풍단 모란 플라보노이드의 항산화, 미백 및 항균 효과
Mar 23, 2022
연락처 : ali.ma@wecistanche.com
지 루†, 지창 황†, Yusheng Liu, Huimin Wang, Min Qiu, Yinghui Qu 및 Wenpeng Yuan *
추상적인: 플라보노이드잠재적 인 기능성 식품 원료 인 항염증, 항균, 항산화 및 미백과 같은 중요한 생물학적 활성을 가지고 있습니다. 그러나, 펭단 작약의 생물학적 활성플라보노이드특히 명확하지 않습니다. 따라서이 연구에서 모란은플라보노이드펭단 작약 종자 식사로부터 추출하고, 작약의 항산화, 항균 및 미백 활성을플라보노이드탐구되었다. 최적 추출 조건은 메탄올 농도 90%, 고체-액체 비율 1:35 g:mL, 온도 55◦C 및 시간 80분; 이러한 조건 하에서, Fengdan 모란의 수확량플라보노이드1.205 ± 0.019 % (모란 씨앗 식사의 건조 질량에 대한 루틴의 건조 질량의 비율)에 도달 할 수 있습니다. 펭단 모란 총계의 정리플라보노이드1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH) 자유 라디칼, 히드록실 라디칼 및 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 자유 라디칼은 각각 75%, 70% 및 97%에 도달할 수 있었다. 펭단 모란플라보노이드그람 양성 박테리아의 성장을 억제 할 수 있습니다. 펭단 작약의 최소 억제 농도 (MICs)플라보노이드S. aureus, B. anthracis, B. subtilis 및 C. perfringens는 각각 0.0293 mg / mL, 0.1172 mg / mL, 0.2344 mg / mL 및 7.500 mg / mL이었다. 티로시나제에 대한 풍단 작약 플라보노이드의 억제율은 8.53-81.08%였다. 본 연구는 풍단 작약의 항산화, 미백 및 항균 활성이 총합임을 강렬하게 예시하였다.플라보노이드의미심장했다. 펭단 작약 합계플라보노이드기능성 식품 재료로 사용될 가능성이 큽니다.
키워드:펭단 모란플라보노이드;항 산화;미 백; 항균 활성; 기능성 식품
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1. 소개
작약은 중국에서 1600 년 이상 재배 된 경제 및 관상용 작물 중 하나입니다 [1]. 기름 작약은 식용유의 원료로 사용될 수 있는 다양한 작약을 말한다[2]. 가장 일반적으로 사용되는 오일 모란 중 하나 인 Fengdan 작약에는 풍부한 불포화 지방산 (>90 %)을 함유 한 어두운 타원형 씨앗이 들어 있습니다 [3]. 작약 씨 기름은 2011 년에 α-리놀렌산의 높은 비율 때문에 중국 정부에 의해 새로운 자원 식품으로 인증되었습니다 [4]. 또한, 작약 씨앗은 2011 년 중화 인민 공화국 국민 건강 및 가족 계획위원회에 의해 인간의 건강을 향상시키기위한 기능성 식품의 새로운 자원으로 인증되었습니다 [5]. 펭단 작약 종자 식사는 펭단 작약 종자의 약 60 % ~ 70 %를 차지하는 모란 씨 오일의 준비에서 가장 중요한 부산물 중 하나이며 플라보노이드, 단백질, 다당류, 폴리페놀, 패 오니 플로린 및 기타 활성 성분이 풍부합니다. 그러나 많은 양의 펭단 작약 종자 식사는 현재 사료 또는 폐기물로만 사용되며 [6], 이는 천연 자원의 낭비와 환경 오염을 초래합니다 [2].
문헌에 따르면, 플라보노이드는 항염증, 항균, 항산화 및 미백 효과와 같은 중요한 생물학적 활성을 가지고 있습니다 [7-10], 이는 고려됩니다.잠재적 인 기능성 식품 원료. 예를 들어, 콩 이소 플라본은 항산화 특성 때문에 자유 라디칼의 손상으로부터 세포를 보호 할 수 있습니다 [11-13]. 은행잎 추출물의 플라보노이드는 강력한 항산화 특성을 가지고 있으며 유리 방사상 송아지를 직접 억제 할 수 있습니다 [14]. 화이트 구아바의 플라보노이드 추출물은 대장균과 S. 아우레우스의 미세한 형태를 바꿀 수있는 천연 항균제입니다 [15].
불행히도, 잠재적 인 기능성 식품 원료로서 Fengdan 작약 플라보노이드는 산업 생산에 관여 했을뿐만 아니라 생물학적 활성도 특별히 명확하지 않습니다. 따라서, 식품 분야에서 작약 플라보노이드의 적용가치를 최대한 향상시키고 자원의 낭비를 줄이기 위하여, 펭단 작약 종자 식사로부터 작약 플라보노이드를 추출하고, 풍단 작약 플라보노이드의 항산화, 미백 및 항균 활성을 연구하였다. 풍단 작약의 새로운 기능성 식품 원료 개발을위한 토대를 마련 할 것으로 기대된다.
2. 결과 및 토론
2.1. 총 플라보노이드 수율에 대한 네 가지 요인의 영향
총 플라보노이드 수율에 대한 메탄올 농도의 영향을 도 1a에 나타내었다. 총 플라보노이드 수율은 메탄올 농도의 in-크레아제에 따라 감소한 후 처음에는 증가하였고, 메탄올 농도가 90%였을 때 최대치(1.016%, 작약씨 가루의 건조 질량에 대한 루틴의 건조 질량의 비율)에 도달하였다.그 이유는 메탄올의 극성 및 작약 종자 식사에서의 총 플라보노이드의 용해도와 관련이있을 수 있습니다 [16]. 따라서, 최적 메탄올 농도는 90%였다.
도 1c에 나타난 바와 같이, 총 플라보노이드 수율은 처음에는 증가하였고, 그 후 온도의 증가에 따라 감소하였다. 총 플라보노이드 수율은 55◦C에서 최대치(1.141%, 작약 종자 식사의 건조 질량에 대한 루틴의 건조 질량의 비율)에 도달하였다. 종자 식사에서 총 플라보노이드의 용해 속도는 tem-perature를 적절하게 상승시킴으로써 가속화되었다. 그러나, 부분적인 총 플라보노이드는 고온에서 노출되었을 때 분해되었고[18], 이는 총 플라보노이드의 수율의 감소로 이어진다. 따라서, 55◦C가 가장 좋은 온도였다.
총 플라보노이드 수율에 대한 추출 시간의 영향을 도 1d에 나타내었다. 총 플라보노이드 수율은 0.5 h 내지 1.5 h에서 급속하게 증가하였다. 추출 시간이 1.5 h 이상이었을 때, 총 플라보노이드 수율은 변하지 않았다. 이러한 현상의 이유는 종자 식사에서 총 플라보노이드가 0.5 h에서 1.5 h로 추출 시간의 연장과 함께 지속적으로 용해되었기 때문일 수 있다. 또한, 시간이 1.5 h에 도달하면 모든 총 플라보노이드가 용해되었을 수 있습니다. 따라서, 시간의 증가는 총 플라보노이드 수율에 약간의 영향을 미쳤다[4,19]. 따라서, 가장 좋은 추출 시간은 1.5 h였다.
2.2. 총 플라보노이드 수율에 대한 최적화
2.2.1. RSM을 이용한 모델 피팅 및 데이터 분석
풍단 작약 종자의 총 플라보노이드 수율에 대한 다양한 인자의 상대적 중요성을 더 탐구하기 위해, RSM 실험을 수행하였다. RSM은 여러 변수의 상대적 유의성을 평가하고 이상적인 반응을 위한 최상의 조건을 찾기 위해 다요인 실험의 통계 설계 및 데이터 분석에 사용됩니다[20]. RSM을 사용한 Box-Behnken 설계는 선형 회귀 방정식에 적합할 수 있으므로 실험을 보다 정확하게 분석하여 영향 요인 중에서 법칙을 찾을 수 있습니다[21].
표 S1은 총 플라보노이드 수율과 시험 가변성 사이의 관계를 나타내었다. 실험 데이터는 다중 회귀 분석에 의해 분석되었다. 총 플라보노이드 수율 (Y) 대 고체 대 액체 비율 (A), 추출 온도 (B) 및 추출 시간 (C)의 직교 다항식 회귀 방정식은 y = 1.19 + 0.01A - 0.02B - 0.003C + 0.02AB - 0.02AC + 0.01BC - 0.03A2 - 0.04B20.02C2.
직교 다항식 모델의 아노바가 표 1에서 입증되었다. 이모델의 F-값은 18.57이었고, 모델의 p 값은 0.0004였다(p< 0.01),="" the="" fitting="" degree="" of="" the="" model="" was="" 0.1202,="" and="" the="" determination="" coefficient="">2) 0.9598이었으며, 이는 모델이 매우 유의한 통계적 유의성을 가졌다는 것을 나타낸다. 일차 용어 (B) 및 2차 용어 (A2, B2, C2)는 총 플라보노이드 수율에 매우 유의한 영향을 미쳤다 (p< 0.01).="" a,="" ab="" and="" ac="" had="" significant="" effects="" on="" total="" flavonoids="" yield="" (p="">< 0.05).="" c="" and="" bc="" had="" no="" significant="" effect="" on="" total="" flavonoids="" yield="" (p="">0.05). 세 가지 요인의 F-값에 따르면, 총 플라보노이드 수율에 미치는 영향은 추출 온도 > 고체 대 액체 비율 > 추출 시간이었다.
표 1.사분면 다항식 모델의 아노바.
3차원(3D) 반응 표면 다이어그램을 도 2a, c, e에 나타내었다. 3D 그래프의 가장 높은 지점은 대화식 요인에 가장 적합한 조건이었습니다. A와 B(그림 2b), A와 C(그림 2d) 사이의 상호 작용의 등고선 기울기는 더 가파른 반면, A와 C(그림 2f)의 등고선 기울기는 매끄러웠다. 이것은 A와 B, A와 C 사이의 상호 작용이 총 플라보노이드 수율에 큰 영향을 미치는 반면, B와 C 사이의 상호 작용은 총 플라보노이드 수율에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다. RSM 실험과 회귀 분석 사이의 일관성은 확립 된 모델이 더 정확하다는 것을 입증했습니다.
그림 2.AB에 대한 3D 표면의 다이어그램 (a), AC (c) 및 BC (e)를 총체적으로 플라보노이드 수율로 한다.
2.2.2. 최적 조건 검증
모델에 의해 주어진 이론적 최적 파라미터는 고체 대 액체 비율 1:36.11, 추출 온도 53.52◦C, 추출 시간 82.65분, 총 플라보노이드 수율의 이론값은 1.195%였다. 실제 작동을 고려하여, 이론적 파라미터는 1:35의 고체-액체 비율, 55◦C의 추출 온도 및 80분의 추출 시간으로 조정되었다. 이들 조건 하에서, 총 플라보노이드 수율은 1.205 ± 0.019%이었다. 이론적 예측치와 비교했을 때, 상대적 오차는 0.8%였다. 이론적 값은 실제 결과와 일치하여 최적화 매개 변수를 사용할 수 있음을 나타냅니다. Chen et al. [10] 60% 에탄올 수용액을 사용하여 작약으로부터 플라보노이드를 추출하고 수율은 1.34%였으며, 이는 본 논문과 일치하였다. RSM은 Aurantii Fructus [22], Pueraria [23] 및 Curcuma Zedoaria 잎 [24]과 같은 식물에서 플라보노이드의 최적 추출 과정을 최적화하는 데 널리 사용되었습니다. 직교 테스트와 비교하여 RSM은 정확한 예측 가능성, 높은 정확도 및 영향 요인을보다 쉽게 분석 할 수있는 장점이 있습니다 [25].
2.3. 풍단 작약 플라보노이드의 항산화 활성
플라보노이드는 신체의 자유 라디칼을 효과적으로 청소할 수있는 천연 항산화 제입니다. 플라보노이드의 항산화 능력은 플라보노이드가 자유 라디칼에 수소 원자를 제공하고 페놀 자유 라디칼로 전환 할 수 있다는 사실 때문입니다. 자동 산화 연쇄 반응의 전달 속도는 페놀성 자유 라디칼의 안정성에 의해 느려질 수 있고, 따라서 지질의 추가 산화를 억제한다[26].
DPPH 자유 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 클리어런스를 도 3a에 나타내었다. 0.1 내지 1.0 mg/mL의 농도 범위에서, DPPH 자유 라디칼에 대한 총 플라보노이드 및 VC의 클리어런스는 그들의 농도와 양의 상관관계가 있었다. 0.1 내지 0.5 mg/mL의 범위에서, VC의 클리어런스는 그 농도에 따라 증가하였다. 농도가 0.5 mg / mL보다 클 때, VC의 클리어런스는 98 %에 도달하고 안정한 경향이있었습니다. 0.1 ~ 0.8 mg/mL의 범위에서 총 플라보노이드의 제거율은 농도 증가에 따라 증가하였다. 농도가 0.8 mg/mL보다 클 때, 총 플라보노이드의 클리어런스는 약 75%로 안정화되었다. Oancea et al. [27] DPPH 자유 라디칼에 대한 작약 조 추출물의 클리어런스는 81 %였다고보고했다. 클리어런스는 이 연구의 결과와 유사하였다. 펭단 작약 총 플라보노이드는 DPPH 자유 라디칼에 대한 일정한 클리어링 능력을 가지고 있었지만, 용량은 VC보다 약간 낮았다. 산화 방지제와 DPPH 자유 라디칼 사이의 반응은 수소 원자 및 전자 전달 메커니즘에 의해 실현됩니다 [28]. DPPH 자유 라디칼은 에탄올 용액에서 보라색이다. 산화 방지제가 수소 공급을 통해 DPPH 자유 라디칼을 안정한 상태로 제거하면 색상이 노란색으로 변하고 517nm에서 강한 흡수력을 갖습니다 [29]. 이 논문에서, DPPH에 대한 작약 플라보노이드의 소거효과는 플라보노이드 농도의 증가와 함께 상당히 향상되었으며, 이는 작약 플라보노이드가 효과적인 항산화제임을 나타내었다.
히드록실 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 클리어런스를 도 3b에 예시하였다. 0.1 내지 1.0 mg/mL의 농도에서, 히드록실 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 클리어런스는 VC보다 낮았다. 0.4 mg / mL에서 VC의 클리어런스는 기본적으로 최대 약 97 %에 도달했습니다. 히드록실 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 소거율은 농도 상승에 따라 증가하였고, 농도가 0.8 mg/mL보다 높을 때 최대치(70%)에 도달하였다. 하이드록실 라디칼은 매우 활동적이며 모든 생체 분자와 신속하게 반응 할 수있어 장기 또는 조직에 큰 해를 끼칩니다 [30]. 하이드록실 라디칼은 세포에 가장 독성이 강한 반응성 산소 종이며[31], 이는 신체의 산화를 강화함으로써 세포 아폽토시스를 촉진시킨다[32]. Yang et al. [33] 은 히드록실 라디칼에 대한 작약 씨 오일의 소거 효과는 농도에 따라 다르며 히드록실 라디칼의 클리어런스는 0.1-0.5 mg / mL의 농도 범위에서 최대 92 %임을 발견했습니다. 이 논문과 비교했을 때, 작약 종자 식사 플라보노이드의 클리어런스는 작약 씨 오일보다 낮았지만 작약 씨 오일의 생산에서 부산물로서 작약 종자 식사에서 추출 된 플라보노이드는 또한 낮은 농도에서 히드록실 라디칼에 대한 명백한 소거 효과를 가졌습니다. 따라서, 작약 플라보노이드는 하이드록실 라디칼을 소거하는 능력을 가진 기능성 식품 원료로 간주될 수 있다. 한편으로는 인간의 항산화 방어 시스템에 더 나은 보호 효과가 있었고 다른 한편으로는 모란 씨앗의 포괄적 인 활용도를 향상시킬 수있었습니다.
2.4. 펭단 모란 플라보노이드의 미백 활동
그림 4에서 볼 수 있듯이, 펭단 작약 플라보노이드 (0.03-1.00 mg / mL)는 티로시나제의 8.53-81.08 % 억제를 생성했으며, 이는 용량 의존적으로 티로시나제 억제를 나타냈다. IC50은 0.24 mg/mL이었다. Lin et al. [36]은 모란에서 에탄올 추출물의 농도가 1 mg / mL 일 때 티로시나제의 억제율이 약 75 %라는 것을 발견했습니다. 티로시나제의 억제율은 이 논문의 결과에 근접하였다. 멜라닌은 미백을 억제하는 핵심 물질이다 [37]. 티로시나제는 멜라닌 합성에 중요한 효소로, 화장품 및 미백 기능성 식품을 스크리닝하는 지표로 사용됩니다 [38]. 티로시나제 억제제는 대부분의 화장품 또는 미백 식품에 필수적인 성분입니다 [39]. 본 연구에서, 작약 플라보노이드는 티로시나제 활성에 대한 명백한 억제 효과를 가졌다. 따라서 모란 플라보노이드를 화장품에 첨가하거나 미백 식품을 미백 재료로 사용하는 것이 실현 가능하고 유효했습니다.
표 2.억제 구역의 직경.
3. 재료 및 방법
3.1. 재료 및 시약
탈지 된 Fengdan 작약 종자 식사는 Guyu Peony Biotech-nology Co., Ltd. (Heze, China)에서 구입했습니다. 종자 식사를 가루로 분쇄한 다음, 40메쉬 체를 통과시켰다[45]. 종자 식사 분말을 수집하여 장래의 사용을 위해 4◦C에서 저장하였다. 루틴 표준, 비타민 C (VC), 메탄올, 무수 에탄올 아질산 나트륨 (NaNO2), 질산 알루미늄 (Al(NO3)3) 및 수산화 나트륨 (NaOH)은 중국에서 공급되었습니다.제약 그룹 유한 회사 (베이징, 중국); 하이드록실 라디칼, DPPH 자유 라디칼ABTS 자유 라디칼 제거 능력 키트는 상하이 Tongwei 산업 유한 회사에서 구입했습니다.
3.2. 총 플라보노이드의 추출
또한, 탈지된 펭단 작약 종자 박식 15.00 g을 1000 mL 비이커에 첨가하였다. 그 후, 전기 블렌더(OES-60M, 온저우, 중국, 220 r/min)를 갖는 디지털 디스플레이 온도 조절 수조(HH-S4, 장쑤, 중국)에 넣고 메탄올 농도는 90%, 고체 대 액체 비율은 1:35 g:mL, 추출 온도는 55◦C, 추출 시간은 80분이었다. 추출시, 총 팔보노이드의 여액을 진공 필터에 의해 수집하였다.
3.3. 단일 요인 실험
펭단 작약 종자 식사의 총 플라보노이드 수율은 단일 인자 실험을 사용하여 최적화되었다. 그것은 총 플라보노이드 수율에 대한 네 가지 요인의 효과를 반영 할 수 있습니다. 본 실험은 단일 변수 방법에 의해 조사되었다. 실험의 인자 및 변수는 표 3에 나타내었다.
표 3.단일 요인 실험의 요인과 변수
3.4. RSM 실험
단일 요인 실험은 RSM 실험을 위해 각 요인의 세 가지 변수를 제공했습니다. 본 연구에서, 단일 인자 실험에 기초하여, 메탄올 농도는 90%로 선택되었다; 고체-액체 비율, 추출 온도 및 추출 시간을 인수로 사용하였다. 작약 총 플라보노이드 수율을 반응값으로 사용하였다. Design-Expert 소프트웨어 12.0의 Box-Behnken 테스트의 원리에 기초하여, 세 가지 요인과 세 가지 수준을 가진 RSM은 모란 종자 식사에서 총 플라보노이드의 추출 조건을 최적화하도록 설계되었습니다. 전체 실험 설계는 17개의 실험 포인트로 구성되었다(표 S1). 다섯 번의 복제(13-17)가 설계 센터에서 수행되어 순수한 오류를 추정했습니다. RSM의 인자 및 수준은 표 4에 입증되었다.
표 4.RSM의 요인 및 수준입니다.
3.5. 풍단작약 토탈 플라보노이드 분말의 제조
최적의 추출 공정이 RSM에 의해 결정된 후, 풍단 작약 총 플라보노이드 여액을 최상의 추출 공정으로 추출한 다음, 여액을 회전 증발기(20 mL/min, 25 W, R-1001VN, 정저우, 중국)로 농축한 후 작약 총 플라보노이드 분말을 수득하고 동결건조기(−80 ◦C, 24 h, SCIENTZ-12N, 닝보, 중국). 이 분말은 항산화, 미백 및 항균 실험에 사용됩니다.
3.6. 항산화 활성 평가
펭단 작약의 총 플라보노이드 용액 및 VC 용액을 상이한 질량 concen-trations (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mg/mL)로 제조하였고, 이는 3개의 자유 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 클리어런스를 결정하는데 사용될 것이다.
3.6.1. DPPH 자유 라디칼 분석
DPPH 자유 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 클리어런스는 Pham, D. C.에 의해 기술된 바와 같이, 약간의 변형과 함께 결정되었다[48]. 간략하게, 150 μL의 anhy-drous 에탄올 중의 0.2 mM DPPH를 상이한 농도 (0.1-1.0 mg/mL)로 샘플의 150 μL에 첨가하였다. 혼합물을 진탕시키고, 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 200 μL 혼합물을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 효소 표지 기기(SpectraMax 190, 상하이, 중국)에 의해 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. VC를 대조물질로 사용하였다. DPPH의 클리어런스는 다음 식에 의해 계산되었다.
DPPH%= {1− [(Ai - Aj) / Ao] ×100 } % (2)의 클리어런스
여기서 Ai는 150 μL 샘플 + 150 μL DPPH의 흡광도였으며; Aj는 150 μL 샘플 + 150 μL 무수 에탄올의 흡광도였으며; A0은 150 μL DPPH + 150 μL 무수 에탄올의 흡광도였다.
3.6.2. 하이드록실 라디칼 분석
히드록실 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 클리어런스는 Zhou, J.에 의해 기술된 바와 같이, 약간의 변형과 함께 결정되었다[49]. 간략하게, 상이한 농도의 50 μL 샘플 용액 (0.1-1.0 mg/mL), 50 μL의 9.0 mM 살리실산-에탄올 용액, 50 μL의 9.0 mM FeSO4 용액 및 200 μL의 증류수를 튜브에 혼합하였다. 그 후, 50 μL의 8.8 mM H2O2를 상기 혼합물에 첨가하고, 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 히드록실 라디칼의 클리어런스는 하기 식에 의해 계산되었다.
하이드록실 라디칼 %= {1− [(Ai - Aj) / Ao] ×100 } % (3)의 클리어런스
여기서 Ai는 샘플의 흡광도이고; Aj는 H2O2 대신 탈이온수의 흡광도이다; A0은 시료 대신 탈이온수의 흡광도였다.
3.6.3. ABTS 자유 라디칼 분석
ABTS 자유 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 클리어런스는 일부 변형과 함께 Gong, J.에 의해 기술된 바와 같이 결정되었다[50]. 간략하게, 7 mM ABTS 용액 1 mL와 2.45 mM 과황산칼륨 용액 1 mL를 어둠 속에서 실온에서 12 시간 동안 튜브에서 혼합하였다. 혼합물을 무수 에탄올로 40배 희석하였다. 그런 다음 190 μL의 혼합물과 10 μL의 샘플을 다양한 농도 (0.1-1.0 mg / mL)로 튜브에서 6 분 동안 어둠 속에서 실온에서 혼합했습니다. 흡광도를 734 nm에서 측정하였다. ABTS 자유 라디칼의 클리어런스는 하기 식에 의해 계산되었다.
ABTS % = {1− [(Ai - Aj) / Ao] ×100 } % (4)의 클리어런스
여기서 Ai는 10 μL 샘플 + 190 μL 혼합물의 흡광도였으며; Aj는 10 μL 샘플 + 190 μL 무수 에탄올의 흡광도였으며; A0은 10 μL 무수 에탄올 + 190 μL 혼합물의 흡광도였다.
Cistanche 명확한 자유 라디칼.
3.7. 미백 활동 평가
티로시나제 억제 검정은 경미한 변형을 갖는 첸 Q에 의해 기재된 바와 같이 결정되었다[38]. 간략하게, 80 μL의 1/15 포스페이트 완충액 (pH 6.8)에 용해된 5 mmol/L 티로신 40 μL를 37◦C에서 15분 동안 40 μL 펭단 작약 총 플라보노이드 용액과 혼합하였다. 다음에, 40 μL의 티로시나제 (300 IU/mL)를 첨가하여 반응을 개시하였다. 분석 혼합물을 37◦C에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도를 482 nm에서 효소 표지된 기기(SpectraMax 190, 상하이, 중국)에 의해 측정하였다. 동시에, 빈 그룹과 대조군이 설정되었다. 빈 그룹에서, 티로시나제는 첨가되지 않았고, 부피를 구성하기 위해 포스페이트 완충액이 사용되었다. 대조군에서는 플라보노이드 용액을 첨가하지 않았고, 인산염 완충액을 사용하여 부피를 구성하였다. 티로시나제 활성의 억제 백분율은 다음 식으로 계산하였다:
억제율(%)= [1−(As -Ab) / (Ac - Ab)]×100% (5)
여기서 AB는 482 nm에서의 블랭크 그룹의 흡광도였고, AC는 482 nm에서의 대조군의 흡광도였고, AS는 482 nm에서의 샘플의 흡광도였다.
3.8. 항균 활성 실험
이어서, 400 μL의 멸균수를 박테리아 동결건조 튜브에 첨가하였다. 완전히 혼합된 후, 200 μL의 박테리아 액체를 한천 플레이트에 골고루 퍼뜨렸다. 박테리아를 활성화시키기 위해 24시간 동안 37◦C의 생화학적 인큐베이터(LRH-250, 650 W, Changzhou, China)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 단일 콜로니를 일회용 접종 루프(65-0001, 산동, 중국)를 갖는 한천 플레이트에서 채취하고, 액체 배지에 접종하였다. 배지를 37◦C, 120 r/min에서 24시간 동안 지능형 항온 배양 발진기(HNYC-202T, 1800W, 톈진, 중국)에 넣었다. 박테리아 현탁액의 농도를 혈구측정기 (Q401, 상하이, 중국)에 의해 관찰되고 계수된 다음, 106 CFU/mL로 조정하였다[51].
억제 구역 실험은 펀칭 방법에 의해 조작되었다. 먼저, 다양한 농도(30 mg/mL 및 500 mg/mL)의 펭단 작약 총 플라보노이드 용액을 80% 메탄올로 제조하였다. 이어서, 80 μL의 박테리아 현탁액을 멸균 한천 배지 상에 고르게 확산시켰다. 다음으로, 직경 7 mm의 펀처(A0358, 광저우, 중국)에 의해 매질에 4개의 구멍을 펀칭하였다. 세 개의 구멍은 총 플라보노이드 용액 100 μL에 첨가되었고, 다른 하나는 대조군으로서 80% 메탄올 100 μL를 첨가하였다. 최종적으로, 24 h 동안 37◦C의 생화학적 배양기에서 배양하였다. 각 구멍 주위의 클리어 억제 구역의 직경은 버니어 캘리퍼(SWB-227-150, 광저우, 중국)를 사용하여 측정하였다.
MIC 실험은 다음 단계에 따라 수행하였다. 상이한 농도의 총 플라보노이드 용액을 함유하는 박테리아-리알 성장 시스템(0.0037, 0.0073, 0.0146, 0.0293, 0.0586, 0.1172, 0.2344, 0.4688, 0.9375, 1.8750, 3.7500, 7.5000, 15.0000 mg/mL)을 이중 구배 희석법에 의해 제조하였다[52]. 또한, 총 플라보노이드 용액이 없는 박테리아 용액을 첨가하여 성장 대조군으로 사용하였고, 세균 용액이 없는 총 플라보노이드 용액을 빈 대조군으로 사용하였다. 이들은 지능형 항온 배양 발진기(HNYC-202T, 1800 W, 톈진, 중국)에서 37◦C, 120 rpm/min에서 24시간 동안 배양하였다. 박테리아 성장이 없는 총 플라보노이드의 최대 희석 농도는 박테리아 상의 총 플라보노이드의 MIC였다[53].
3.9. 통계 분석
설계-전문가 V12.0.3.0(Stat-Ease Inc., 미네소타주, 미네소타주, 미국)을 사용하여 사분면 다항식 모델의 계수를 계산하고 최적화하였다. F-값과 p-값은 다항식 모델 방정식의 정확도를 검사하는 데 사용되었고, p-값은 0.05 미만(p< 0.05)="" were="" considered="" as="" statistically="" significant.="" all="" experi-="" ments="" were="" measured="" three="" times,="" and="" the="" data="" values="" were="" expressed="" as="" means="" ±="" standard="" deviation="">
4. 결론
본 연구에서, 풍단 작약 총 플라보노이드의 최적 추출조건은 메탄올 농도 90%, 고체 대 액체 비율 1:35, 추출 온도 55◦C, 추출시간 80분, 총 플라보노이드 수율은 1.204%였다. 우리는 추출 공정이 산업 생산에 적합하다고 믿습니다. 상기 펭단 작약 플라보노이드는 우수한 항산화 효과를 입증하였으며, DPPH 자유 라디칼에 대한 총 플라보노이드의 클리어런스는 75%, 하이드록실 라디칼은 70%, ABTS 자유 라디칼은 97%였다. 또한, 펭단 작약 플라보노이드는 일정한 미백 효과를 가졌고, 펭단 작약 플라보노이드의 티로시나제에 대한 억제율은 용량 의존적으로 나타났으며, IC50은 0.24 mg/mL에 이를 수 있었다. 또한, 펭단 작약 총 플라보노이드는 그람 양성 박테리아의 성장을 억제할 수 있었다. 모든 결과는 건강 제품 및 기능성 식품 원료에 펭단 작약 총 플라보노이드의 적용에 대한 신뢰할 수있는 데이터 지원을 제공하고, 펭단 작약 총 플라보노이드의 산업 생산을위한 토대를 마련했다.
플라보노이드가 들어있는 시스탄체 정제
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