Cistanche Deserticola의 항노화 기능인자 및 메커니즘
May 21, 2024
[추상적인] 목적: 탐구하다노화방지 기능인자식용 및 약용물질의 작용 및 작용기전시스탄체 데세르티콜라네트워크 약리학을 기반으로생체 내모델 유기체 실험예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans). 행동 양식: 주요 구성요소의 잠재적 표적C.데데티콜라 TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform), SwissTargetPrediction, GeneCards, OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man) 및 기타 데이터베이스를 통해 예측되었습니다. 예측된 표적을 STRING 네트워크 분석 플랫폼에 입력하여 활성 성분과 질병 표적의 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 획득하여 핵심 표적을 선별했습니다. KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 농축 분석을 사용하여 작용 경로를 예측하고 분석했으며, Cytoscape를 통해 약물 활성 성분-표적-경로 네트워크를 구축했습니다.C. 엘레간스빈 그룹으로 나누어졌고,C.데데티콜라농도가 다른 그룹. 수명, 생식능력, 운동능력C. 엘레간스직접 관찰했습니다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다제(GSH-Px)의 활성과 말론디알데히드(MDA) 및 활성 산소종(ROS)의 함량.C. 엘레간스키트 분석으로 결정되었습니다. 실시간 정량적 중합효소연쇄반응(qRT PCR)을 이용하여 인간의 수명 및 스트레스 능력 변화와 관련된 유전자의 발현을 확인했습니다.C. 엘레간스. 결과: 잠재적인 기능적 요인이 다음에 작용할 수 있습니다.75노화 관련 목표 및8열 충격 단백질 HSP를 포함한 핵심 표적 단백질90- (HSP90금주 모임1), 에스트로겐 수용체(ESR1), GTPase HRas(HRAS), 프로트롬빈(F2), 매트릭스 금속단백분해효소-2 (MMP)2), 헥소키나제-2 (홍콩2), 수크라제-이소말타제(SI) 및 말타제-글루코아밀라제(MGAM)는 토폴로지 분석을 통해 선별되었습니다. KEGG 분석에 따르면 Cistanche Deserticola가 방해할 수 있는 것으로 나타났습니다.27에스트로겐 신호전달 경로, 암 신호전달 경로, GnRH 신호전달 경로, 인슐린 신호전달 경로를 포함한 경로를 통해 노화를 지연시킵니다.시스탄체 데세르티콜라평균 생존 시간을 크게 연장하고 산화 스트레스 능력을 향상시킬 수 있습니다.C. 엘레간스, SOD, CAT 및 GSH-Px의 활동을 향상시키고 ROS 및 MDA의 축적과 발현을 감소시킵니다.맙소사-2그리고나이-1의 발현이 감소한 반면,맙소사-16및 그 하류 표적 유전자(잔디-3, MTL-1, 그스트-4,ctl-1그리고ctl-2)도 증가했고,스킨-1및 열충격 관련 유전자(HSSF-1, HSP-16.1그리고hsp-16.2). 결론: 네트워크 약리학을 적용하여 가능한 메커니즘을 설명합니다.C.데데티콜라노화 방지에 있어서, 그리고 그것이 증명되었습니다C.데데티콜라수명을 연장할 수 있다C. 엘레간스스트레스 방지 능력을 향상시킵니다. 그 메커니즘은 인슐린 신호 전달 경로의 억제와 인슐린의 하류 전사 인자의 활성화와 관련이 있을 수 있습니다.다프-16및 열 충격 관련 유전자를 함유하여 산화 스트레스 능력을 향상시킵니다.C. 엘레강스.
키워드:Cistanche Deserticola YC Ma; 노화 방지; 기능적 요인; 기구; 산화 스트레스
Cistanche Deserticola YC Ma우리나라의 귀중한 전통 한약재입니다. "사막 인삼"으로 알려져 있습니다. "신농의 약초"에 처음으로 기록되어 최고 등급으로 등록되어 있습니다. 맛은 달고 짜며 성질은 따뜻하며 신장과 대장경으로 돌아간다. 한의학에서는 신장양(腎陽)을 보하고 진(精)과 혈(血)을 보(血)하며 장(腸)을 촉촉하게 하고 하제(腎臟)의 효능이 있다고 믿고 있다[1]
. 2018년에는 Cistanche Deserticola(사막)가 "전통적으로 식품 및 중국 약용 물질 목록"에 포함되어 건강 제품으로 발전하는 데 있어 그 가치가 인정되었습니다. 통계에 따르면 항노화 및 연명 처방에서 Cistanche Deserticola의 빈도는 인삼 다음으로 높습니다 [3]. 현대 약리학 연구에 따르면 Cistanche Deserticola에는 항산화, 항노화, 항피로, 기억력 향상 등의 효과가 있는 것으로 나타났지만[4], 항노화 기능적 요인과 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)(이하 선충이라 함)은 명확한 유전적 배경, 상대적으로 짧은 수명, 빠른 번식, 쉬운 배양을 지닌 다세포 생물이다. 수명이 길어질수록 인간과 유사한 노화 표현형을 나타냅니다. C. elegans 유전자, 단백질 및 신호 전달 경로는 인간과 고도로 보존되어 있습니다.
이는 인간 유전자와 60~80% 상동성을 갖는다. 최근 몇 년 동안 선충류는 한의학 및 자연 의학의 노화 방지 연구에 널리 사용되었습니다 [5]. 이 연구는 네트워크 약리학 방법을 사용하여 노화를 지연시키는 Cistanche Deserticola의 활성 성분, 표적 및 신호 경로를 예측합니다. 선충을 모델생물로 삼아 선충의 수명, 번식 등 전반적인 지표를 관찰하여 산화스트레스의 변화, 운동능력, 수명과의 관계를 측정합니다. 관련 유전자의 발현, 노화를 지연시키는 Cistanche Deserticola의 기작을 규명하고, 관련 건강 정보
건강식품 개발 및 활용에 대한 참고자료를 제공합니다.
1 재료
1. 1 악기
SMZ-168 실체현미경(Motic사); CKX41 역위상차 형광현미경(Olympus사); Multiskan FC 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher science Company); Mycycler 중합효소연쇄반응(PCR) 유전자 증폭기, MJ Mini™ 형광 정량 PCR 기기(Bio-Rad Company).
1. 2 시험약
Cistanche Deserticola는 신장 Yutian County에 있는 Cistanche Deserticola Good Agricultural Practice(GAP) 재배 기지에서 수집되었습니다. 천진제약연구소 연구원 Zhang Tiejun에 의해 Cistanche Deserticola YC Ma로 확인되었습니다. 2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디에틸산 에스테르(DCFH DA), 2% NaN3(Sigma Company); Trizol 시약, cDNA 합성 키트, SYBR Green Kit(Takara Bioengineering Co., Ltd.); 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 키트, 카탈라제(CAT) 키트, 글루타티온 퍼옥시다제(GSH Px) 키트, 말론디알데히드(MDA) 키트(Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.); 형광 정량적 중합효소연쇄반응(qRT PCR) 필요한 프라이머는 Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd.에서 합성하였으며, 프라이머 서열은 표 1에 나타내었습니다.
1.3 선충류
실험에 사용된 10가지 유전적 유형의 선충은 모두 Caenorhabditis Genetics Center에서 나온 것이었습니다. 자세한 정보는 표 2에 나와 있습니다.
2 방법
2.1 Cistanche Deserticola 기능 인자 및 표적 스크리닝
문헌을 검토하고 이 연구 그룹의 이전 Cistanche Deserticola 물질 그룹 특성을 결합하여 주요 화학 성분과 혈액 성분을 선별했습니다[{{0}}]. ChemDraw 19.0 소프트웨어에서 화합물 구조를 그려 SwissTargetPrediction 데이터베이스(http://new.swisstargetprediction.ch/)에 입력하고 역약리단 매칭 방법을 사용하여 가상 스크리닝 결과를 얻습니다. 동시에 한의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)이 사용되었습니다. UniProt 데이터베이스(http://www.uniprot.org/)에서 UniProtKB 검색 기능을 사용하고 검토됨
Swiss-Prot는 단백질을 필터링하고 종을 "인간"으로 제한하고 화합물의 표적 단백질을 유전자 이름으로 수정합니다. 두 데이터베이스의 목표 결과를 통합하여 잠재적인 목표 화합물 라이브러리를 얻습니다.
2.2 노화 관련 대상 예측 분석
GeneCards(https://www.genecards.org/) 및 OMIM(https://omim.org/) 데이터베이스를 사용하여 "old, senile, 낡은, 노화, 허약, caducity"라는 키워드로 검색합니다. 여기서 GeneCards Genes는 10% 이상의 점수를 스크리닝하여 두 데이터베이스의 결과를 병합하고 중복된 유전자를 제거하여 최종적으로 노화 관련 타겟을 획득하였습니다. 그런 다음 2.1항의 기능적 요인의 목표와 위에서 언급한 노화 관련 목표를 결합하고 그 교차점을 취하여 벤다이어그램을 그린다.
2.3 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 구축
획득한 교차점 목표를 STRING 11.5(http://string-db.org/) 데이터 플랫폼에 입력하고 종을 "호모 사피엔스"로 제한하며 상호작용 점수의 최고 신뢰 수준은 0.900이며, PPI 네트워크를 얻습니다. 데이터를 .TSV 형식으로 저장하고 Cytscope로 가져옵니다.
3. 8.0 소프트웨어에서 정도 값으로 노드 크기와 색 심도를 조정하여 Cistanche Deserticola 활성 성분과 질병 표적의 PPI 네트워크를 얻습니다. 정도, 매개성, 친밀도의 세 가지 매개변수가 모두 중앙값보다 큰 점을 핵심 목표로 선정하고, 선별 후 총 8개의 핵심 목표를 획득했습니다.
2. 4 유전자 온톨로지(GO) 생물분석과 교토 유전자 및 유전자
KEGG(Encyclopedia of Groups) 경로 강화 분석은 OmicsBean 데이터베이스(http://www.omicsbean.cn/login/)를 사용하여 교차 대상에 대한 GO 기능 분석 및 KEGG 경로 강화 분석을 수행하고 P 값에 따라 정렬합니다. 결과 경로를 분석합니다.
2.5 의약품 소재-성분-표적-경로 네트워크 구축
Cistanche Deserticola 의약 물질-성분-표적-경로 네트워크를 구축하기 위해 의약 재료, 구성 요소, 표적 및 경로를 Cytscope 3.8.0 소프트웨어로 가져옵니다.
2.6 선충 배양
선충을 NGM 배지(2차 증류수 250 mL에 NaCl 0.750 g, 트립톤 0.625 g 및 한천 4.250 g 함유)를 사용하여 2{1}}도에서 배양하였다. 멸균된 대장균 OP50(65도, 45분)을 먹이원으로 사용하였으며, NGM 배양배지 표면에 고르게 도말하였다. 용해 용액(5% NaClO, 5 mol·L-1 NaOH)을 사용하여 선충을 동기화하고 동기화된 선충을 20도 인큐베이터에서 L4 단계로 배양합니다. L4 단계 선충을 무작위로 선택하여 대조군(NGM 배지)과 Cistanche Deserticola 투여군으로 나누어 질량 농도를 달리하여 실험하였다.
2.7 약물 준비
시스탄체 데세르티콜라 약재 10g을 취하여 물질-액체 비율 1:10에 따라 증류수를 첨가하고 매회 2시간씩 2회 환류 추출한 다음 물 추출액을 합하고 여과하고 농축 건고한다. 감압. 멸균증류수를 사용하여 질량농도 50 mg·mL-1(생약량 기준)의 모액을 조제한다. NGM 배양 배지를 사용하여 나중에 사용하기 위해 최종 질량 농도가 0, 25, 50, 75, 100, 200 및 500 ug·mL–1인 용액을 준비합니다.
2.8 독성시험
N2 선충을 다양한 질량 농도의 Cistanche Deserticola(0, 25, 50, 100, 200, 500 ug·mL–1), 각 그룹당 100개 포함된 페트리 접시로 옮겼습니다. 투여일을 0일로 계산하였다. 신선한 약품이 포함된 배지를 매일 교체하고 선충의 사멸을 기록하여 시스탄체 데데티콜라의 안전한 투여량 범위를 얻었다.
2.9 스트레스 실험
N2 선충은 다양한 질량 농도의 Cistanche Deserticola(0, 25, 50, 75 ug·mL–1)를 포함하는 세포로 옮겨졌습니다.
) 페트리 접시에서는 각 그룹당 100개입니다. 약물 투여일을 0일로 계산하였다. 새로운 약물이 함유된 배양액을 매일 교체하였다. 약물 투여 7일차에 스트레스 실험을 실시하였다. 산화 스트레스 실험에서는 각 그룹의 선충을 NGM 배지(NGM 배지 10 mL마다 10 μL의 30% H2O2 첨가)로 옮기고, 선충의 생존을 30분마다 기록하였다. 열 스트레스 실험에서는 선충을 35도에 지속적으로 노출시켜 배양하였으며, 2시간마다 선충의 생존상태를 기록하였다.
2. 10 신체 굽힘 실험
N2 선충을 그룹화하고 2.9와 동일한 치료법을 투여합니다. 약물 투여 후 3일과 7일째에 신체 굽힘 실험을 실시하였다. 각 그룹에서 20마리의 선충을 채취하였고, 30초 이내에 선충의 몸 굽힘 횟수를 검출하여 기록하였다.
2. 11 인두펌프 실험
N2 선충을 취하여 2.9와 동일한 조건으로 그룹화하여 투여하고, 각 페트리 접시에 선충 1개씩 넣고, 질량농도별로 5개의 평행선을 설정한다. 투여 0일, 3일, 7일에 실체현미경으로 관찰하십시오. 선충의 삼키는 빈도는 매번 60초 동안 관찰되었으며 인두 펌프의 수를 기록했습니다.
2.12 재현 실험
L1 단계 N2 선충을 취하여 약물-약물 배지에 넣고 L4 단계까지 배양합니다. 그런 다음 매일 질량 농도가 다른 새로운 약물 함유 배지로 옮기고 선충이 낳은 알의 수를 측정합니다. 알이 담긴 오래된 플레이트를 20도에서 48시간 동안 배양한 후 자손의 수를 측정했습니다. 각 페트리 접시에는 1개의 선충이 포함되어 있으며 각 질량 농도에 대해 5개의 평행선이 설정되어 있습니다.
2.13 리포푸신 축적의 측정
N2 선충을 그룹화하고 각 그룹에 100개의 선충을 사용하여 2.9와 동일한 치료법을 투여합니다. 리포푸신 측정 실험은 약물 투여 7일차와 11일차에 진행하였다. 선충 35개를 무작위로 선정하여 2% agarose sheet에 놓고 2% NaN3로 마취시킨 후 형광현미경을 이용하여(여기광 파장은 360~370 nm, 방출광(파장: 420~460 nm)을 관찰함) 선충에서 자가형광을 수행하고 imageJ 1.51 소프트웨어를 사용하여 형광 강도를 정량화합니다.
2. 14 MDA, ROS 함량 및 항산화 효소 활성 측정
N2 선충을 취하고, 그룹화하고, 각 그룹에 100개의 선충을 사용하여 2.9와 동일한 치료법을 투여합니다. 투여 후 7일째 각 군의 배양액 위의 선충을 0.9% 염화나트륨 용액으로 세척하여 1.5 mL 원심분리관에 모아 얼음 위에서 균질화한 후 3000 r·min으로 원심분리하였다{{ 10}} 10분간(원심반경 42.5mm) 원심분리 후 상층액을 취하고, 키트를 이용하여 SOD, CAT, GSH-Px, MDA 함량의 활성을 측정한다. ROS 결정 실험에서는 선충을 M9 완충액으로 3회 세척한 후 최종 농도가 10μmol·L-1인 DCFH-DA 용액에 넣고 37도 암소에서 20분간 배양하면서 5회마다 흔들어주었다. 분. 그런 다음 M9 버퍼로 두 번 세척하고 선충을 유리 슬라이드에 놓습니다. 형광 현미경(여기광 파장 485nm, 방출광 파장 520nm)을 사용하여 사진을 찍고 ImageJ 1.51 소프트웨어를 사용하여 상대 형광 강도를 평가합니다.
2. 15 붕괴 가속 인자-16(DAF-16), SKN-1 및 SOD-3의 핵 전위, 글루타티온 S-트랜스퍼라제-4(GST{{ 8}}), 열충격 단백질-16. 2 (HSP -16. 2) DAF-16 및 SKN-1 단백질 핵 전위 실험을 위해 각각 TJ356 및 LG333 형질전환 선충을 사용한 시각화.
CF1553, CL2166 및 TJ375 형질전환 선충을 사용하여 SOD-3, GST{4}} 및 HSP-16.2 단백질의 발현을 결정했습니다. 그룹화 및 관리는 2.9 이하와 동일합니다. 약물 투여 후 7일째 되는 날 형광현미경을 이용하여 각 군의 선충 사진을 촬영하였고, ImageJ 1.51 소프트웨어를 이용하여 GFP 형광강도를 정량화하였다.
2. 16 돌연변이 선충의 수명 결정
실험은 각각 CF1{13}}38, EU1, PS3551, DA1116 선충을 이용하여 진행하였고, 대조군과 Cistanche Deserticola 75 ug·mL-1 투여군으로 나누어 진행하였다. 각 그룹의 선충의 생존율을 매일 계산했습니다. 2. 17 qRT-PCR 실험: L4 단계 N2 선충을 다양한 질량 농도의 Cistanche Deserticola(0, 25, 50, 75 ug·mL–1)가 포함된 NGM 배양 배지(150 μmol·L–1 펜트플루오로우라실 함유)로 옮겼습니다. 20 6일 동안 3도에서 배양합니다. Trizol 방법을 사용하여 선충의 총 RNA를 추출하고 mRNA 정량화를 위해 cDNA로 역전사했습니다. 데이터는 2–ΔΔCt 방법을 사용하여 처리되었으며 act-1 가 내부 참조 유전자로 사용되었습니다.
2. 18 데이터 분석
통계분석은 SPSS 19.0 소프트웨어를 사용하였으며, 데이터는 (-x±s)로 표현하였다. 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 분석되었으며, P<0.05 was considered a statistically significant difference.
3. 결과
3.1 Cistanche Deserticola의 잠재적 활성 성분 및 표적
문헌을 검토하고 본 연구그룹의 이전 연구와 결합하여 페닐에타노이드 배당체, 이리도이드 및 리그난을 포함한 12개의 화학 성분을 네트워크 약리학 연구의 표적 화합물로 선택했습니다. 구체적인 정보는 표 3에 나와 있습니다. 데이터베이스에서 중복 항목을 제거한 후 12개의 잠재적 활성 성분에 대한 총 86개의 목표를 얻었습니다.
