갈산과 접합된 펩타이드 제형(Gal2–Pep)의 항산화 및 노화 방지 잠재력

피부는 조기 노화에 매우 취약합니다.외부 스트레스로 인해 본 연구에서는 펩타이드 제제, (갈로일)2–KTPPTTP(갈2–Pep)는 TPPTTP 펩타이드와 gallic을 결합하여 합성하였다.산 (GA). 모든 펩타이드는 고체상 펩타이드를 사용하여 2-클로로트리틸 클로라이드 수지에서 합성되었습니다.합성(SPPS), 전자분무 이온화(ESI)/4중극자 시간에서 분석플러ight(Q-TOF) 탠덤 질량 분광법(MS) 시스템. 처음에는 갤2–Pep는 농도 100 이하에서 독성을 나타내지 않았습니다.m각질 세포의 경우 세포 생존율이 88%인 M 및섬유아세포. 그만큼반응성 산소 종(ROS) Gal의 소거 활동2–Pep은 GA 단독에 비해 더 안정적이었습니다. 방에서 4주 후온도, 그ROS 청소 활동50% 이상을 유지했습니다. 또한, 펩타이드 제제,여자2–Pep는 또한 CCD-1064Sk에서 엘라스타제 억제 효과를 나타냈습니다.섬유아세포세포. RT-qPCR 결과를 바탕으로 본 연구에서 Gal이2–Pep는 PGC-1의 발현을 증가시켰습니다.a 에게예방하다산화 스트레스, 그리고 그것의 잠재력을 확인했습니다.노화방지제~에 의해의 표현을 증가I형 콜라겐그리고매트릭스 메탈로프로테이나제-1(MMP1)의 발현 감소. 그만큼결과 이 연구에서 합성된 펩타이드 제제가 치료제로 사용될 수 있다는 제안을 강화했습니다.천연 항산화제그리고노화방지제그것의 화장용 신청을 위해.

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1. 소개

피부노화케라티노사이트와 브로의 세포 분열이 점진적으로 감소하고 궁극적으로 중단되는 결과로 발생합니다.피부 내 폭발. 피부의 주름은 세포수가 감소하면서 발생하며, 결과적으로 세포외 기질의 변성으로 인해 건조함과 엘라스 손실이 발생합니다.피부의 티시티.1 세포 내 미토콘드리아 DNA 손상단백질 합성 속도의 감소도 발생합니다.피부 노화 과정에서.2 피부 노화에는 두 가지 주요 경로가 있습니다.자외선(UV) 노출을 통한 내인성 및 외인성 방식

의 주요 동인외인성 노화. 자외선은 피부의 주요 구성 요소와 반응합니다., 지질, 단백질 및 핵산을 포함하여 세포로 이어지는 반응성 산소 종(ROS)을 생성합니다.죽음.3–5 과도한 ROS 수준은 또한 분열로 이어지고콜라겐 또는 엘라스틴 사슬의 비정상적인 결합 및 콜라겐을 분해하는 MMP-1와 같은 MMP(matrix metalloproteinases)의 발현을 촉진하여 피부 주름을 유발하고피부 노화 가속화.6,7 따라서 이를 제거하기 위한 항산화 요법은ROS는 미토콘드리아 잠재력을 활성화시켜 피부를 노화로부터 보호하는 장점이 있다.

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ROS 외에도 엘라스타제는 ROS 손실에 중요한 역할을 합니다.중요한 단백질인 엘라스틴을 분해하는 피부탄력세포외기질.8 상당한 탄성 반동으로 인한 엘라스틴특성, 피부에 탄력을 제공하는 반면 엘라스타제는엘라스틴 및 기타 단백질을 절단하는 능력.8 따라서 금지엘라스타제 효소의 작용은 다음을 통한 피부 처짐의 핵심 전략이 될 수 있습니다. 피부 탄력 손실 방지.

본 연구에서는peroxisome proliferator-activated receptor 감마 coactivator1-알파(PGC-1a) 유래 펩타이드 TPPTTP 및 갈산(GA)노화 방지 화장품에 사용됩니다. GA는 포도, 토마토, 녹차 등 다양한 과일과 채소에서 발견되는 파이토케미컬로 높은 항산화 및 항균 작용을 하는 것으로 알려져 있습니다. eFf 로요법.9 GA는 이러한 유익한 전자 때문에 화장품 및 식품 산업에서 사용되지만Ff 로ects, 그것의 제형은 불안정한 경향이 있습니다.10 우리는 이렇게 개발했습니다(갈로일)2–KTPPTTP(갈2–Pep) PGC에 바인딩하여 GA의 안정성을 높이기 위해-1a-유래 펩타이드 TTPTTP.

본 연구에서는 (갈로일)을 합성하였다.2–KTPPTTP(갈2– Pep) 갈산과 접합된 펩티드 제제 및 확인항산화 및 노화 방지제로서의 잠재력.

2. 재료 및 방법

2.1. 재료

Dulbecco의 수정Eagle's Medium(DMEM), 페니실린/스트렙토마이신, 태아 소 혈청(FBS), 인산염-부Ff 로에드식염수(PBS) 및 트립신은 Gibco(Carls)에서 구입했습니다.

나쁘다, CA). 히드록시벤조트리아졸(HOBt), 디이소프로필 카르보디이미드(DIC), 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데-7-엔(DBU),N, N-디이소프로필에틸아민(DIEA), 갈산 및N-숙시닐-트리-알라닐-pnitroanilide는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했습니다.L-형태 아미노산(Fmoc-Lys(Boc)–OH, Fmoc-Thr(t부)–OH, 그리고 Fmoc-Pro–OH)는 Bead-Tech(서울,한국).

2.2. 펩티드 및 갈산 결합 펩티드의 합성

모든 펩타이드는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(200m몰 스케일, 대체 값¼ 1.46mmolg 1) HOBt 사용–DIC 매개 고상 펩티드 합성(SPPS).

SPPS 방법을 사용한 펩타이드 합성은 약간의 변형으로 수행되었습니다.이전 연구를 참조하는 양이온.11–13 2-클로로트리틸 클로라이드(CTC) 수지가 디클로로에서 팽윤되었습니다.

30분 동안 메탄(DCM, 8mL). 수지를 세척하였다.디메틸포름아미드(DMF). 모든 반응은 실온에서 수행하였다. Fmoc 보호 아미노산 유도체(2당량)(등가),파이첫 번째 부착된 아미노산 또는 다른 아미노산의 경우 5당량)을 DMF a에서 DIEA(첨부된 아미노산의 경우 5당량) 또는 HOBt/DIC(6당량/5당량)와 커플링했습니다.피트어DMF에서 2퍼센트(v/v) DBU를 사용하여 Fmoc의 탈보호 수행(2회, 한 번에 2분, 8mL). 그리고 모든 단계는 DMF로 5번 세척하였다. 최종 갈산은 라이신 부착 펩티드와 결합되었다.갈산의 커플링 후, 수지는a여과, 세척,고진공 하에서 건조시켰다. 절단 솔루션(TFA:탈이온 [DI] 물: TIS¼ 95 : 2.5 : 2.5, v/v/v 퍼센트) 2시간 처리조 펩타이드를 얻기 위해. 조 펩티드를 침전시키고 차가운 디에틸 에테르로 3회 세척하였다.

분석용 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)는 Waters 2695 Separations에서 수행되었습니다.Capcell Pak C18 컬럼(4.6mm 250mm, 5m엠, 시세이도). 이동상은 H에서 0.05% TFA로 구성되었습니다.2O (이동상 A) 및 아세토니트릴 중 0.05% TFA(이동상 B).

모바일용 선형 구배를 사용하여 용출을 달성했습니다.단계 B에서 30분에 걸쳐 5%~65%유속 1.0 mL min 1. 펩티드 피크는 230nm의 파장에서 검출되었다. Semi-preparative RP-HPLC는 Gemini RP-C18을 사용하여 Waters HPLC 시스템(Pump 600E, Detector UV-484)에서 수행되었습니다.기둥(21.2mm 250mm, 5mm, 현상). 이동상은 H에서 0.05% TFA로 구성되었습니다.2O(이동상 A)및 아세토니트릴 중 0.05% TFA(이동상 B). 이동상 B에 대한 선형 구배를 사용하여 용출을 달성했습니다.한 번에 15분 동안 7~22%l10mL 분의 유속 1. 그만큼펩티드 피크는 230 nm의 파장에서 분광광도계로 검출되었다.

합성된 펩타이드는 물에 5% 포름산에 용해되었고 전자분무 이온화(ESI)/사중극자 시간light(Q-TOF) 탠덤 질량 분광법(MS) 시스템(TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). 샘플을 장착한 Q-TOF 시스템에 주입했습니다.나노 스프레이 소스l유속 1mL분 1. ESI 이온소스 매개변수는 다음과 같습니다: 1.5kV의 이온 분무 전압, 10psi의 커튼 가스 및 5psi의 외장 가스. 스펙트럼전체 스캔 모드 및 MS/MS는 다음 범위에서 수집되었습니다.m/z

100–스펙트럼당 25ms의 누적 시간에서 1200Da.충돌 에너지는 10에서 80으로 증가했습니다.데이터는 Analyst TF를 사용하여 수집되었으므로웨어 및 자동최소 피크, 노이즈 감소 10%, 임계값 3%의 중간 탈동위원소, 노이즈 감소 없음, 스무딩 없음으로 중심 80%로 지정됩니다. 합성된 펩타이드 확인질량 허용 오차가 있는 0.05 Da 및 다음의 MS/MS 허용 오차를 사용하여 수동으로 시퀀싱됨 0.01 다.

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2.3. 세포 배양 및 생존력 분석

인간, 성인, 저칼슘, 고온(HaCaT) 세포및 CCD-1064Sk(정상적인 인간 피부섬유아세포) 세포는10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신. 세포를 37℃에서 배양하였다. C 5% CO의 가습 공기 챔버2.생존율 분석을 위해 cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Beijing, China)를 사용하였다. HaCaT 및 CCD-1064Sk 세포96-웰 마이크로플레이트(5 103 웰 당 세포) 및 37에서 배양 5% CO 중 C2 24시간 동안. 그런 다음 배양물을 합성된 펩티드 또는 GA의 다른 농도에 노출시키고 37℃에서 배양했습니다. 5% CO 중 C2 24시간 동안. 세포 생존력이후 제조업체의 지침에 따라 CCK-8를 사용하여 측정되었습니다.

2.4. 항산화 활성의 결정

2.4.1. DPPH 분석.합성된 항산화 활성펩타이드 및 GA는 DPPH 분석을 사용하여 개별적으로 평가되었습니다. DPPH 분석은 이전에 보고된

마이너 모디를 사용한 방법론양이온.12,14–16 첫째, 0.12 mg mL 1 DPPH 용액은 메탄올에서 준비한 다음 100mDPPH 용액의 L 및 100m합성된 펩타이드 L 또는 GA를 서로 다른 농도({0}.1mM, 0.05mM, 0.01mM 및 1mM)로 혼합하였다.mM) 96-웰 마이크로플레이트에서. 오비탈 쉐이킹 인큐베이터에서,혼합물을 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. C 및 100rpm 없이빛. 그런 다음 517nm에서 흡광도를 측정하고 항산화 능력을 계산했습니다.

2.4.2. ROS 청소 활동.

세포내 ROS 소거 활성은 20,70-dichlorofluorescein diacetate 키트를 사용하여 평가했습니다.(DCF-DA, Abcam, USA). HaCaT 세포를 96-웰 마이크로플레이트(5 103 웰 당 세포) 및 37에서 배양 24시간 동안 C.A피트인큐베이션 후, 배양물을 합성된 펩타이드 또는 GA(100mM) 37에서 배양 24시간 동안 C. 그런 다음 세포를 10mM DCF-DA 용액 및 30분 동안 배양. ㅏ피트인큐베이션 후, 용액을 PBS로 세척하였다. 그만큼여기에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 세포를 분석하고

방출 파장은 각각 485nm 및 530nm입니다.

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그림 1사중극자 시간을 이용한 펩타이드의 합성 단계 및 서열 확인비행(Q-TOF) 질량분석법: (a) 상세한 합성 절차 (b) TPPTTP, (c) 갈로일–TPPTTP, 및 (d)(갈로일)2–KTPPTTP입니다.

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2.5. 미토콘드리아 막 전위 분석

JC-1 염료(Thermo Fisher, USA)는 미토콘드리아에 사용되었습니다.막 전위(MmP) 검정. CCD-1064Sk 및 HaCaT 세포를 96-웰 마이크로플레이트(5 10 3웰당 세포)

37에서 배양 C 및 5% CO2 24시간 동안. 선미인큐베이션,배양물을 상이한 농도의 합성된 펩타이드에 노출시키고 37℃에서 배양하였다. 5% CO 중 C2 24시간 동안.JC-1 염료를 CCD-1064Sk 및 HaCaT 세포에 추가하여생산하다 최종 농도 10mM. A피트인큐베이션 10분 후, 세포를 37 C PBS. 녹색과 빨간색형광Varioskan LUX를 사용하여 측정했습니다.Exci에서 Multimode Microplate Reader(ThermoFisher, USA)역 (l전)/방출(l여자 이름) 475/530 nm 및l전/l여자 이름475/각각 590nm.

2.6. 엘라스타제 억제 활성 분석

CCD-1064Sk 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 37℃에서 배양했습니다. 5% CO 중 C2 24시간 동안. 그런 다음 배양물을 100의 농도에 노출시켰습니다.m합성된 펩티드 또는 GA의 M 및 37에서 배양 5% CO 중 C2 24시간 동안. 세포를 dPBS로 두 번 세척하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 세포를 수집했습니다. ㅏ0.2M Tris 추가–HCl(pH 8.0)과 0.1% Triton-X가 수집됨세포, 세포를 초음파기에 의해 균질화하였다. 균질화된 용액을 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다.그리고 4 다. 그러면,피트상층액, 단백질 정량-양이온은 BCA 단백질 분석을 사용하여 수행되었습니다. 각 단백질에서 샘플이 분배되었습니다.파이최종 농도 100mgmL 1, 그리고N-숙시닐-트리-알라닐-p-nitroanilide가 첨가되었습니다.1.6mM의 최종 농도 및 36에서 반응 C에서 1시간 동안.그 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.