카자흐스탄 공화국에서 자라는 Cistanche Salsa Stolons의 항통각 활성

식물 재료

Cistanche 살사(CAMey.) 벡, 오로바차과,스톨론은 2014년 7월 알마티의 바카나스 마을 모인쿰 사막에서 수집되었습니다. 식물 재료는 카자흐스탄 공화국 교육 과학부 식물학 및 식물 도입 연구소의 G. Sitpayeva 박사에 의해 식별되었으며 01-04/306이라는 번호로 기탁되었습니다.

화학 분석

의 스톨론C. 살사(2g)을 마이크로웨이브 추출하였다. 처음에 재료를 0.001–2.000 mm로 분쇄한 다음 밀폐 용기에 넣어 100–1100도에서 10분 동안 에탄올 80%( 비율 1:10). 하이드로에탄올 추출물(CSHE)을 HPLC-MS로 분석하였다. 조 추출물을 메탄올(9.6 mg/ml)에 용해시키고 0.45mm Teflon 멤브레인 분석 전에. 유동 진공 탈기기, 4채널 저압 구배 펌프 및 자동주사기. 페놀 화합물은 컬럼 Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1에 의해 크로마토그래피로 분리되었습니다.× 50 mm, 옥타데실실릴 실리카 겔폴리머(1.8μ). 크로마토그래피 분석은 0의 이동상 흐름으로 수행되었습니다.2ml/min, 용리액 작동 압력 175–200 kPa, 컬럼 오븐 온도 30도, 시료 부피 2ml, 기울기 용리액 공급 모드: 0–36분 10% A – 90% 비; 36분 – 100% B(용리액 A: 메탄올, 용리액 B: 0.2% 포름산 용액). 검출은 254, 334, 350, 410, 450 및 550의 파장에서 UV에 의해 수행되었습니다.nm. 얻은 머무름 시간, UV 및 질량 스펙트럼을 참조 화합물과 비교하여 추출물의 화학적 화합물을 식별하는 데 사용했습니다. 정량분석은 standard verbascoside를 사용하여 수행하였다.동일한 크로마토그래피 조건에서 분석된 에키나코사이드. 서로의 페닐프로파노이드 양을 계산할 수 있는 검량선이 식물의 에탄올 추출물의 배당체. 방법이 검증되지 않았습니다.

동물

스위스 웹스터 마우스(20–25g, 생후 2개월)이 이 연구에 사용되었습니다(Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brazil에서 기증). 동물을 표준 조건(명암 주기 12시간, 22 ± 2도, 습도 70-80%)에서 유지했습니다. 음식과 물자유롭게). 물질 흡수에 대한 음식 방해를 피하기 위해 동물은 물만 받았습니다 12h 실험 시작 전. 실험실 조건에 대한 순응은 최소 1년 동안 발생했습니다. h 각 테스트 전. 모든 프로토콜은 동물의 실험적 고통 조사를 위한 윤리적 기준에 관한 지침에 따라 수행되었으며 국가 통제 위원회에서 채택한 원칙과 지침을 따랐습니다.CONCEA(동물 실험),Biomedical Science Institute/UFRJ, 동물 연구 윤리 위원회, DFBCICB015-04/16 번호를 받았습니다. 모든 실험 프로토콜은 가벼운 단계에서 수행되었습니다. 그룹당 동물 수는 CONCEA의 규칙에 따라 최소로 유지되었습니다. 각 실험이 끝날 때마다 케타민/자일라진 과다복용으로 쥐를 죽였습니다.

트리트먼트

이 연구에서 CSHE는 10, 30 및 100으로 평가되었습니다. mg/kg. 추출물을 디메틸 설폭사이드(DMSO, Fisher Biotech)에 용해하여 100℃에서 원액을 제조하였다. mg/ml. PBS는 다른 용량의 준비를 위한 희석제로 사용되었습니다. 10, 30 및 100을 포함하는 솔루션mg/kg의 하이드로에탄올 추출물C. 살사준비했다. 사용된 표준 약물은 모르핀 2.5mg/kg(Merck, 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석), 아세틸살리실산 200mg/kg(Sigma Aldrich, 5로 용해됨)M 수산화나트륨(0.9% 식염수 중 NaOH) 및 캡사제핀 10 발당 nMol. 음성 대조군에는 식염수 + DMSO(추출물을 이용한 최고 처리에서와 동일한 농도)를 제공하였다. 모든 처리(시험된 추출물 및 표준)는 경구 경로로 투여되었습니다. 유일한 예외는 족저 주사로 투여된 캡사제핀이었습니다.

포르말린 유발 급성 통증

2.5% 포르말린(37% 포름알데히드) 용액을 주입했습니다(20ul) 마우스 60의 오른쪽 뒷발 발바닥 부위처리 후 분 (하이드로에탄올 추출물의C. 살사또는 아세틸살리실산 200 mg/kg 또는 모르핀 2.5 mg/kg)(Matheus et al., 2005). 동물을 투명한 유리 챔버에 개별적으로 배치하고 포르말린 주사 후 발을 핥는 시간(초)을 기록하고 초기 신경성 통증(주사 후 0-5분)과 후기 염증성 통증(주사 후 15~30분).

캡사이신에 의해 유도된 통각

이 테스트는 Sakurada et al. 일부 수정(Sakurada et al., 1992). 캡사이신(20ul) C18H27아니3(Galena, Campinas, SP)를 처리 1시간 후 마우스의 오른쪽 뒷발 발바닥 부위에 주사하였다(1.6 ug/paw)(하이드로에탄올 추출물의C. 살사또는 캡사제핀 10 nMol/paw). 동물을 개별적으로 유리 챔버에 넣고 발을 핥는 기간(들)을 0에서 5 사이로 기록했습니다.캡사이신 주입 후 분 후 분석.

글루타메이트 유발 통각

Beirith et al. (2002), PBS(20ul)의 글루타메이트 용액(l-glutamic acid, Sigma–Aldrich, 3.7 ng/paw)를 처리 1시간 후 마우스의 오른쪽 뒷발 발바닥 부위에 주사하였다(하이드로에탄올 추출물의 하이드로에탄올 추출물).C. 살사또는 모르핀 2.5 mg/kg). 동물을 유리 챔버에 개별적으로 배치하고 글루타메이트 주입 후 0에서 15분 사이에 발을 핥는 시간(초)을 기록하고 분석했습니다.

통계 분석

화학 데이터는 5회 실험의 평균 ± SD로 표시됩니다. 모든 약리학적 실험 그룹은 최소 6마리의 마우스로 구성되었습니다. 단방향 분산(ANOVA) 분석 후 Dunnett 테스트를 통해 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 그룹 간 통계적 유의성을 시각화할 수 있었습니다.p값은 0.05(p < 0.05).

논의

총 10개의 페닐프로파노이드 글루코사이드가 확인되었습니다.C. 살사(카자흐스탄에서 자라는) 하이드로에탄올 추출물. 확인된 주요 화합물은 Echinacoside(10.98mg/g), acteoside(9.44mg/g) 및 tubuloside B(7.94mg/g)였습니다. 얻은 데이터는 종에 대한 이용 가능한 문헌과 상관관계가 있었습니다.시탕슈아시아의 여러 지역에서 자라고 있다(Zhou et al., 2014, Xie et al., 2005, Jiang et al., 2009). Echinacoside와 acteoside가 주성분으로 공식종 표준화의 근간을 이루고 있다.C. 데저티콜라그리고C. 튜불 로사, 2005년 중국 약전에 등재되었습니다. 우리는 이러한 화합물이 다음의 표준화에도 사용될 수 있다고 제안합니다.C. 살사연구된 하이드로에탄올 추출물의 주요한 것이기 때문에 카자흐스탄의 스톨론입니다.

본 연구의 약리학적 결과에 따르면 CSHE가 포르말린 시험에서 관찰되는 신경성 통증 및 염증에 대해 효과적인 제제임을 시사하는 것이 가능하다. 우리가 아는 한에C. 살사항침해성 작용과 관련하여 테스트된 적이 없습니다. 2002년 연구C. 데저티콜라(린 등, 2002)는 이 식물이 전체 몸부림, 포르말린 및 발 부종과 같은 모델에서 분석했을 때 항통각수용 및 항염증 활성을 나타내는 것으로 나타났습니다.. 활성이 있는 추출물의 주성분을 조사하려는 시도는 없었으나 부탄올 추출물과 수층이 활성인 것으로 판단하였다. 당연히 이러한 용매는 페닐프로파노이드와 일치하는 극성의 척도에 있습니다.에서 발견되는 배당체C. 살사. 또한, Lin과 동료들은 항통각수용 작용이C. 데저티콜라추출물은 아편 수용체에서 화합물의 작용으로 인한 것이 아닙니다.또는 면역 체계와 관련이 있습니다. 우리의 연구에서 페닐프로파노이드가 풍부한 추출물은 포르말린 테스트의 두 단계 모두에서 활성을 보였습니다. 관찰된 활성은 실제로 조사된 약리학적 표적에 기인한 것이지 로타 로드 테스트에 의해 입증된 바와 같이 가능한 운동 변화에 기인한 것이 아닙니다. 포르말린 검사 결과는 신경성 통증 및염증 매개체. 처음에 우리는 신경성 통증 경로를 조사하기로 결정했습니다. 이전에 연구한 다른 종의 유사한 화합물은 아편 수용체 활성을 나타내지 않았기 때문에 글루타메이트 및 캡사이신 모델과 같은 다른 모델을 테스트하기로 결정했습니다.

글루타메이트는 흥분성 신경 전달 물질입니다말초 및 중추 신경계 전반에 걸쳐 통증을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 작용은 리간드-게이트 이온성 글루타메이트 수용체에 의해 매개됩니다.(iGluRs) 및 대사성 글루타메이트 수용체. iGluR은 다음과 같이 나눌 수 있습니다.N-메틸-d-아스파르테이트(NMDA) 및 -아미노-3-하이드록시-5-메틸이속사졸-4-프로피온산(AMPA)(Kolber, 2015). 연구에 따르면 케타민으로 NMDA 및 AMPA 수용체를 길항할 때카이네이트, 각각 항 통각 효과가 관찰됩니다. 그러나 이러한 수용체를 표적으로 하는 길항제는 지금까지 상당한 부작용을 유발했으며 이러한 이유로 이 수용체를 통해 매개되는 약물이 부작용을 덜 일으키기를 바라는 mGluR에 대한 새로운 연구가 수행되었습니다.팔라조 외, 2014). CSHE를 테스트한 결과 이 ​​치료가 글루타메이트에 의해 유발된 통증을 줄이는 데 효과적인 것으로 나타났습니다. 그러나 이 효과가 전리성 및/또는 대사성 수용체를 통해 매개되는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 모르핀은 글루탐산 전달에 영향을 미치는 약물 중 하나입니다(Deyama et al., 2007). 글루타메이트 수용체 활성화가 TRPV1 반응을 증가시킨다는 것이 문헌에 보고되어 있다.Szteyn 외, 2015). 이러한 이유로 CSHE에 대해 관찰된 효과는 TRPV1의 활성으로 인한 것일 수 있으며 반드시 글루타메이트 수용체에 대한 직접 반응을 통한 것은 아닐 수 있습니다.

이 연구의 다음 단계는 TRPV1 수용체 작용제인 캡사이신을 통각제로 사용하여 발 핥기 테스트를 수행하는 것이었습니다. 결과는 실제로 CSHE가 TRPV1 수용체를 통해 통증을 감소시키는 것으로 나타났습니다.

CSHE의 경우 거의 모든 테스트 방법론에서 30mg/kg의 용량이 100mg/kg보다 더 나은 결과를 달성하는 것을 관찰할 수 있었습니다. 이는 용액의 포화로 인해 화합물이 침전되고 생체 이용 가능한 약물의 양이 효과적으로 감소하기 때문일 수 있습니다.

카자흐어 추출물 CSHE에 대해 확립된 화학적 조성을 확인하는 것은 그 안에 존재하는 주요 성분이 이미 항통각수용/항염증 작용을 확인했기 때문에 중요한 단계였습니다. 예를 들어, 에키나코사이드는 항통각수용 작용을 담당하는 활성 성분 중 하나로 확립되었습니다.에키나과(Hostettmann, 2003). 또한, Schapoval과 동료들의 이전 연구(Schapoval et al., 1998)는Stachytarpheta cayennensis발 부종 및 핫 플레이트 모델에 의해 평가됨. Backhouse 및 동료들(Backhouse et al., 2008)은 또한 액티오사이드가부들레야글로보사포르말린 테스트를 포함한 여러 통증 평가 모델을 사용합니다. 액티오사이드의 안정성을 높이고 항통각수용 작용을 연장하기 위해 최신 지식을 사용하여 새로운 제형이 현재 개발되고 있습니다(Isacchi et al., 2016).

결론

10가지 페놀성 물질이 카자흐스탄의 스톨론에서 확인되었습니다.C. 살사HPLC/MS 분석에 의해. 이들 화합물은 본원에서 수행된 실험 모델에서 관찰된 항통각수용성 활성의 원인이 될 수 있다. 카자흐스탄 영토에서 속이시탕슈주로 종으로 대표된다.C. 살사, 우리는 표준 화합물로 echinacoside 및 acteoside를 사용하여 수확 및 표준화를 권장하여 한약에 대한 양질의 원료를 공급할 수 있습니다.