Pradosia Mutisii 메탄올 추출물의 주름 방지 및 멜라닌 생성 억제 효과 2부

4. 재료 및 방법미백을 위한 Cistanche Tubulosa 클릭

4.1. 재료

시탕슈또한 콜라겐 생성을 촉진하는 기능을 가지고 있어 피부의 탄력과 광택을 증가시키고 손상된 피부 회복에 도움을 줄 수 있습니다.피부 세포. 시탕슈페닐에탄올 배당체상당한 하향 조절 효과가 있습니다.티로시나제활동 및 tyrosinase에 대한 효과는 경쟁적이고 가역적인 억제로 나타나 Cistanche의 미백 성분을 개발하고 활용하기 위한 과학적 근거를 제공할 수 있습니다. 따라서 cistanche는 피부 미백에 중요한 역할을 합니다. 그것은 멜라닌 생성을 억제하여 변색과 칙칙함을 줄일 수 있습니다. 홍보하고콜라겐피부 탄력과 윤기를 개선하는 생산. cistanche의 이러한 효과에 대한 광범위한 인식으로 인해 많은피부호분제품은 소비자 요구를 충족시키기 위해 Cistanche와 같은 허브 성분을 주입하기 시작하여 Cistanche의 상업적 가치를 증가시켰습니다.피부 미백제품. 요약하면, 피부 미백에 있어서 cistanche의 역할은 매우 중요합니다. 항산화 효과와 콜라겐 생성 효과로 칙칙함과 칙칙함을 감소시키고 피부 탄력과 윤기를 개선하여미백효과. 또한 피부 미백 제품에 Cistanche를 광범위하게 사용하는 것은 상업적 가치에서 그 역할을 과소평가할 수 없음을 보여줍니다.

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더 요청:

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HaCaT, B16F10 및 HEK293 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입했습니다. 신생아의 기본 HDF 세포(SKU: FC-0001)는 Lifeline(Oceanside, CA, USA)에서 구입했습니다. MTT, 태아 소 혈청(FBS), 인산염 완충 식염수(PBS), 페니실린 및 Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM)는 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입했습니다. L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA), 5-하이드록시-2-하이드록시메틸-4H-피라논(코직산), 모노페놀 모노옥시게나제(버섯 티로시나제) , 4-하이드록시페닐- -D-글루코피라노시드(알부틴), -멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH), 폴리에틸렌이민(PEI), 1-디페닐-2 피크릴히드라질(DPPH) , 2,20 -casino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt(ABTS), 과산화수소(H2O2), 레티놀(RE), 아스코르브산(AA) 및 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)은 Sigma–Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. TRIzol 시약은 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. 중합효소연쇄반응을 위한 프라이머 세트는 Macrogen(서울, 한국)에서 합성하였고, PCR premix는 Bio-D Inc.(서울, 한국)에서 구입하였다. p38, ERK, JNK 및 액틴의 인 또는 전체 형태는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입했습니다.

4.2. UHPLC를 통한 Pm-ME의 화합물 분석, 음성 전기분무 이온화 고분해능 탠덤 질량분석법(UPLC/HRMS)과 결합

P. mutisii(Pm-EE)의 95% 메탄올 추출물은 한국식물추출은행(대전, 한국)에서 구입하였다. 삼중 사중극자 질량 분석기가 장착된 Shimadzu Ultra Performance LCMS 805{{20}} 시스템(Shimadzu, Kyoto, Japan)을 사용하여 UPLC/HRMS(Orbitrap) 분석으로 화합물 분석을 수행했습니다. 네거티브 모드에서 작동하는 전자분무 이온화(ESI) 소스와 함께. Lab Solutions 소프트웨어 버전 5.2(Shimadzu)는 이전에 보고된 대로 사용되었습니다[68,69]. 시료 용액을 적절한 프리컬럼이 있는 역상 컬럼(BEH C8, 1.7µm, 2.1mm × 150mm, Waters, Milford, MA, USA)에 주입했습니다. 컬럼은 40 ◦C로 유지되었습니다. 이동상은 0.25 mL/min의 유속에서 10 mM 포름산(용매 A)과 아세토니트릴(용매 B) 수용액의 혼합물로 구성되었습니다. 이동상의 선형 구배 및 등용매 펠로우는 0.8분 동안 5% B, 다음 0.4분 동안 5-10% B, 0.70분 동안 등용매 10% B, 다음 0.5분 동안 10-15% B, 등용매 15 1.30분 동안 퍼센트 B, 1.30분 동안 15–21퍼센트 B, 등용매 1.20분 동안 21퍼센트 B, 다음 0.50분 동안 21–27퍼센트 B, 그 다음 3.30분 동안 27–50퍼센트 B, 50–1{{54} 2.00분 동안 }% B, 1.00분 동안 등용매 100% B, 5분 동안 100–5% B. 프로그램 종료 시 컬럼을 초기 조건에서 2.70분 동안 평형화했습니다. 압력은 크로마토그래피 실행 중 45~50MPa 범위였습니다. 폐수는 전기분무 소스(계면 온도 300 ºC, 열 차단 온도 400 ºC, 모세관 전압 3.0 kV)에 도입되었습니다. 아르곤은 충돌 가스로 사용되었고 질소는 분무 가스로 사용되었습니다. 액체 크로마토그래피와 질량 분석 검출기 사이의 인터페이스는 ESI를 사용하여 수행되었습니다. 음이온 모드(즉, [MH]-)에서 전구체 이온 전체 스캔 후, 탠덤 질량 분석법을 사용하여 생성 이온을 결정했습니다. 높은 민감도 외에 높은 특이성을 달성하기 위해 다중 반응 모니터링 모드에서 분석을 사용했습니다.

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4.3. 세포 배양

HaCaT 세포(인간 케라티노사이트 세포주), B16F10 세포(뮤린 멜라노사이트 세포주) 및 HDF 세포(인간 섬유아세포 세포주)는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양한 반면 HEK293 세포( 인간 배아 신장 세포주)를 5% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양했습니다. 모든 세포는 5% 습도 인큐베이터에서 37 ºC로 유지되었습니다.

4.4. 세포 생존능 분석

HaCaT 세포를 24시간 동안 96-웰 플레이트에 웰당 4 × 104 세포의 밀도로 시딩한 후, Pm-ME로 24시간 동안 처리하였다. B16F10 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1 × 104세포의 밀도로 파종하고 동일한 조건에서 처리하였다. HDF 세포를 24시간 동안 96-웰 플레이트에 mL당 1 x 105세포의 밀도로 시딩했습니다. 앞서 언급한 세포주에 대한 세포 생존력은 MTT 분석을 사용하여 측정되었습니다. 여기서 세포는 먼저 10μL/웰의 MTT 용액으로 3시간 동안 배양한 다음 100μL의 MTT 중지 용액(10% 소듐 도데실 황산나트륨 퍼센트 HCl). 8시간 후, 가용화된 포르마잔의 흡광도를 광학 밀도 판독기(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.

cistanche lost empire

4.5. 자유 라디칼 소거 활동

Pm-ME의 라디칼 소거 활성은 ABTS 분석을 사용하여 결정되었습니다. ABTS 분석은 이전에 보고된 대로 수행되었습니다[70]. 간략하게, 7.4mM ABTS 및 2.4mM 과황산칼륨 용액을 1:1 비율로 혼합하고 실온에서 밤새 인큐베이션하여 ABTS 라디칼화를 생성하였다. 그런 다음 다양한 농도의 Pm-ME(0~200µg/mL) 또는 AA(100µg/mL)를 ABTS 용액과 혼합하고 96-웰 플레이트로 옮긴 다음 섭씨 37도 730 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 소거 효과는 다음과 같이 계산되었습니다.

ABTS 소거 효과(백분율) {{0}} [(A0−A1)/A100] × 100

여기서 A0는 ABTS의 흡광도이고 A1은 샘플의 흡광도입니다.

4.6. DAPI 염색

HaCaT 세포는 이전에 멸균된 둥근 유리 커버슬립이 들어 있는 12-웰 플레이트에 4 × 105개 세포/mL의 밀도로 접종되었습니다. 24시간 후, 세포를 Pm-ME로 30분 동안 처리하고, PBS로 세척하고, H2O2(50μM)로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS 중 3.7% 파라포름알데히드 1mL로 10분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS로 2회 더 세척하고 DAPI 시약(1 μL/mL)으로 30분 동안 염색한 다음 PBS로 2회 더 세척하였다. 그런 다음 커버 슬립을 장착 용액을 사용하여 직사각형 유리 슬라이드에 장착하고 실온에서 24시간 동안 건조시켰다[71]. Nikon Eclipse Ti 형광 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 샘플을 검사했습니다.

4.7. UVB 조사 및 형태학적 변화 분석

HaCaT 세포를 6-웰 플레이트에 4 × 105개 세포/mL의 밀도로 접종했습니다. 세포를 Pm-ME로 30분 동안 처리하고 PBS로 세척한 다음 UVB 램프(Bio-link BLX-312, Vilber Lourmat , Collegien, France)는 이전에 보고된 바와 같이 290nm 미만의 모든 파장을 제거하는 Kodak Kodacel K6808® 필터를 장착했습니다[72]. UVB 처리 후, 세포는 이전 논문[36]에 따라 Pm-ME로 24시간 동안 처리되었습니다. NIH 이미징 소프트웨어(Bethesda, Maryland, USA)가 장착된 비디오 카메라에 부착된 도립 위상차 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 형태학적 변화를 평가했습니다.

4.8. 반정량적 RT-PCR 분석

HaCaT 세포를 12-웰 플레이트에 4 × 105세포/mL의 밀도로 시딩하였다. UVB 분석을 위해 이전 섹션에서 설명한 대로 세포 처리를 수행했습니다. H2O2 처리를 위해 세포도 12-웰 플레이트에 4 × 105cells/mL의 밀도로 시딩하고 Pm-ME로 30분 동안 처리한 후 PBS로 세척했습니다. , H2O2(5{{60}} μM)로 24시간 동안 처리했습니다. HaCaT 세포에 대한 Pm-ME 보습 효과를 확인하기 위해 먼저 화합물(0–100 µg/mL)로 처리한 다음 mRNA 추출을 수행했습니다. 피부 노화 및 보습에 대한 MAPK의 역할을 결정하기 위해 HaCaT 세포를 20 μM의 SB203580(p38 억제제), SP600125(a JNK 억제제)로 30분 동안 전처리한 후 H2O2(50 μM)에서 24시간 동안 인큐베이션하고, mRNA를 추출하고 MMP-9 및 COX-2의 수준을 정량화했습니다. ERK의 역할을 결정하기 위해 HaCaT 세포를 20 μM의 ERK 억제제(U0126) 단독 또는 Pm-ME(100 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 후 HAS-2 수준을 측정했습니다. Pm-ME가 Col1A1 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 HDF 세포를 6-웰 플레이트에 24시간 동안 mL당 1 x 105 세포의 밀도로 시딩하고 Pm-ME(0–100 µg/ mL)을 24시간 동안 처리한 다음 mRNA 추출을 수행합니다. Pm-ME가 UVR 및 ROS 노출 후 감소된 콜라겐의 유전자 발현을 회복할 수 있는지 확인하기 위해 HDF 세포를 6-웰 플레이트에 mL당 1 x 105개 세포의 밀도로 24시간 동안 시딩하고 Pm- ME(0–100 µg/mL)를 30분 동안 H2O2(50 µM) 또는 UVB 방사선(30 mJ/cm2)에 노출시키고 Pm-ME(0–100 µg/mL)로 24시간 동안 추가 배양했습니다. 제조업체의 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 총 mRNA를 추출했습니다. 반정량적 RT-PCR 분석은 이전에 기술된 바와 같이 MuLV 역전사효소를 사용하여 수행되었습니다[37]. RNA(1 μg)를 70 °C에서 5분 동안 oligo-dT15와 함께 배양하고 5× first-strand buffer, 10 mM의 dNTPs 및 0.1 M dithiothreitol과 혼합한 다음 37 °C에서 5분 동안 추가로 배양했습니다. 및 MuLV 역전사효소(2U)를 첨가한 후 60분 동안. 70℃에서 10분 동안 반응을 끝내고 RNase H를 첨가하여 전체 RNA를 제거하였다. PCR 반응은 인큐베이션 혼합물(2 μL cDNA, 4 M 50 및 30 프라이머, -HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250µM의 dNTP, 25mM의 MgCl2 및 1단위의 Taq 중합효소(Promega, Madison, WI, USA)) 조건: 94°C에서 45초의 변성 시간, 55~60°C에서 45초의 어닐링 시간, 72°C에서 60초의 확장 시간 및 25~30주기 후 72°C에서 7분의 최종 확장. 본 실험에 사용된 프라이머(Bioneer, Seoul, Korea)는 Table 1과 같다.

cistanche powder bulk

4.9. 플라스미드 형질감염 및 루시퍼라제 리포터 유전자 분석

루시퍼라제 리포터 유전자 분석을 위해 HEK293 및 HDF 세포를 먼저 24-웰 플레이트에 1 × 105 세포/웰의 밀도로 시딩했습니다. 그런 다음 두 세포주 모두 1kb의 Col1A1 프로모터 영역과 -갈락토시다제(형질감염 대조군) 유전자(0.8μg/mL)를 포함하는 pCMV0Red Fireffly Luc 플라스미드로 형질감염되었습니다. PEI 방법을 사용하여 24시간 동안 형질감염을 달성하였다. 그런 다음 추가 24시간 동안 화합물(0–100 µg/mL)로 처리했습니다. Col1A1 유전자 상향 조절 화합물[60]인 레티놀(10 μg/mL)을 양성 대조군으로 사용했습니다. Luciferase 활성은 이전에 보고된 바와 같이 Luciferase Assay System(Promega)에 따라 측정되었습니다[37]. 세포 용해물을 Eppendorf 마이크로원심분리기에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리했습니다. 그런 다음, 50 μL의 상등액 분획을 50 μL의 루시페라제 기질과 함께 배양하고, 상대 루시페라제 활성을 Luminoskan Ascent(Thermo Labsystems Oy, Helsinki, Finland)로 측정했습니다. 루시퍼라제 활성은 α-갈락토시다제 활성으로 정규화되었고, 37℃에서 5분 동안 X-gal 및 용해물과 효소 반응에 의해 405 nm에서 측정되었다.

4.10. 멜라닌 생성 및 멜라닌 분비 분석

B16F10 세포를 -MSH(100nM) 및 Pm-ME(0–100μg/mL) 또는 알부틴(1mM)으로 48시간 동안 처리했습니다. 세포로부터의 멜라닌 분비를 측정하기 위해 Spectramax 250 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포 배양 배지의 흡광도를 475 nm에서 측정하였다. 세포를 차가운 PBS로 세척하고 수확하였다. 멜라닌 함량 측정을 위해 세포 용해 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM NaF, 25mM -글리세롤포스페이트 pH 7.5, 120mM NaCl 및 2% NP-40) 물) 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 10% DMSO를 함유한 100µL 1M NaOH에 60ºC에서 30분 동안 용해했습니다. Spectramax 250 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 각 분획의 흡광도를 405nm에서 측정했습니다[36].

4.11. 티로시나아제 분석

티로시나제 효소 활성을 측정하기 위해 50 mL의 L-DOPA, 50 mL의 Pm-ME(0–400 μg/mL) 또는 300 μM의 Kojic acid를 버섯 티로시나제(100 μg/mL)와 함께 15분 동안 배양했습니다. U/mL) 실온에서. 각 샘플의 흡광도는 Spectramax 250 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 475nm에서 측정되었습니다.

how to use cistanche

4.12. 웨스턴 블롯 분석

HaCaT 세포를 Pm-ME(0–100 μg/mL)로 30분 동안 전처리한 다음 H2O2(50 μM)로 24시간 동안 처리했습니다. 세포 용해물은 이전에 Park et al. [73]. 용해물을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용한 후 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 특정 항체를 사용하여 전체 및 인산화 형태의 표적 단백질을 검출하고 화학발광 시약으로 가시화했습니다.

4.13. 통계 분석

모든 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. Mann-Whitney 테스트를 사용하여 실험군과 대조군 간의 통계적 차이를 비교했습니다. p-value < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 모든 통계 분석은 SPSS 프로그램(SPSS, Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행하였다.

데이터 가용성:이 연구 결과를 뒷받침하는 데 사용된 데이터는 요청 시 해당 작성자에게 제공됩니다.

저자 기여:LRL, M.-YK, BCY 및 JYC가 실험을 설계했습니다. LRL은 실험실 분석을 수행했습니다. LRL, M.-YK, BCY 및 JYC가 데이터를 분석했습니다. LRL, M.-YK, BCY 및 JYC가 원고를 작성했습니다. 모든 저자는 원고를 읽고 승인했습니다.

자금 조달: APC를 포함한 이 연구는 대한민국 국립암센터(지원 번호: 1810960-1)의 지원을 받았습니다.

이해 상충: 저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

약어

Pm-ME P. mutisii 메탄올 추출물

MMP 매트릭스 메탈로프로테이나제

-MSH -멜라닌 세포 자극 호르몬

ROS 반응성 산소 종

KA 코직산

L-DOPA L-3,4-디히드록시페닐알라닌

자외선 자외선

DAPI 6-디아미디노-2-페닐인돌

H2O2 과산화수소

MAPK 미토겐 활성화 단백질 키나아제

ERK 세포 외 신호 조절 키나아제

JNK c-Jun-N-말단 키나아제

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

ABTS 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt

AA아스코르빈산

RT-PCR 역전사-중합 효소 연쇄 반응

참조

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Ishige Okamurae에서 분리된 Ishophloroglucin A는 -MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 억제합니다: In Vitro 및 In Vivo Part 2

36H: 항멜라닌 생성을 위한 새로운 강력한 억제제 1부