는 것이 매우 중요합니다[2]. 심근 I/R 손상의 메커니즘은 매우 복잡합니다. 여기에는 세포 사멸, 산화 스트레스[3], 칼슘 과부하[4], 염증[5]이 포함됩니다.산화 스트레스신호 조절 키나제(ERK), c-Jun 아미노 말단 키나제(JNK), p53(tumor protein p53) 및 p66shc 변이체의 활성화를 포함한 다양한 신호 전달 경로를 통해 세포 사멸을 유발할 수 있습니다. 더욱이, 과도한 활성산소종(ROS) 생성은 DNA, 핵산, 단백질, 지질과 같은 세포막과 세포 분자에 돌이킬 수 없는 손상을 일으키고 연쇄 반응을 시작하여 심근 조직을 더욱 손상시킬 수 있습니다. 자유 라디칼 형성과 ROS 소거 사이의 불균형으로 인해 발생하는 산화 스트레스[6]는 I/R 손상 I의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 따라서 산화 스트레스로부터 심근을 보호하는 전략은 관리에서 높게 고려됩니다. 심근 I/R 손상. 따라서 잠재적인 자유 라디칼 소거 능력으로 인해 항산화 기반 전략은 I/R 손상 관리에 유용합니다.
임상 연구에서 항산화제를 사용하여심근 I/R 손상크게 효소와 비효소의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제와 같은 효소는 과산화수소 농도를 감소시켜 세포 손상을 방지합니다. 비타민 E, 비타민 C, -카로틴 등과 같은 비효소적 항산화제, 조직의 산화 스트레스 반응을 약화시켜 조직 손상을 줄이고 기능 회복을 촉진합니다. 그러나 현재 둘 다의 적용에는 특정 제한 사항이 있습니다. 효소 제제의 큰 분자량은 흡수에 도움이 되지 않습니다[8]. 또한 비효소의 안정성에 특정 문제가 있어 약물의 안정성이 낮아 쉽게 산화됩니다[9].플라보노이드, 비효소적 항산화제의 일종으로 항산화, 항암, 항세포자멸사 및 심혈관 보호를 포함한 다양한 강력한 특성을 갖는 것으로 보고되었습니다[10]. 그들은 반응성이 높은 산화물의 형성을 방지하고 수소 라디칼 및 퍼옥시나이트라이트와 같은 ROS를 제거하여 산화 반응을 억제합니다. Anastatin A와 B[11]는 간 보호 활성이 있는 플라보노이드입니다. Anastasius A와 B는 Anastatica hierochuntica(아형 Anastatica, Brassicaceae과)의 활성 성분입니다. 현재, 화학적 합성 및 구조적 변형에 관한 보고는 거의 없습니다. Anastatin A와 B. 2003년에 Anastatina hierochuntica의 활성 화합물이 분리되었고 1차 배양된 마우스 간세포에서 D-갈락토사민 유발 세포독성에 대한 간 보호 효과가 있는 것으로 밝혀졌습니다. Nakashima와 Eman은 또한 화합물이 시험관 내 항산화 및 항암 활성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 그러나 아스타틴 A, B 및 그 유도체의 약리학적 효과와 합성 절차는 아직 명확하지 않다. 따라서 우리는 아스타틴 A와 B와 그 유도체 중 일부를 합성하고 저산소 상태에서 항산화 활성을 평가하는 것을 목표로했습니다.재산소화심근 I/R 손상 연구에 효과적인 (H/R) 모델 [12].
이전 연구에서 우리는 H2O2(과산화수소) 유도 산화 손상의 세포 배양 모델을 사용하여 아스타틴 A와 B와 그 유사체를 합성하고 항산화 능력을 평가했습니다. 우리의 이전 결과는 아스타틴 A와 B가 항산화 능력과 관련된 것으로 보이는 강력한 간 보호 활성을 가지고 있음을 보여주었습니다.
본 연구에서는 환원력 및 라디칼 소거 시험을 이용하여 아스타틴 A, B 및 그 유도체 24종을 합성하고 항산화 능력을 평가하였다. 또한, H/R의 단순 H9c2 세포 모델과 심근 I/R 손상의 쥐 모델을 사용하여 화합물의 심장 보호 효과를 평가했습니다.
2. 결과
2.1.H/R 모델 구축
Na2S, O4 처리의 농도는 그림 1A와 같이 평가되었으며 H9c2 세포의 생존율은 Na2S2O4 농도가 증가함에 따라 감소했습니다. 4mM의 Na, S, Oa에서 세포 생존율은 5{17}}% 미만으로 감소했습니다(2,1 및 0시간의 재산소화 시간에서 각각 13.7,25 및 43.4%). , 그리고 세포 생존율 감소 수준이 더 낮았다. 따라서 저산소 처리를 모방하기 위해 4mM 농도의 Na2S2O4가 사용되었습니다. 그림 1B는 재산소화 없이 2시간 동안 4mM의 Na2S2O4 처리(0시간)가 세포 생존력을 현저하게 감소시키고 안정적으로 유지되었음을 보여줍니다. 4mM 농도의 NazS2O4 조건에서 2시간 동안 저산소증을 모방한 상태에서 2시간 동안 재산소화하면 세포 생존율이 17.37%로 감소했습니다(그림 1C). 그림 1D에 명확하게 표시된 것처럼 10μM의 레스베라트롤은 동일한 농도의 갈산(갈산의 경우 74.34% 대 60.44%)보다 강력한 H/R로 인한 감소된 세포 생존율을 역전시켰습니다.
그 결과 저산소증을 모방한 Na2S, O4를 4mM의 최종 농도에서 2시간 동안 사용한 후 정상 DMEM(Dulbecco's modifier of Eagle's medium)/고포도당에서 배양하여 재산소화 손상을 모방하여 저산소증/재산소화 모델을 확립했습니다. . 최종 농도 10μM의 레스베라트롤을 양성 대조군으로 사용했습니다.
2.2. 아나스타틴과 그 변형은 H/R 처리를 받은 H9c2 세포의 생존력을 향상시킵니다
먼저 MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1){{ 10}},{11}디-페닐테트라졸륨로마이드) 분석[13]. 화합물 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 및 11은 H9c2 세포에 유의한 세포독성을 나타내지 않았습니다(도 3A, B, 표 S2). Anastatins A와 B, 그 유도체, 레스베라트롤(양성 대조군)은 저산소증으로 인한 세포 손상을 역전시켰습니다(그림 4). 모델군에서는 세포생존율이 20.31%로 감소했으나 레스베라트롤에 의해 82.68%로 증가했으며, 아나스타틴 A와 화합물 22b, 22c, 24b,24c,13, 14는 세포생존율을 70% 이상으로 증가시켰다( 71.49,71.00,76.50, 73.24,77.57, 80.82, 77.13%). 따라서 화합물 13(그림 2C)은 H/R 손상으로 인한 아스타틴 유도체 중에서 가장 강력한 보호 효과를 나타내어 후속 실험에 사용되었습니다.
2.3. 화합물 13은 H/R 유발 세포 손상 및 산화 스트레스를 완화합니다
화합물의 항산화 능력을 탐구하기 위해 세 가지산화 스트레스지표인 LDH(lactate dehydrogenase), GSH(L-Glutathione), SOD(superoxide dismutase)를 선택하여 화합물의 항산화능을 평가하였다. LD는 심근 세포에 존재하는 안정한 세포질 효소로, 심근 세포막 손상 시 세포에서 세포 배양 배지로 빠르게 방출됩니다. 손상이 심할수록 배양 배지에서 LDH 수준이 높아집니다. 그림 5A는 2시간의 저산소증 후 2시간의 재산소화가 LDH 방출을 유의하게 증가시킨다는 것을 보여주었습니다(478.98 U/L 대 55.84 U/Lin 공백 그룹, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">
2.4.화합물 13의 항산화능
Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>레스베라트롤. 따라서, 화합물 13의 항산화능은 다른 일반적인 항산화제보다 높을 수 있다.
2.5. 쥐의 심근 I/R 손상에 대한 아나스타틴 유도체 13의 효과
2.5.1. 산화 스트레스 및 항산화 효소 활성에 대한 화합물 13의 효과
심근 손상 정도는 산화 스트레스 마커와 항산화 효소 활성을 검출하여 평가하였다. 심근 조직에서 MDA(말론디알데하이드) 활성에 대한 화합물 13의 효과 뿐만 아니라 LDH, CK(크레아틴 키나제), GSH 및 SODin 혈청의 수준을 평가하였다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 I/R 손상은 LDH(그림 7A) 및 CK(그림 B) 수준의 증가와 GSH(그림 7C) 및 SOD 활성(그림 7D)의 현저한 감소를 초래했습니다(p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">
2.5.2. 심전도(ECG) 변화 및 심박수에 대한 화합물 13의 효과
심근 I/R 손상에 의해 유도된 전형적인 ECG(electrocardiogram) 변화는 그림 8에 나와 있습니다. 정상적인 ECG(그림 8A)와 비교하여 심근 I/R 손상은 ORS(심전도파의 일부) 진폭 증가(그림 8B)를 유발할 수 있습니다. QRS 파와 ST 파 융합(그림 8C); ST 분절(S파와 T파 사이의 간격) 고도(그림 8D); 및 ST 세그먼트 반전(그림 8E). LAD 결찰 15분 후, QRS 진폭은 모델 그룹에서 약 0.5 mV에서 1.2 mV로 크게 증가했지만(그림 9A), 모든 치료 그룹에서 더 낮은 QRS 진폭 증가가 관찰되었습니다(~ 레스베라트롤, 저용량 13 및 고용량 13 그룹에 대해 각각 약 0.4 mV ~ 1,0.8 및 0.6 mV)(그림 9B-D ). 또한 30 min의 ligation에서도 유사한 경향이 관찰되었습니다. 재관류 동안 QRS 진폭이 감소하기 시작했습니다. 그러나 모델 그룹의 QRS 파동은 전체 기간 동안 가장 높은 수준을 유지했습니다. 재관류 20분 후 모델 그룹의 QRS 진폭은 약 {{30}}.8 mV로 감소했으며 치료 그룹의 값은 약 0.6,0.5, 0.5 mV였습니다. 레스베라트롤, 저용량 13 및 고용량 13 그룹. 전반적으로, 레스베라트롤, 저용량 13 및 고용량 13의 치료는 모두 심근 보호 활성에 기인할 수 있는 허혈 및 초기 재관류 과정 동안 모델 그룹과 비교하여 병리학적 QRS 진폭 증가를 감소시켰습니다.
ECG의 모니터링과 함께 심박수의 변화를 면밀히 감지했습니다. 표 S3에서 볼 수 있듯이 30분의 결찰은 모든 그룹에서 심박수를 극적으로 감소시켰지만 치료 그룹과 모델 그룹 간에는 유의한 차이가 감지되지 않았습니다. 2시간의 재관류 후 심박수는 증가했지만 어느 그룹에서도 유의미한 변화는 발견되지 않았습니다.
2.5.3. 경색 부위 및 조직병리학적 변화에 대한 화합물 13의 효과
심근 손상 수준을 평가하기 위해 심장 조직을 TTC(2,{1}}Triphenyltetrazolium chloride)로 염색하고 조직병리학적 변화를 감지했습니다. 도 10에 도시된 바와 같이, sham 그룹에서는 TTC 염색 후 심근의 변화가 관찰되지 않은 반면, I/R 그룹에서는 백색 경색 부위의 약 30% 규모가 관찰되었다. 레스베라트롤군과 저용량 13군에서는 경색 면적이 약 10% 정도로 현저히 감소하였고, 고용량 13군에서는 경색 면적이 약 5% 정도로 최소화되었다. 도 10은 HE(hematoxylin-eosin) 염색 검사의 결과를 나타낸 것이다: 심장 세포의 비대, 부분적으로 용해된 막 및 핵, 및 염증 세포 침윤이 모델 그룹의 조직 절편에서 관찰되었다. 그러나, 화합물 13을 사용한 전처리는 이러한 조직병리학적 변화를 상당히 완화시켰다. TTC 염색 및 HE 염색의 결과는 화합물 13이 용량 의존적 방식으로 I/R 유도 심근경색증을 감소시킬 수 있음을 나타내었다.
3. 토론
우리 연구실에서는 아스타틴 A와 B의 잠재적인 항산화 활성을 목표로 24개의 아스타틴 유도체를 합성하고 PC{1}}에 대한 화합물의 세포 독성과 H2O 유도 산화 손상에서 세포 보호 활성에 대한 예비 분석을 수행했습니다[13] . 본 연구에서는 주로 항산화 활성이 가장 강한 24가지 유도체 중 13가지에 대한 심층 생물학적 평가를 수행하였다.
현재 연구에서 심근 I/R 손상은 H/R 처리로 유도를 통해 H9c2 세포에서 확립되었습니다. 연구 결과는 아스타틴 A와 B와 연구된 유도체가 H/R 처리 후 H9c2 세포의 생존력을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 화합물 13은 연구된 26개의 화합물 중에서 가장 강력한 것으로 밝혀졌으며 따라서 추가 평가를 위해 선택되었습니다. H/R 처리 후 H9c2 세포의 상층액에서 LDH(세포 손상 마커), SOD 및 GSH(산화 스트레스 마커)의 활성이 검출되었습니다. 우리는 시험 화합물을 사용한 전처리가 세포에서 LDH 수준을 유의하게 감소시키고 SOD 및 GSH 수준을 증가시키는 것을 발견했습니다. 따라서 우리는 아스타틴 유도체가 산화 스트레스를 억제하는 능력에 기인할 수 있는 심장 보호 활성을 가지고 있다고 가정했습니다. DPPH 및 ABTS 분석은 화합물의 라디칼 소거력을 평가하는 데 사용됩니다[14]. 그 결과, 화합물 13은 항산화력이 높았고, 낮은 EC50 값에서 ABTS와 DPPH를 소거하여 산화적 스트레스를 더욱 억제하였다. LAD 결찰은 심근 I/R 모델을 설정하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 허혈 전, 허혈 후, 재관류 후 QRS 복합체의 진폭을 평가함으로써, 우리는 화합물 13을 사용한 전처리가 허혈 및 조기 재관류 동안 심실 부정맥을 유의하게 완화할 수 있음을 발견했습니다. 또한, 화합물 13은 심근경색의 경색 부위 및 조직병리학적 변화에도 영향을 미쳤다. 이러한 결과는 화합물 13이 산화 스트레스를 억제하고 쥐 혈청의 항산화 효소 수치를 용량 의존적으로 증가시킨다는 발견과 함께 화합물 13이 심근 손상에 강력한 효과가 있음을 보여주었습니다.
결론적으로, 아스타틴 유도체는 강력한 항산화 능력을 가졌으며, 화합물 13은 시험된 화합물 중에서 가장 높은 항산화 활성을 나타냈다. 산화 스트레스 관련 신호 전달 경로에 대한 아스타틴 유도체의 영향을 담당하는 메커니즘은 여전히 논의되어야 합니다. 아스타잔틴(카로티노이드의 하위 유형)은 ROS를 제거하고 허혈/재관류 손상을 더욱 완화할 수 있습니다[15]. ROS 생성을 방지할 수 있는 약물은 세포 치료 및 심혈관 질환과 같은 산화 스트레스 관련 질병[4]에서 유망할 수 있습니다. 또한, ROS는 저산소증-유도 인자-1(HF-1) 표적 유전자 발현의 저산소 유도를 억제하는데, 이는 허혈-재관류 손상에 대한 심장 보호 효과가 있는 것으로 보고되어 있다[16]. 우리는 ROS 및 HIF 조절 단백질이 화합물 13의 심장 보호 효과에 중요한 역할을 할 수 있다고 가정합니다. 한약에서 추출한 토르네폴산 B(TAB)는 심근 I/R 손상으로부터 보호합니다[17 ]. 이 연구는 심근 I/R 손상 관리에서 소포체(ER) 스트레스, 세포자멸사 및 PI3K(포스파티딜이노시톨 3 키나제)/AKT(단백질 키나제 B) 경로에서 TAB의 중요한 역할을 밝혔습니다. mitogen-activated protein kinase (MAPK) 경로 [18] 및 AMPK (Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase) 신호 전달 경로 [19]와 같은 다른 경로도 심근 I/R 손상에 관련될 수 있습니다. 따라서 다음 단계는 ROS 및 HIF{21}} 조절 단백질로 시작하고 TAB 매개 경로를 사용하여 13이 항산화 효과를 발휘하고 심근 I/R을 보호하는 메커니즘을 탐구하는 것입니다. 또한, 본 연구에서 세포 수준에서의 실험은 인간 세포주에서도 수행되어야 한다.
4. 재료 및 방법
4.1.세포 배양
쥐 심근세포 H9c2 세포주는 Nanjing Kebai Biotechnology Company(Nanjing, China)에서 구입했습니다. 세포를 DMEM/고포도당(Hyclone, USA)에서 배양하고 10% FBS(Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, China) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone, Marlborough, MA, USA)을 가습된 5% CO2와 함께 37도의 인큐베이터.
4.2. 세포 생존력 분석
세포 생존율은 MTT 분석을 사용하여 측정되었습니다. H9c2 세포를 96-웰 플레이트에 24시간 동안 1×10* 세포/웰로 시딩했습니다. 그 후, 세포에 Anastatins A, B 및 그 유도체를 48시간 동안 처리하거나 Anastatins A 및 B로 전처리한 후 H/R 처리하였다. 그런 다음 MTT(20μL/well)를 첨가하고 37도에서 4시간 동안 배양했습니다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더(Tecan, Infinite 50)를 이용하여 578 nm에서 측정하였다. 빈 그룹의 세포 생존율은 100%로 간주되었습니다.
4.3. 저산소증/재산소화(H/R) 모델 및 약물 관리
4.3.1.H/R 모델
NazS, O4는 [20] 산소와 반응하여 산소 장력을 감소시키는 저산소 상태를 모방하는 데 사용되었습니다. 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6mM의 다양한 7가지 농도를 수행하여 Na2S, O4의 최적 농도를 결정했습니다. 최적의 저산소 시간을 선택하기 위해 Na2S2O4 용액 처리 후 0.5, 1,2, 3 또는 4시간의 배양을 수행했습니다. 재산소화 시간을 모방하기 위해 0, 1, 2, 3 또는 4시간 동안 일반 DMEM/고 포도당 배지에서 배양을 수행했습니다[21].
4.3.2. 의약품 관리
약물 투여를 위해, 아스타틴 A 및 B 및 그 유도체(표 S1의 화학 구조)를 두 그룹으로 분리하였다: 아스타틴 A 및 그 유도체, 및 아스타틴 B 및 그 유도체. 항산화 활성을 통해 심장 보호 효과가 있는 것으로 보고된 레스베라트롤을 양성 대조군으로 사용했습니다. 양성 대조군의 농도를 결정하기 위해 레스베라트롤과 다른 항산화 화합물인 갈산(3-100 μM)을 세포를 48시간 동안 처리한 MTT 분석을 사용하여 평가했습니다[22]. 일반적으로 H9c2 세포는 H/R 처리 전 30분 동안 아나스타틴 A 및 B 및 그 유도체(최종 농도 10uM)와 레스베라트롤 10uM로 전처리하였다.
4.4.항산화 능력 평가
4.4.1. 제2철 환원 항산화력(FRAP) 분석
FRAP assay는 Oivuan의 방법[23]에 따라 수행하였다. 총 25μL의 1% 페리시안화칼륨 K3Fe(CN)6과 화합물 13, 비타민 c(아스코르브산, Vc) 및 레스베라트롤(0 10μL)을 피펫팅했습니다.{8} }mM)+1 × PBS(pH{10}}.6)를 첨가했습니다. 혼합물을 50도 수조에서 20분 동안 유지한 후 급속 빙냉시켰다. 그런 다음, 10% 트리클로로아세트산(TCA) 25μL, 0.1% 염화 제2철(FeCl) 및 증류수를 순서대로 첨가했습니다. 혼합물을 96-웰 플레이트로 옮기고 650 nm에서 흡광도를 분석했습니다. Vc 용액({21}} ug/mL)을 사용하여 표준 곡선을 작성했습니다. 항산화 능력은 선형 보정 곡선에서 계산되었으며 Vc 등가물로 표시되었습니다.
4.4.2.ABTS 방식
ABTS 라디칼 소거 활성[24]은 Sugahara et al. 및 Reet al. ABTS용액을 희석하여 650 of 0.70±{29}}.02 nm에서 흡광도를 분광광도법으로 조정하고 ABTS 소거 활성을 다음과 같이 측정하였다. 다음 공식 E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(A control-Ablank))× 10, 여기서 Control은 130μL ABTS를 포함하는 대조 반응의 흡광도입니다. · 작업 용액과 5.5μL 시료 희석제(DMSO), Ablank는 130μL 아세트산나트륨 완충액과 5.5μL DMSO의 흡광도입니다. A는 130μL ABTS + 작업 용액(아세트산나트륨 완충액) 및 5.5μL 화합물 13(0.{24}}mM)의 흡광도이고 Az는 130μL 아세트산나트륨 완충액 및 5.5μL 화합물 13( 0.02-20mM). 모든 혼합물을 30초 동안 볼텍싱하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 다음 650 nm에서 흡광도를 측정했습니다. ECs0는 화합물 농도와 ABTS 억제 백분율 확률 간의 선형 관계를 사용하여 계산되었습니다.
4.5. 허혈-재관류 모델
4.5.1.동물 관리
Sprague Dawley(SD) 쥐는 PLA Military Academy of Medical Sciences Laboratory Animal Center(Beijing, China)에서 입수했습니다. 체중이 {0}} g인 50마리의 수컷 SD 쥐를 12시간 명암 주기로 23±1도의 실온에서 1주일 동안 순응시키고 음식과 물을 제공했습니다. 쥐를 5개의 그룹으로 나누었습니다: 빈 그룹(쥐는 치료를 받지 않고 가짜 수술을 받았습니다), 모델 그룹(쥐는 비히클 치료와 MI/R 수술을 받았습니다), 레스베라트롤 그룹(쥐는 200mg/kg의 레스베라트롤과 MI/R을 받았습니다. 작업), 저용량 13 그룹(쥐에게 100mg/kg 화합물 13 및 MI/R 작업을 제공), 고용량 13 그룹(쥐에게 200mg/kg 화합물 13 및 MI/R 작업을 제공). 화합물을 0.5% 나트륨 카르복시메틸셀룰로스에 제형화하고 7일 동안 1일 1회 경구로 1mL/kg의 현탁액으로 투여하였다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침에 따라 수행되었으며 천진 과학 기술 대학 학술 위원회의 승인을 받았습니다.
4.5.2. 실험 프로토콜
Sprague Dawley 쥐를 2{1}}% 우레탄(0.8mL/100g)으로 마취한 다음 왼쪽 전방 하행(LAD) 결찰로 심근 허혈을 수행했습니다. 왼쪽 흉부 절개를 통해 심장을 노출시키고 4-0 실크 봉합사를 사용하여 국소 허혈을 30분간 허혈 후 2시간 재관류를 수행했습니다. 심근허혈의 증거는 ST분절의 상승과 QRS 진폭의 증가로 확인되었다. 실험 동안 쥐는 인공 호흡기 DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Beijing, China)에서 유지되었습니다. 심박수와 ECG는 생물학적 신호 수집 시스템 MD3000(Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Beijing, China)을 통해 모니터링되었습니다. 허혈/재관류 과정을 모니터링한 후, 래트를 희생시키고 혈액 샘플과 심장 균질액을 사용하여 상업용 검출 키트를 사용하여 심근 손상을 검출했습니다.
4.5.3. TTC 염색 및 HE 염색
허혈성 영역의 정도는 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색에 의해 정량화되었습니다. 심장 샘플을 즉시 {{0}}도에서 10분 동안 동결하고 1~2mm의 얇은 조각 5개를 만들었습니다. 그런 다음 슬라이스를 1% TTCphosphate buffer(pH{5}}.0)에 넣고 37도에서 20분간 염색한 후 포르말린으로 고정하였다. 디지털 카메라를 이용하여 영상을 획득하였고, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 경색 부위(TTC-음성) 및 위험 부위(TTC-양성)의 백분율을 측정하였다[25]. HE 염색을 위해 경색 부위를 절제하여 10% 포름알데히드에 고정한 후 파라핀에 포매하였다. 그 후 조직을 HE(hematoxylin-eosin)로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 탈수된 내장 섹션 및 밀봉 섹션은 Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company(Tianjin, China)에 의해 의뢰되었습니다.
4.6. 분광광도계 상용 키트
본 연구에 사용된 상용 키트는 Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.(Beijing, China) 및 Nanjing Jiancheng Bioengineering Company(Nanjing, China)에서 구입했습니다. 쥐 혈청 및 세포 상청액에서 심근 손상 마커, 젖산 탈수소효소(LDH) ), creatine kinase(CK), glutathione(GSH), superoxide dismutase(SOD) 활성을 평가하였다. Malondialdehyde(MDA) 활성은 쥐 심장 균질액을 사용하여 측정되었습니다. 모든 상업용 키트는 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다.
4.7.통계 프로세스
모든 실험은 적어도 세 번 반복되었습니다. 실험 데이터는 GraphPad Prism7 소프트웨어를 이용하여 처리하였으며, 각 그룹의 실험 결과는 평균±표준편차(x±s)로 표현하였다. t-test는 그룹 간의 통계적 유의성을 비교하는 데 사용되었습니다. 피<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">
참고문헌
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