PART 1 장내 미생물 항상성 회복을 통한 예측 불가능한 만성 스트레스 쥐에 대한 Cistanche Tubulosa 추출물의 항우울제 유사 효과

우울증과 같은 신경 정신 질환이 장-뇌 축을 통해 장내 미생물군유전체와 연결된다는 증거가 늘어나고 있습니다.시스탄체스 허바중국 전통 의학(TCM)의 "신양" 결핍 치료로 잘 알려져 있으며 최근 몇 년 동안 신경 퇴행성 질환 치료에 사용되었습니다. 이 연구에서는 만성 예측할 수없는 스트레스 (CUS) 유발 우울증 모델을 설정하여시스탄체 튜불로사행동 테스트, 모노아민 신경 전달 물질, 해마와 결장의 신경 영양 인자, 장내 미생물 구성 및 단쇄 지방산(SCFA) 생산에 대한 추출물(CTE). 또한, 상관 분석을 사용하여 변경된 장내 미생물총, 해마 및 결장에서 신경전달물질 및 신경영양소의 변화, SCFA 농도 장애 간의 기능적 관계를 평가했습니다. CTE는 CUS에서 쥐의 우울증과 유사한 행동을 크게 개선했습니다. CUS 쥐에서 5-히드록시트립타민(5-HT)의 뇌 수준과 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 발현이 CTE에 의해 회복되었습니다. 장내 미생물총의 상대적인 풍부함과 아세테이트 및 헥산산의 농도도 CTE 처리에 의해 조절될 수 있습니다. 우리는 CUS 쥐에 CTE를 적용하면 장내 미생물 구성, 해마 신경 전달 물질 수준 및 신경 활성 대사 산물 SCFA 생산 사이에 강한 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. 종합하면, 이러한 결과는 CTE가 미생물군-장-뇌 축 장애에 대한 장내 미생물군의 항상성을 회복함으로써 우울 증상에 대한 잠재적인 치료법임을 확인하고 신경정신약리학 분야에서 새로운 길을 열었습니다.

키워드: 시스탄체 튜불로사, 항우울제, 예측할 수 없는 만성 스트레스, 장내미생물총, 장내미생물총-뇌축

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소개

시스탄체스 허바(중국어로 Rou Cong-Rong)은 공식적으로 말린 다육 줄기로 기록됩니다.시스탄체 데저티콜라(YC Ma) 및시스탄체 튜불로사(Schrenk) 중국 약전 위원회(2015). 그것은 신장 결핍, 발기 부전, 여성 불임, 병적 백반증, 심한 요실금,

에키나코사이드cistanche에서 촉진할 수 있습니다상처 치유

및 노인성 변비(Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015). 이전 연구에서 몇 가지 주요 화학 성분이 밝혀졌습니다.시스탄체스 허바, 페닐에타노이드 배당체(PhG), 이리도이드 및 이리도이드 배당체, 리그난, 알디톨, 올리고당 및 다당류를 포함합니다. 약리학적 분석에 따르면 Cistanches Herba는 광범위한 신경 보호, 면역 조절, 항염증 및 간 보호 활성을 나타냅니다(Jiang and Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhGs는 신경 보호, 면역 조절, 항염증, 간 보호, 항산화 등과 같은 다양한 약리학적 활성을 갖는 Cistanches Herba의 주요 활성 성분으로 간주되어 왔습니다(Jiang and Tu, 2009; Fu et al., 2017). Cistanches Herba는 원래 서기 200년에서 250년 사이에 쓰여진 약용식물에 관한 유명한 책인 한의학의 고전(중국어로 "Shennong Bencao Jing")에 "5(내장)"를 조절할 수 있는 "높은 약초"로 기록되어 있습니다. ) 계통과 일곱 가지(과식, 분노, 습기, 추위, 근심, 비바람, 두려움) 장애"(Huang, 1982). 오늘날 Cistanches Herba는 전신 쇠약에 대한 약초 강장제로 널리 받아들여지고 있습니다(Fu et al., 2017).C. 튜불로사배당체 캡슐(Memoregain®)은 알츠하이머병 치료에 사용됩니다(Guo et al., 2013). 기능 장애 도파민 작용 시스템은 우울증의 모노아민 가설의 주요 병인 중 하나입니다(Duman et al., 1997; Krishnan and Nestler, 2008). Cistanche 살사의 Echinacoside(PhG 중 하나) 및 PhG는 1-메틸{4}}페닐-1,2,3, {8}}C57 마우스의 선조체에서 DA 수준을 증가시킬 수 있는 테트라하이드로피리딘(MPTP)(Tian and Pu, 2005; Geng et al., 2007). 또한 catalpol과 geniposide는 Cistanches Herba의 두 가지 대표적인 이리도이드이며, 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축 기능 장애를 복원하여 만성 예측할 수 없는 스트레스(CUS)로 인한 우울증과 유사한 행동을 개선하는 것으로 밝혀졌으며 카탈폴은 뇌를 상향 조절할 수 있습니다. 파생된 신경영양 인자(BDNF) 발현(Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). 더욱이, 최신 간행물은 Cistanches Herba 달인이 마우스 꼬리 서스펜션 테스트에서 부동 기간을 유의하게 감소시켰다는 새로운 증거를 제공합니다.

한의학은 비교적 경미한 부작용으로 인해 우울증 치료제로 점점 더 주목받고 있습니다(Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). 생약(진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rg3 및 Yuanzhi{4}})의 개별 화합물과 같은 다양한 유형의 TCM(Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), 단일 한약 재료(Panax 인삼 뿌리, Acorus tatarinowii rhizome 및 Morinda Officinalis)(Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) 및 TCM 달인(Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan 및 Xiaocaihutang)(Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016)은 깊이 연구되고 보여졌습니다. 우울증과 유사한 증상을 역전시키거나 완화하기 위해. 예를 들어 Kai-Xin-San은 신경 전달 물질, 신경 영양 인자 및 해당 수용체의 수를 증가시키고 시냅토타그민 및 수지상 척추 밀도의 발현을 촉진함으로써 CUS 유발 우울 쥐의 증상을 현저하게 완화시키는 것으로 밝혀졌습니다(Yan et al. , 2016).

그럼에도 불구하고, TCM에 대한 이전 연구는 우울제 유사 행동 테스트의 결과에 의존하고 기존의 약리학적 작용 메커니즘에 중점을 둡니다. 경구 투여된 TCM과 장내 미생물총의 항우울제 효능 사이의 연관성은 잘 알려져 있지 않습니다. 장내 미생물총이 뇌 기능, 특히 우울증 및 기타 스트레스 관련 장애를 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 증거가 늘어나고 있습니다(Foster and Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). 예를 들어, 만성 스트레스는 Firmicutes/Bacteroidetes 비율의 감소, 보다 구체적으로 Lactobacillus의 상대적 풍부도 감소 및 Oscillibacter의 증가와 함께 쥐 장내 미생물 구조의 조절 장애를 초래합니다(Meng et al., 2017). 더욱이, 우울증 환자에서 무균 마우스로 조절되지 않은 미생물총의 대변 이식은 이 동물에서 우울증과 유사한 표현형을 부여했으며, 이는 조절되지 않은 장내 미생물총이 우울증 및 불안의 행동 및 생리학적 증상을 유발함을 나타냅니다(Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). 동물 실험에서 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스와 같은 일부 미생물총 조절제는 장내 미생물을 개선하여 만성적으로 스트레스를 받는 쥐의 우울증 유사 행동을 개선하는 것으로 밝혀졌습니다(Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017). ).

장내 미생물군과 질병 발달 사이의 연관성과 장내 미생물군 구조의 가소성을 감안할 때, 우리는 장내 미생물군이 우울증을 매개하는 효과를 조사하기로 결정하고 우리의 관심을 끌었고 조사되었습니다(Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). 이를 달성하기 위해 16S rRNA 유전자 시퀀싱 결합 메타 통계 분석(White et al., 2009)을 수행하여 장내 미생물 구성을 분석했습니다. 본 연구에서는C. 튜불로사에 비해 PhGs 수치가 더 높기 때문에 항우울제 유사 효과를 평가하기 위해 선택되었습니다.C. 데저티콜라. 쥐의 CUS 유발 우울증 모델은C. 튜불로사 추출물(CTE, 행동 테스트, 모노아민 신경전달물질, 해마와 결장의 신경영양 인자, 장내 미생물 구성 및 단쇄에 대한 48.6%의 PhG, 6.9%의 이리도이드 배당체 및 20.0% 총 당류로 구성) 지방산(SCFA) 생산. 더욱이, 변경된 장내 미생물총 사이의 기능적 관계는 해마와 결장 모두에서 신경전달물질과 뉴로트로핀을 변화시켰고, SCFA의 농도를 교란시켰습니다. 상관 분석은 CTE가 미생물군-장-뇌 축을 조절함으로써 우울증 치료를 위해 장내 미생물군을 표적으로 한다는 증거를 입증하는 데 사용되었습니다.

재료 및 방법

재료

Fluoxetine(FLX)은 Aladdin Industrial Inc.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 5-히드록시트립타민(5-HT), 노르에피네프린(NE) 및 BDNF ELISA 키트는 Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute(중국 난징)에서 구입했습니다. HPLC 등급 아세토니트릴은 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. Milli-Q 정수 시스템(Millipore, Bedford, MA, United States)을 사용하여 증류수에서 탈이온수를 제조했습니다. 사용된 다른 모든 시약과 화학물질은 분석 등급이었습니다.

말린 줄기C. 튜불로사Hetian County (Xinjiang, China)에서 수집되었습니다. 바우처 표본 샘플은 Xiaobo Li 교수에 의해 인증되었으며 Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, China) 약학 대학 식물 표본 상자에 기탁되었습니다. 균일한 분말C. 튜불로사줄기를 70% 에탄올의 10배에 현탁하고 100도에서 각각 1시간씩 3회 가열 환류시켰다. 추출물을 거즈를 사용하여 여과하고 진공 하에 65도에서 증발시키고 동결건조시켰다. 샘플을 재용해시킨 다음 거대다공성 수지 D101로 분리하였다. 흡착 후 물로 용출된 분획은 버렸다. CTE는 40% 에탄올로 용출한 후 얻은 다음 65도에서 진공 하에 증발시키고 동결건조시켰다.

CTE의 화학 성분 분석

CTE에서 PhGs의 상대적 함량은 표준으로 echinacoside를 사용하여 330nm에서 UV 분광광도법에 의해 결정되었습니다. 이리도이드 및 이리도이드 배당체의 상대 함량은 이중 파장 방법으로 UV 분광광도법으로 측정하여 PhG의 스펙트럼 간섭을 피하기 위해(237 nm는 분광 정량화에 사용, 등베선점 280 nm는 참조 파장에 사용), 제니포사이드를 사용했습니다. 기준으로. CTE의 총 탄수화물 함량은 포도당을 표준으로 하는 페놀-황산 비색법에 의해 결정되었습니다(Chow and Landhausser, 2004).

CTE의 주요 화학 성분은 UPLC-Q-TOF-MS로 특성화되었습니다. UPLC-Q-TOF-MS 분석은 ACQUITY UPLC BEH C18 컬럼(1{12}}0 mm x 2.1 mm id, 1.7 μm, Waters Corp., United States) a에서 0.1% 포름산 아세토니트릴(A) 및 0.1% 포름산 in water(B)를 사용한 구배 용리 0.4 ml/min의 유속. 기울기 프로필은 0-5분(A: 5-20퍼센트), 5-7.5분(A: 20-30퍼센트), 7.{24}}분( A: 30-70퍼센트), 10-11분(A: 70-100퍼센트), 1.5분 동안 유지됩니다. 구배는 0.5분 만에 5%로 다시 재활용되었고 다음 실행을 위해 2.5분 동안 유지되었습니다. 주입 부피는 3[il. 컬럼오븐의 온도는 35도로 설정하였다.

질량 분석은 Waters Vion IMS 질량 분석기(Waters Corp., Milford, MA, United States)를 사용하여 수행되었습니다. 이온화는 음의 전자분무(ESI) 모드에서 수행되었습니다. MS 매개변수는 다음과 같았다: 모세관 전압, 2.{1}} kV; 콘 전압, 2{16}} V; 소스 온도, 12{18}}도 ; 탈용매 온도, 500도 ; 콘 및 탈용매 가스 흐름, 각각 50 및 1,{7}} L/h. 정확한 질량 측정을 위해 잠금 질량으로 류신-엔케팔린을 사용하여 [MH]-이온(m/z 554.2615)을 생성했습니다. 두 가지 스캔 기능에서 MSE(Mass SpectrometryElevatedEnergy) 실험이 다음과 같이 수행되었습니다. 기능 1(저에너지): m/z 50-1,{15}}, 0.25초 스캔 시간, 0.02초 스캔 간 지연 , 6 eV 충돌 에너지; 기능 2(고에너지): m/z 50-1,000, 0.25초 스캔 시간, 0.02초 스캔 간 지연, 20-45 eV의 충돌 에너지 램프. 데이터는 UNIFI 1.8.1 소프트웨어(Waters Corp., Milford, MA, United States)를 사용하여 처리되었습니다.

시스탄체~할 수 있다신장 기능 개선

동물 실험

수컷 Sprague-Dawley 쥐(200 土 20 g)를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company(중국 베이징)에서 조달하여 Shanghai Jiao Tong University(중국 상하이)의 실험 동물 센터에 수용했습니다. 동물들은 12:12 h의 명암 주기로 통제된 실내 온도(25 土 2도, 55 土 10% 상대 습도) 하에서 그룹으로 수용되었습니다. 쥐는 1주일 동안 일반 실험실 쥐의 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 동물 시설 및 프로토콜은 Shanghai Jiao Tong University(중국 상하이)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

순응 1주일 후, 40마리의 순진한 쥐에게 72시간의 자당 훈련 및 자당 기준선 테스트 기간을 적용했습니다. 쥐는 자당 기준선 테스트에서 자당 선호도에 따라 5개 그룹(n=8)으로 나눴습니다(보충 그림 S1). 대조군과 CUS군에는 식염수(10 ml/kg)를 투여하였다. 다른 세 그룹의 경우 고용량 CTE(CTEH)(4{11}}mg/kg), 저용량(CTEL)(2{13}} mg/kg) 및 FLX(10 mg/kg) CUS 시술 1시간 전(오전 8시~9시)에 4주 동안 위내 투여했습니다.

예측할 수 없는 만성 스트레스는 이전에 설명한 대로(Willner, 1997; Xue et al., 2013), 스트레스를 받지 않은 대조군을 제외하고 일련의 스트레스 요인이 쥐에게 적용되었습니다. min), 백색소음(100dB) 1시간, 물 부족 24시간, 물병 1시간(물 부족 후), 음식 부족 24시간, 수영 강제(5분), 신체적 구속({{11 }} h) 24시간 동안 더러워진 케이지(100g 톱밥 침구에 200ml 물), 꼬리 핀치(1분), 24시간 동안 45도 케이지 기울기, 30분 동안 충격, 밤새 조명(12시간). 스트레스 요인은 4주 동안 지속적으로 무작위로 적용되었으며 자세한 내용은 보충 표 S1에 설명되어 있습니다. 음식과 물은 스트레스를 받지 않은 대조군 쥐에게 자유롭게 제공되었으며, 각 자당 테스트 전 14시간의 결핍 기간을 제외하고는 다른 방에서 방해받지 않았습니다. CUS 절차 중에 한 마리의 쥐가 사망했습니다. 강제수영검사(FST)를 시행한 후

4일 급성 투여 및 28일 스트레스 후, 자당 선호도 시험(SPT)(29일), 개방 필드 시험(OFT)(31일) 및 신규성 억제 섭식 시험(NSFT)(33일)을 수행하였다. CUS 및 행동 테스트를 위한 설계 개요는 보충 그림 S2에 나와 있습니다.

강제 수영 테스트는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다(Porsolt et al., 1978). 절차는 동일한 장치 및 조건(직경 20cm, 높이 45cm, 26도에서 유지되는 25cm의 물 포함)을 사용하여 사전 테스트 및 테스트 세션으로 구성되었습니다. 사전 테스트 세션 동안 쥐는 15분 동안 수영을 해야 했습니다. 24시간 후, 래트를 5분 수영 테스트 세션 동안 동일한 장치에 넣었습니다. 내부 수영 행동

비디오 카메라로 5분을 관찰하고 부동 시간을 측정하여 분석하였다.

SPT의 경우, 쥐는 SPT 전에 72시간 동안 1%(v/v) 자당 용액을 섭취하도록 먼저 훈련을 받았습니다. CUS 절차 전의 자당 기준선 테스트와 CUS 종료 시 SPT는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다(Xue et al., 2013).

Open-field test는 CUS 절차가 끝날 때 수행되었으며 장치와 방법은 이전에 자세히 설명된 것과 동일합니다(Xue et al., 2013). 총 이동 거리를 기록하기 위해 비디오 추적 시스템(Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.)이 사용되었습니다.

참신 억제 섭식 테스트는 이전에 설명된 대로 평가되었으며(Xue et al., 2013) 5분 이내에 식사를 시작하기 위한 잠복기가 기록되고 분석되었습니다.

신경전달물질 및 신경영양 인자 측정

행동 테스트 후, 각 쥐에서 최소 4개의 배설물 펠릿을 얻어 멸균 원뿔형 튜브에 넣은 다음 미생물 군집 및 SCFA 분석을 위해 -800℃에서 즉시 동결했습니다. 그 후, 쥐가 희생되었습니다. 해마와 결장을 분리하고 즉시 무게를 잰다. 조직 샘플을 식염수로 세척하고 액체 질소에서 급속 냉동하고 보관을 위해 -800℃에 보관했습니다. -200℃ 및 40℃에서 순차적으로 해동한 후, 조직 샘플을 식염수에서 균질화하고 2,500rpm/40℃에서 25분 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액을 수집하고 사용할 때까지 40℃에서 보관하였다. 해마와 결장의 5-HT, 해마의 NE, 해마의 BDNF 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 ELISA 키트에 의해 결정되었습니다(Hou et al., 2017).

장내 미생물의 조성 프로파일 분석

대변 ​​샘플에서 장내 미생물총의 총 DNA는 이전에 설명된 대로 추출되었습니다(Wei et al., 20{{20}}4). 각 대변 샘플({76}}.2g)을 1ml PBS에 혼합하고 완전히 균질화한 다음 200g에서 6분 동안 원심분리합니다. 상층액에 20 20% PVP를 첨가하고 300g에서 6분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 생성된 상등액을 12.}g에서 6분 동안 원심분리하고 세포 펠렛을 수확했습니다. 세포 펠릿을 PBS로 세척한 다음 300개의 용해물 I(150mM NaCl, 100mM EDTA·Na2·2H2, pH 8.0)에 재현탁시켰다. 현탁액을 100μl 라이소자임 용액(100mg/ml) 및 20μl 1% RNase와 혼합하고, 370℃에서 30분간 온욕시킨 다음, 300μl 용해물 II(100mM NaCl, 500mM Tris 염기, pH 8.0)를 첨가했습니다. . 세포 현탁액을 50 ± 20% SDS와 부드럽게 혼합하고 5분 동안 빙욕시켰다. 그런 다음 DNA를 1% PVP, Tris-평형화 페놀 및 클로로포름-이소아밀 알코올(vol/vol/vol/vol, 3.125:25:24:1) 및 클로로포름-이소아밀 알코올(vol/vol, 24 :1) 이어서 -200℃에서 2시간 동안 2부피의 에탄올 및 50[13M NaAc. DNA를 원심분리에 의해 수집하고, 공기 건조시키고, 100 ㎕의 멸균 탈이온수에 용해시켰다. 핵산 순도는 NanoDrop 2000c Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States)를 사용하여 테스트되었습니다. 그런 다음 총 게놈 DNA를 16S rRNA 유전자의 V{55}}V4 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 증폭: 정방향 프라이머 338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') 및 역방향 프라이머 806R(5 '-GGACTACHVGGGTTWTCTAAT- 3'). PCR 앰플리콘을 Agencourt AMPure 비드(Beckman Coulter, Indianapolis, IN, United States)로 정제하고 PicoGreen dsDNA 분석 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, United States)를 사용하여 정량화했습니다. 개별 정량화 단계 후 앰플리콘을 동일한 양으로 풀링하고 Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd(Shanghai, China)에서 MiSeq Reagent Kit v3와 함께 Illumina MiSeq 플랫폼을 사용하여 pair-end 2 x 300bp 시퀀싱을 수행했습니다. paired-end 읽기는 FLASH 소프트웨어(버전 1.2.7)를 사용하여 조립되었으며 원시 시퀀스 읽기는 QIIME 소프트웨어(버전 1.8.0)를 사용하여 품질 트리밍되어 길이 임계값 미만의 일치하지 않는 바코드 및 시퀀스를 제거했습니다. 그 후, 필터링된 시퀀스는 UCLUST와 함께 QIIME를 사용하여 97% 시퀀스 유사성의 임계값을 갖는 운영 분류 단위(OTU)로 클러스터링되었습니다. 가중 UniFrac 주 좌표 분석(PCoA)을 위해 QIIME에서 베타 다양성을 수행했습니다. 마지막으로 Meta stats 소프트웨어를 사용하여 다른 그룹 간의 장내 미생물 분류학적 구성의 차이를 비교했습니다.

SCFAs 농도 분석

쥐 배설물 샘플에서 SCFA(아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레르산, 이소발레르산 및 헥산산 포함)의 농도는 GC{0}} 가스 크로마토그래프(Shimadzu, Japan)에 의해 측정되었습니다. DB-FFAP 컬럼 포함(30 mx 0.25 mm x {{1{12}}}}.25 cm, Agilent, United States) 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레르산, 이소발레르산 및 헥산산의 표준 용액은 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01 및 0.005 mg/ml(에테르 포함)({20}} 메틸 발레르산 0.1 mg/ml을 내부 표준으로 포함). 각 대변 샘플(0.2g)을 40℃에서 20분 동안 5{28}} rpm에서 볼텍싱 및 원심분리하여 0.8ml 탈이온수에 혼합하고 50% H2SO4 및 500il 내부 표준에 의해 450il의 상청액을 첨가했습니다. 용액에 넣고 1분 동안 볼텍싱하고 12,{39}} rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음 혼합물을 40℃에서 30분 동안 두었다. GC 분석을 위해 상층액을 취했습니다. SCFA의 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다(Wang et al., 2016).

통계 분석

모든 데이터는 土 SEM 수단으로 제시되었다. 단방향 ANOVA와 함께 SPSS 21.{1}} 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL, United States)를 사용하여 통계 분석을 수행한 후 Dunnett's test 또는 Student's t-test를 수행했습니다. 평균에서 2 표준편차보다 큰 경우 데이터는 분석에서 제외되었습니다. p < 0.05의="" 값은="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="" 간주되었습니다.="" pearson의="" 상관="" 분석을="" 사용하여="" 장내="" 미생물총,="" scfa,="" 해마="" 5-ht,="" ne="" 및="" bdnf="" 수준의="" 상대적="" 풍부도와="" 결장="" 5-ht="" 간의="" 연관성을="">

결과

CTE의 화학 성분 분석

CTE의 화학적 조성은 먼저 종합적으로 분석되었습니다. 표 1에서 보는 바와 같이 PhGs는 CTE의 주성분으로 상대 함량은 48.6%, iridoids와 iridoid glycosides는 6.9%, 총당류는 20.0%였다. 이것들

그런 다음 UPLC-Q-TOF-MS를 사용하여 CTE의 구성 요소를 특성화했습니다. PhGs의 20개 성분, 5개의 이리도이드 및 이리도이드 배당체, 2개의 올리고당을 포함하여 총 27개의 성분이 검출 및 확인되었습니다. 머무름 시간, 정확한 MS 및 MS/MS 조각 이온을 포함한 자세한 정보는 지원 정보(보충 표 S2)에 나와 있습니다. CTE의 UPLC-Q-TOF-MS 총 이온 크로마토그램(TIC)은 보충 그림 S3에 나와 있습니다.

CTE는 CUS 쥐의 우울 행동을 개선했습니다.

CUS 쥐에서 FST의 총 부동 시간과 NSFT의 섭식 대기 시간은 CTE 처리에 의해 유의하게 감소되었으며 SPT의 자당 선호도와 OFT의 총 거리가 증가했습니다.

그림 1A는 CUS 쥐의 FST에서 부동 시간에 대한 CTE의 급성 효과를 보여줍니다. CUS 모델 그룹과 비교하여 3-일 CTE의 급성 경구 투여는 FST에서 총 부동 시간을 유의하게 감소시켰습니다[one-way ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. 추가 사후 분석은 관리가

표 1|화학 성분C. 튜불로사고용량 그룹(Dunnett's test, p < {0}}.05) 및 저용량 그룹(Dunnett 테스트, p < 0.05)을 사용한 CTE 추출물은 FST에서 총 부동 시간에서 현저한 감소를 보였습니다. .

CUS 쥐의 SPT에서 자당 선호도에 대한 CTE의 효과는 그림 1B에 나와 있습니다. 28일 스트레스 절차는 스트레스를 받지 않은 대조군과 비교하여 CUS 모델 그룹에서 자당 선호도를 유의하게 감소시켰습니다[one-way ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Dunnett's test, p < 0.05]는="" cus="" 모델이="" 성공적으로="" 개발되었음을="" 나타냅니다.="" 양성="" 대조군으로서="" flx군은="" cus="" 쥐에서="" 자당="" 선호도를="" 유의하게="" 증가시켰다[one-way="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.05],="" cus="" 모델의="" 예측="" 타당성을="" 보여줍니다.="" 고용량="" 그룹에서="" cte의="" 만성="" 경구="" 투여는="" 자당="" 선호도에="" 주요="" 효과를="" 보였다[one-way="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" dunnett's="" test,p="">< 0.01],="" cus="" 쥐에서="" 정상="" 수준으로="" 회복되었습니다.="" 저용량군의="" cte는="" 증가하는="" 경향을="" 보였으나="" 그="" 효과는="" 통계적으로="" 유의하지="" 않았다(dunnett's="" test,="">

그림 1C에서 볼 수 있듯이 OFT에서 다루는 총 거리는 CUS 쥐에 대한 CTE의 영향을 평가하는 데도 사용되었습니다. 스트레스를 받지 않는 쥐와 비교하여 CUS 모델 그룹은 훨씬 짧은 총 거리를 나타냈습니다[one-way ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; Dunnett's test, p < 0.001]="" cus에="" 4-주="" 노출되고="" 양성="" 대조군="" flx="" 처리는="" cus="" 쥐에서="" 총="" 거리를="" 증가시켰습니다[one-way="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnett의="" 테스트,="" p="">< 0.05].="" 고용량="" 및="" 저용량="" cte의="" 일일="" 경구="" 투여는="" cus="" 쥐에서="" 총="" 거리에="" 분명한="" 영향을="" 미쳤습니다[one-way="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnett's="" test,="" 고용량="" 그룹에="" 대해="" 각각="" p="">< 0.01,="" 저용량="" 그룹에="" 대해="" p="">< 0.001].="" 보충="" 그림="" s4는="" oft의="" 활동="" 트랙="" 맵을="">

그림 1D는 CUS 쥐의 NSFT에서 먹는 잠복기에 대한 CTE의 영향을 보여줍니다. 28일 스트레스 절차는 스트레스를 받지 않은 대조군과 비교하여 CUS 모델 그룹에서 먹기 시작하는 대기 시간의 상당한 증가를 야기했습니다[one-way ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}19; Dunnett's test, p < 0.05]는="" cus="" 모델이="" 성공적으로="" 개발되었음을="" 나타냅니다.="" 고용량의="" cte="" 장기="" 경구="" 투여는="" cus="" 그룹에="" 비해="" 섭식="" 시작까지의="" 잠복기에="" 명백한="" 영향을="" 나타냈지만(student's="" t-test,="" t{13}}.759,="" p="">< 0.05),="" 낮은="" 용량의="" cte는="" 효과="">

CTE는 CUS 쥐의 신경전달물질 및 신경영양 인자 수준을 회복시켰습니다.

CUS 쥐의 해마에서 {{{{10}}}}HT 및 NE 수준에 대한 CTE의 효과는 그림 2A,B에 나와 있습니다. 4주 스트레스 절차는 5-HT [one-way ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0의 상당한 감소를 초래했습니다.0{{39 }}01; Dunnett의 검정, p < 0.{57}}01]="" 및="" ne="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.001]="" 대조군과="" 비교하여="" cus="" 쥐의="" 해마="" 농도와="" 항우울제="" flx는="" 해마의="" 5-ht="" 수치를="" 유의하게="" 회복시켰습니다[one-way="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" dunnett의="" 테스트,="" p="">< 0.001].="" 고용량="" 그룹에서="" cte의="" 경구="" 투여="" 후,="" 5-ht="" 수준의="" 유의한="" 증가가="" 관찰되었습니다[one-way="" anova,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" dunnett's="" test,="" p="">< 0.001]="" ne="" 농도는="" 변경되지="" 않았습니다.="" 유사하게,="" bdnf="" 발현은="" 스트레스를="" 받지="" 않은="" 쥐와="" 비교하여="" cus="" 모델="" 그룹에서="" 유의하게="" 감소했습니다(student's="" t-test,="" t{43}}.171,="" p="">< 0.01)(그림="" 2c).="" 고용량의="" cte(student's="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" 및="" flx(student's="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0.05)의="" 장기="" 경구="" 투여="" 둘="" 다="" )="" cus="" 모델="" 그룹에="" 비해="" bdnf="" 발현="" 증가.="" 저용량의="" cte는="" bdnf="" 발현에="" 큰="" 영향을="" 미치지="">

CUS 쥐의 결장에서 {{0}}HT 수준은 해마에서와 달랐고 4-주간 스트레스 절차는 결장 5-HT에 영향을 미치지 않았습니다(그림 2D ). 반대로 CUS 모델 그룹과 비교할 때 고용량 CTE의 경구 투여는 결장에서 5-HT 수준을 자극했습니다(Student's t-test, t=2.173, p < 0.05).="" 저용량의="" cte는="" 결장="" 5-ht="" 수준에="" 영향을="" 미치지="">

CTE는 CUS 쥐의 장내 미생물 구성을 조절했습니다

CUS 쥐의 장내 미생물 조성에 대한 CTE의 효과는 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 기반 방법으로 평가되었습니다. CTE를 28일 동안 경구 투여하면 CUS 쥐의 장내 미생물 구성이 바뀌고 다양한 영향을 받는 것으로 나타났습니다.

쥐 그룹 간의 미생물 분류 수준(클래스 수준 1, 주문 수준 1, 가족 수준 1, 속 수준 8 및 종 수준 2). 이것은 장내 미생물 군집이 CTE의 항우울 효과에 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 다른 분류 수준에서 크게 변경된 장내 미생물 분류군의 자세한 정보는 표 2에 나와 있습니다.

MiSeq 시퀀싱은 품질 관리, 노이즈 제거 및 키메라 제거 프로세스를 거친 후 총 2,132,980개의 원시 읽기를 생성했습니다. 다음으로, 읽기는 문에서 종 수준까지 분류군에 할당된 OTU로 클러스터링되었습니다. 베타 다양성 분석의 연구는 5개의 쥐 그룹 사이의 박테리아 군집 패턴의 유사성을 탐색하기 위해 수행되었습니다. 5개의 쥐 연구 그룹에서 가중된 UniFrac 거리를 기반으로 한 PCoA는 그림 3A에 나와 있습니다. PCoA에 의한 베타 다양성 분석은 미생물 군집이 대조군과 CUS 모델군에서 명확하게 분리된 것을 보여주었으며, 고용량 군에서 CTE는 CUS 군에 비해 대조군에 더 가까운 경향이 있었다.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90퍼센트 . 보충 그림 S5A, B에서 볼 수 있듯이 4주 스트레스 절차는 대조군과 비교하여 CUS 모델 그룹에서 Firmicutes 수준이 증가하고 Bacteroidetes가 유의하지 않게 감소하는 경향이 없었습니다. 고용량 및 저용량으로 CTE를 매일 투여한 후, Firmicutes 및 Bacteroidetes의 상대적 풍부도는 통계적 유의성은 없었지만 대조군과 유사한 수준으로 되돌아갔습니다. 그리고 쥐 그룹 간의 Firmicutes / Bacteroidetes 비율에 대해 유사한 변화가 관찰되었지만 통계적 차이는 나타나지 않았습니다(보충 그림 S5C). CUS 모델 그룹에서 스트레스를 받지 않은 대조군과 비교하여 시아노박테리아 문의 수준 감소에 대한 유의하지 않은 경향이 발견되었습니다. 고용량으로 CTE를 투여하면 CUS 그룹과 비교하여 시아노박테리아의 상대적 풍부도가 크게 증가했습니다(보충 그림 S5D).

속 수준에서 Bacteroides와 Ruminococcus는 5개 쥐 그룹 모두에서 약 30%를 차지하는 가장 풍부한 미생물 분류군입니다. 4주 스트레스 절차는 스트레스를 받지 않은 대조군과 비교하여 CUS 모델 그룹에서 박테로이데스의 상대적 풍부도가 크게 감소하고 루미노코커스가 크게 증가했습니다(그림 4A, B). CTE의 장기 투여는 CUS 쥐에 비해 박테로이데스의 풍부함의 상당한 증가 뿐만 아니라 루미노코커스의 현저한 감소를 초래했습니다. 또한 Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus 및 Brachybacterium의 6개 속은 CUS 모델 그룹과 대조군 사이에 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다(그림 4C-H). CTE 처리 28일 후, 위에서 언급한 6개 속의 상대적 존재비는 각각 대조군과 유사한 수준으로 변화하였다.

CUS 쥐군에서는 Deinococcus가 클래스 수준(Deinococci), 목 수준(Deinococcales), 과 수준(Deinococcaceae), 속 수준(Deinococcus)을 포함한 다양한 분류 수준에서 낮은 존재로 검출되었지만 대조군에서는 검출되지 않았습니다. 그룹 및 관리 그룹(그림 5A-D).

종 수준에서 Weissella beninensis는 대조군보다 CUS 그룹에서 훨씬 낮았고, 고용량으로 CTE를 투여한 후 상대적 풍부도의 상당한 증가가 관찰되었습니다(그림 5E). 반대로, CTE 투여는 CUS 쥐에서 관찰된 브라키박테리움 대기업의 상대적 풍부도의 상당한 증가를 역전시켰습니다(그림 5F).

CUS 쥐의 CTE 변조 SCFA

쥐 배설물 샘플의 SCFA 농도(아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레르산, 이소발레르산 및 헥산산 포함)는 GC로 분석되었으며 그림 6에 나와 있습니다. 아세테이트의 수준 [one-way ANOVA, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Dunnett's test, p < 0.05]="" 및="" 헥산산="" [one-way="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" dunnett's="" test,="" p="">< 0.05]="" 대조군에="" 비해="" cus="" 모델군에서="" 유의하게="" 증가하였다.="" 고용량의="" cte="" 장기="" 투여="" 후="" 아세테이트(student's="" t-test,="" t="2.182," p="">< 0.05)="" 및="" 헥산산[one-way="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.05]="" 농도는="" cus="" 그룹과="" 비교할="" 때="" 압도적으로="" 감소했으며,="" 이는="" cte가="" 무질서한="" 신경="" 활성="" 대사물="" scfa를="" 조절하여="" 항우울제="" 활성을="" 나타낼="" 수="" 있음을="" 나타냅니다.="" 저용량군에="" cte="" 투여는="" 감소하는="" 경향을="" 보였으나="" 아세테이트="" 및="" 헥산산="" 농도에는="" 현저한="" 영향을="" 미치지="">

해마의 장내 미생물, 신경전달물질 및 신경영양소, 결장의 5-HT, SCFA의 상관관계 분석

속 수준에서 변경된 장내 미생물총, 해마 및 결장에서 변경된 신경전달물질 및 뉴로트로핀, SCFA의 교란 농도의 기능적 관계를 탐구하기 위해 Pearson의 상관 계수가 개발되었습니다(Meng et al., 2{1}}17). 이들 사이의 상관관계(r > 0.4 또는 r < -0.4,="" p="">< 0.05)는="" 그림="" 7에="" 나와="" 있습니다.="" 계수는="" 속="" 수준에서="" 변경된="" 장내="" 미생물="" 구성과="" 농도="" 사이에="" 강한="" 상관관계가="" 있음을="" 나타냅니다.="" 7가지="" 유형의="" scfa="" 및="" 우울증="" 관련="" 모노아민="" 신경전달물질(5-ht="" 및="" ne).="" ruminococcus의="" 풍부함은="" 해마의="" 5-ht="" 농도와="" 유의한="" 음의="" 상관관계를="" 나타냈으며,="" 이는="" cus="" 절차가="" ruminococcus의="" 상대적="" 풍부함의="" 증가와="" 5-ht="" 농도의="" 감소로="" 이어진다는="" 것을="" 의미합니다.="" cte="" 처리="" 후,="" ruminococcus의="" 상대적인="" 존재도는="" 대조군="" 수준으로="" 감소하였고,="" 5-ht="" 수준은="" 개선된="" 것으로="" 나타났다.="" 또한,="" bacteroides의="" 상대적="" 풍부함은="" 5-ht="" 수준과="" 양의="" 상관관계가="">

해마, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레르산, 이소발레르산 및 헥산산의 농도와 부정적으로 연관됨; Parabacteroides의 풍부함은 해마의 5-HT 수준과 propionate 농도와 유의한 양의 상관관계를 나타냈지만 isobutyrate 및 isovaleric acid 농도와 음의 상관관계를 나타냈습니다. Butyricimonas의 상대적 풍부도와 해마의 NE 수준 사이에도 유의하게 긍정적인 연관성이 관찰되었으며, Deinococcus의 상대적 풍부도는 아세테이트 농도와 양의 상관관계가 있었습니다. 이것은 CTE가 장내 미생물군의 구성을 변화시키고 해마 신경전달물질 수준을 교란시키고 신경활성 대사산물인 SCFA를 회복시켜 항우울제 활성을 발휘할 수 있음을 입증했습니다. 상관 분석의 자세한 데이터는 보충 표 S3에 나와 있습니다.

시스탄체치료할 수 있다당뇨병

논의

CTE의 항우울 활성 확인 및 임상적 이점

본 연구는 CUS 쥐에서 CTE의 항우울 활성을 평가하고, FST, SPT, OFT, NSFT와 같은 in vivo 모델의 효능을 확인하였고, CTE의 항우울 활성을 확인하였다.C. 튜불로사TCM에서 신장 결핍, 발기 부전 및 여성 불임의 치료에 자주 사용되는 CUS 쥐에서. 현재 가장 일반적으로 처방되는 항우울제는 세로토닌 및 노르에피네프린 재흡수 억제제(SNRI) 벤라팍신이며, 그 다음이 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI) FLX입니다(Thase et al., 2001; Mcintyre, 2017). 그러나 이러한 항우울제는 심장 독성, 혈압, 성기능 장애 및 수면 장애를 포함한 심각한 부작용을 갖는 것으로 나타났습니다(Ferguson, 2001; Jin et al., 2015). 모든 종류의 항우울제 중에서 SSRI와 SNRI는 성기능 장애의 가장 높은 발병률과 상관관계가 있습니다(Montejogonzalez et al., 1997; Clayton et al., 2014). 특히 주목할만한 것은 모든 항우울제를 전체적으로 고려할 때 성기능 장애의 전체 발생률이 59.1%(604/1,022)라는 점입니다. 약 40%의 환자가 성기능 장애에 대한 낮은 내성을 나타내므로 약물 순응도에 심각한 영향을 받습니다(Clayton, 2001). 현재의 우울증 치료의 단점을 고려할 때 Cistanches Herba는 강력한 항우울제와 같은 활성 때문에 임상 적용에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다.시스탄체스 허바전통적으로 발기 부전을 치료하는 데 사용되어 왔으며 다른 항우울제로 인해 발생하는 가장 일반적인 부작용에 대한 우려 사항을 최소한 제거해야 합니다(Fu et al., 2017). 또한 Cistanches Herba는 독성 및 치료 관련 변화의 징후가 없습니다.