인간 OCT2/MATE에서 정점 전단 응력 강화된 유기 양이온 수송{1}}형질 감지와 관련된 형질전환된 Madin-Darby 송곳니 신장 세포
Mar 04, 2022
자세한 내용은:emily.li@wecistanche.com
Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz, Shuvo Roy
생명공학 및 치료과학부(AJ, PS, DLK, SR) 및 소아과(PRB),
캘리포니아 대학교 샌프란시스코(UCSF), 샌프란시스코, 캘리포니아;
테네시 주 내슈빌의 Vanderbilt University Medical Center(NF, WF)
요약
능동 수송신장근위 세뇨관은 약물 처리에 중요한 역할을 합니다. 약물 개발 중 추정신장배설은 용량 결정에 필수적입니다. 흐름 유도 전단 응력과 같은 신장의 생리학적 사촌을 재현하는 신장 생물반응기는 현재의 시험관 내 모델보다 생체 내 약물 거동을 더 잘 예측할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 Madin-Darby 개에 의한 4-(4-(디메틸아미노)-스티릴)-N-메틸 피리디늄 요오드화물(ASP plus )의 능동 수송에 대한 전단 응력의 역할을 조사했습니다.신장세포인간 유기 양이온 수송체 유기 양이온 수송체 2(OCT2) 및 다중 약물 및 독소 압출 단백질 1(MATE1)을 외인성으로 발현. 연속 배지 관류 하에 평행 플레이트에서 배양된 세포는 이눌린에 대한 높은 장벽을 갖는 단단한 단층을 형성하였다. 증가하는 전단 응력 수준(0.2-2 dynes/cm)에 대한 응답으로, 세포는 ASP plus의 수송에서 상응하는 증가를 보여 2에서 최대 4.{7}}배 증가에 도달했습니다. 정적 조건에서 배양된 세포와 비교한 dynes/cm². 이 수송은 이미프라민으로 억제되었으며, 이는 전단 응력 조건에서 능동 수송이 존재함을 나타냅니다. 2 dynes/cm²의 전단 응력에 노출된 세포는 또한 형질감염된 인간과 내인성 OCT2(각각 3.{12}} 및 2.{14}}배)의 RNA 발현 증가를 보였습니다. 황산암모늄에 의한 섬모 제거는 0.5 dynes/cm²에서 ASP와 수송에 대한 전단 효과를 제거했지만 정적 조건에서 ASP와 수송에는 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 결과는 전단 응력이 유기 양이온의 능동 수송에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.신장멋진섬모 의존적 방식으로 상피 세포.
소개
최적의 약물 후보를 선택하기 위한 전임상 방법의 주요 발전에도 불구하고 약물 개발은 시장에 출시된 새로운 분자 개체의 수율이 매우 낮고 길고 비용이 많이 드는 과정으로 남아 있습니다(Watkins, 2011). 전임상 모델의 주요 결점은 인간에서 제거 및 독성을 예측할 수 없다는 것입니다. 전임상 연구에서 성공적인 약물의 약 30%는 예상치 못한 제거 값 또는 독성의 결과로 인간에서 실패합니다(Kola and Landis, 2004).
신장은 모든 약물과 대부분의 대사 산물의 1/3 이상을 제거하기 때문에 시험관 내 세포 배양 모델링에서 특히 중요한 대상입니다(Morrissey et al., 2013). 그만큼신장근위세뇨관은 약물 후보물질의 활성 수송의 대부분을 수행하고 특히 독성 손상에 민감하기 때문에 개발 중 약물 테스트에 중요합니다(Giacominiet al., 2010). 그만큼신장세뇨관여액이 정점 표면을 가로질러 흐르는 상피 세포의 단층입니다. 기저막은 세뇨관 상피의 밑에 있으며 인접한 세뇨관 주위 모세혈관은 물과 경례의 재흡수를 허용합니다. 근위 세뇨관 미세 환경, 특히 유체 전단 응력 및 정점 종양 구배는 기존의 세포 배양 기술에 의해 불완전하게 재현됩니다. 현저한 생체 내 생리학을 포착하는 상피 세포 생물 반응기는 시험관 내 분석에서 파생된 제거 및 독성 예측의 정확도를 향상시킬 수 있습니다(Pfaller 및 Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).
성장하는 증거는 근위 세뇨관 세포 형태와 기능이 성장 표면 다공성, 양쪽 유체에 대한 노출 및/또는 유체 전단 응력과 같은 성장 환경에 따라 달라질 수 있음을 나타냅니다. Essig와 Friedlander(2003)와 우리 연구실(Ferrell et al.2010)의 이전 연구는 근위 세뇨관 세포의 정점 액틴 세포골격에서 세뇨관 유체 흐름 유도 재배열을 입증했습니다(Ferrell et al., 2010). . 그 후, 여러 연구에서 전단 응력이 나트륨-수소 안티포터 3를 포함한 다중 흡수 및 유출 운반체의 발현 수준 및 위치에 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다. Na/K-ATPase, 포도당 운반체, 상피 나트륨 채널, 세포내이입 수용체, 메갈린 및 튜불린 (Duan et al., 2010; Raghavan et al., 2014; Jansen et al..2016; Ernandez et al., 2018). 다른 연구는 관형 생물 반응기 시스템의 전단 흐름이 방향을 잡고 연장된다는 것을 보여주었습니다.신장멋진흐름 경로를 따라 세포(Venzac et al. 2018). 시험관 내 증거는 세포골격 구조 및 수송 기능의 일부 변경이 섬모의 기계감각 기능과 관련될 가능성이 있음을 나타냅니다(Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al..2014). 그러나 신장 세포의 약물 수송체에 대한 전단 응력의 영향을 고려한 연구는 거의 없습니다. 또한, 특히 전단 응력에 지속적으로 노출될 때 세포 기능에 대한 다양한 전단 속도의 영향에 대해 알려진 바가 거의 없습니다. 대부분의 연구는 단일 전단 응력 속도를 고려하고 단기 실험(1-6시간)만 수행하여 전단의 실제 효과와 미세 환경의 급격한 변화에 대한 세포 응력 반응을 구별하기 어렵습니다(Duan et al.2010; Jang et al.2013: Maggiorani et al.2015).
여기에서 미세유체 생물반응기는 등급별 전단응력 수준의 영향을 조사하는 데 사용되었습니다.신장근위 세뇨관 세포 약물 수송체 유기 양이온 수송체 2(OCT2) 및 다중 약물 및 독소 압출 단백질 1(MATE1). 우리는 정점 전단 응력이 증가하면 유기 양이온 수송 및 수송체 발현이 증가하고 섬모가 전단 응력에 대한 이러한 세포 반응에 관여한다는 것을 보여줍니다.
재료 및 방법
장치 제작 및 조립. 우리는 이전에 세포의 정점 측과 기저 측의 정적 저장소를 가로질러 조절 가능한 높이의 유체 흐름 경로를 제공하는 평행판 생물 반응기에 대한 설계를 발표했습니다(Brakeman et al., 2016). 여기에 제시된 작업을 위해 우리는 한 번에 4가지 생물학적 조건을 테스트할 수 있도록 4개의 개별 흐름 경로가 있는 다중 장치를 만들기 위해 이전 설계를 적용했습니다(그림 1). 각 장치는 5-ml 정점 저장소가 있는 베이스, 1.12cm² 셀 면적의 Snapwell 인서트(Costar, Corning, Corning, NY)를 고정하기 위한 중간 플레이트, 1-~{6}}ml 기저외측 저장소. 판
오토클레이브에 의한 멸균이 가능하도록 폴리설폰으로 가공되었습니다. 높이가 500- ~ 1000-um인 레이저 절단 실리콘 개스킷을 각 플레이트 세트 사이에 끼워서 유체 구획을 밀봉하고 정점 면에서 채널 높이를 정의했습니다. 생물반응기는 나사를 사용하여 조립되었습니다. 미디어 저장소와 버블 트랩이 내장된 컬럼입니다. 입구와 출구는 내경이 1.{6}}mm인 Masterflex LS14 실리콘 튜브에 가시 커넥터를 사용하여 연결되었습니다(Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). 유체 흐름 및 이에 따른 정점 전단 응력은 연동 펌프(Cole Parmer)에 의해 설정 및 제어되었습니다.
세포 배양 및 흐름. 빈 벡터 또는 한 쌍의 흡수 및 유출 운반체(hOCT2/hMATE1)(Konig et al..2{15}}11)로 형질감염된 MDCK 세포는 Dr. Martin Fromm(Erlangen, Germany)에 의해 제공되었으며 다음에서 배양되었습니다. 10% 소 태아 혈청(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(UCSF 세포 배양 시설)이 포함된 Earle의 균형 염 용액(UCSF 세포 배양 시설)이 있는 최소 필수 배지. 밀리리터당 500마이크로그램의 하이그로마이신(UCSF 세포 배양 시설) 및 100mg/h ml 제네티신(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)을 이중 형질감염된 세포용 배지에 첨가했습니다. 흐름 실험을 위해, hOCT2/hMATE1 MDCK 세포 Snapwell 삽입물(Corning)의 밑면에 300,{11}} cells/well(250,{13}} cells/cm")의 밀도로 도금하고, confluence가 될 때까지 정적 조건에서 성장한 다음 생물 반응기. 정점 배지 흐름은 원하는 전단 응력이 달성될 때까지 7일에 걸쳐 0.1에서 1-6mlmin으로 증가한 다음 실험 전에 72시간 동안 안정했습니다. 세포는 대조군과 동일한 시간 동안 정적 조건에서 성장했습니다. .
면역형광. 세포를 4% 파라포름알데히드(Thermo Fisher Scientific)로 고정하고 0.1% Triton-Xin PBS(Sigma-Aldrich)로 투과화하고 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich)으로 차단했습니다. 이어서 이들을 Alexa 488 표지된 zonula occludens{9}} 마우스 단일클론 항체(Life Technologies, Carlsbad, CA) 또는 1차 아세틸화 튜불린 마우스 단일클론 항체(Life Technologies)의 1:50 희석액과 함께 60분 동안 인큐베이션했습니다. α-튜불린 항체로 처리된 세포는 F-액틴 염색을 위해 이차 561 항-마우스 염소 항체(Life Technologies) 및 팔로이딘(Thermo Fisher Scientific)과 함께 인큐베이션되었습니다. 이미징은 40x 오일 대물렌즈가 있는 Nikon(Tokyo, Japan) 분광 공초점 현미경을 사용하여 수행되었습니다.
장벽 성능. 5000 Da 폴리머인 이눌린은 사구체 여과율의 잘 알려진 마커이며 생체 내 근위 세뇨관 누출의 마커입니다(Sohtell et al, 1983).
FITC로 표지된 이눌린(Sigma-Aldrich)을 정점 배지에 첨가하고 장치를 통해 흐르게 하였다. 24시간마다 기저 저장소에서 샘플을 수집하고 Genios Pro 형광 플레이트 판독기(Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 이눌린 함량을 분석했습니다. 세포 단층의 장벽 기능은 eq.1에 설명된 대로 정점 및 기저 구획에서 측정된 이눌린 수준으로부터 계산되었습니다. 여기서 Capital은 정점 구획의 이눌린 농도이고 C Mal은 기저 구획의 농도입니다. 이눌린리크는 기저(공여자) 구획의 농도를 24시간 후 세포 면적으로 나눈 값으로 계산되었습니다.
ASP 플러스 전송. 이전에 설명한 대로(Konig et al, 2011), 수송 실험 24시간 전에 형질도입된 수송체 유전자를 10mM Na-부티레이트(Sigma-Aldrich)로 유도했습니다. 적절한 경우, 세포를 기저 측에 억제제(500μM 이미프라민 또는 1mM 시메티딘(Sigma-Aldrich))와 함께 30분 동안 배양한 다음 25μM 4-(4-디메틸아미노)-를 첨가했습니다. 스티릴-N-메틸 피리디늄(ASP plus)(Life Technologies)을 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플은 정점 및 기저 배지에서 수집되었습니다. 그런 다음 세포를 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 3회 헹구고 ASP 플러스 축적 및 수송을 측정하기 위해 용해했습니다. 전단 응력 하에서 세포에 대해 수송 실험을 동시에 수행하고 정적 조건에서 배양하였다. ASP 플러스 농도는 485 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장에서 Genios Pro 형광 평판 판독기(Tecan)에서 정량화되었습니다.
단백질 정량. 밤새 흔들어 주면서 세포를 1% SDS{1}} M NaOH 용해 완충액으로 용해했습니다. 표준 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 단백질 함량을 측정했습니다. 적절한 경우, 단백질 함량은 세포 성장 영역에 대해 정규화되었습니다.
RNA 발현. RNeasy RNA Extraction Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 세포에서 RNA를 추출하고 스크립트 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 cDNA를 생성했습니다. cDNA는 인간 및 개 OCT2 및 MATE1의 검출에 사용되었으며 Fast Realtime PCR 기기(Applied Biosystems)에서 Tagman assay 및 probe(Applied Biosystems)를 사용한 정량적 역전사효소-중합효소 연쇄 반응에 의한 개 P-당단백질(P-GP). 리보솜 단백질 S18(RS-18)을 하우스키핑 대조군으로 사용했습니다. 전단 응력이 수송체 발현에 미치는 영향은 RS{9}}에 대해 표현된 수송체 수준을 사용하는 4ACt 방법을 사용하여 분석되었습니다(Peters et al.2007; Schmittgen and Livak, 2008). P-GP는 운반체 발현에 대한 전단 응력의 전체적인 영향의 척도로 사용되었습니다.
둔감함. 세포가 합류될 때까지 성장한 다음 ASP 플러스 수송을 측정하기 전에 24시간 동안 30mM 황산암모늄(Fluka AG)의 부재 또는 존재하에 인큐베이션했습니다(Oxergard et al 2009). 섬모의 존재는 이미 본원에 기재된 바와 같이-튜불린의 영상화에 의해 결정되었다.
통계. 모든 실험은 각 실험 내에서 최소 2회의 기술 복제로 3회 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되고 상자 및 수염 플롯으로 그래프로 표시됩니다. 통계 분석은 짝을 이루지 않은 일원 또는 이원 분산 분석에 의해 수행되었으며, P-값은 다음과 같습니다.<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">
결과
세포 형태 및 장벽 기능. Immunofluo의 최근 언더플로 배치된 세포 분석은 정적 및 유동 조건 모두에서 세포 사이의 밀착 접합에 국한된 밀착 접합 단백질인 폐쇄형 구역-1을 사용하여 균일한 단층 형성을 나타냈습니다(그림 2, A–C). 총 단백질 함량의 정량화는 전단 응력에 대한 응답으로 단층의 제곱센티미터당 단백질 함량이 최대 1.{4}}배 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 2D). 다음으로, 우리는 단층을 가로질러 근위 세뇨관 누출의 마커인 이눌린의 투과성을 측정했습니다. 기기는 최대 2dynes/cm2의 전단 응력 하에서 배양 7일 동안 97.9% 6 1.42%의 차단 성능을 유지하여(그림 2E) { {15}}.13~{17}}.69mg/cm2/일.
유기 양이온 수송에 대한 전단 응력의 영향. OCT2 및 MATE1의 자동 형광 기질인 ASP plus의 수송은 다양한 수준의 전단 응력(0.2-2 dynes/cm²)에서 1시간 동안 측정되었습니다. hOCT2 및 hMATE1을 외인성으로 발현하는 MDCK 세포는 세포 축적(그림 3A)과 세포간 수송(그림 3A) 모두의 측정에 반영된 바와 같이 2dynes/cm²의 전단 응력에 대한 반응으로 ASP와 수송에서 4.{9}}배 증가를 나타냈습니다. 3B). ASP 플러스 축적 또는 세포간 수송에 대한 전단 응력의 효과는 0.5 및 2 dynes/cm²의 전단 응력에서 유사했습니다. 활성 ASP 플러스 수송이 증가했는지 확인하기 위해 0.2 dynes/cm의 전단 응력에 노출된 세포에 의한 ASP 플러스의 수송을 OCT인 500 uM 이미프라민으로 전처리하거나 처리하지 않고 측정했습니다.{20} } 및 MATE{21}}특정 억제제. ASP 플러스 수송은 정적 조건 하에서 47.6% ±19.7%에 비해 전단 응력 조건에서 이미프라민 60.3% ± 15.8%에 의해 억제되었습니다(그림 3C).
이 관찰을 더 이해하기 위해, 인간 OCT2(형질전환된), 개 OCT2(내인성) 및 개 P-GP(내인성)의 발현에 대한 전단 응력의 영향을 72시간 동안 다양한 수준의 전단에 노출된 세포에서 측정했습니다. 7일에 걸쳐 느린 전단 증가(그림 4). 정적 조건에서 배양된 세포와 비교하여 전단에 노출된 MDCK 세포는 형질감염된 인간 및 내인성 OCT2의 발현 증가(각각 최대 3.7- 및 2.{11}}}배)를 나타내었지만 유의한 효과는 없었습니다. 형질감염된 MATE1 또는 내인성 P-GP의 발현.
전단에 대한 반응에서 섬모의 역할. 이미징은 이중 형질감염된 MDCK 세포가 정적 및 유동 조건 모두에서 섬모를 발현함을 보여주었다(그림 5, A 및 E). 세포를 3{12}}mM 황산암모늄에 24시간 동안 노출시키면 섬모가 완전히 소실되었습니다(그림 5, C 및 G). 중요하게도, 상피 세포의 세포막 접합부에서 밀착 접합 단백질을 고정하는 F-액틴의 영상화에 의해 측정된 바와 같이 섬모는 세포막 접합부에 큰 영향을 미치지 않았습니다(그림 5.D 및 HD(Stevenson and Begg. 1994).이 이미지에서 F-actin 염색이 약간 두꺼워지긴 했지만 일관된 소견이 아니었기 때문에 이 효과를 정량화하지 않았습니다. Deciliation은 정적 조건에서 배양된 세포의 수송에 영향을 미치지 않았지만 완전히 0.5 dynes/cm²의 전단에 노출된 세포에서 ASP와 수송에 대한 전단 응력의 영향을 제거했습니다(그림 6).
논의
신장은 인체에서 약물을 제거하는 데 중심적인 역할을 합니다. 체외 약물 테스트, 특히 유체 흐름과 관련하여 신장 생리학의 복잡성을 정확하게 모방하는 것이 중요합니다. 유체 흐름의 전단 응력은 시험관 내에서 세포 형태 및 이온 수송체에 영향을 미치는 것으로 나타났지만 약물 수송체에 대한 영향에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다(Duan et al., 2010; Ferrell et al., 2012; Jansen et al., 2016). . 또한, 대부분의 이전 연구는 단기 전단(1-6 시간)의 효과만 측정했는데, 이는 전단 응력 효과를 다른 세포 응력 반응으로부터 완전히 분리할 것 같지 않습니다(Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al..2015). 이 연구에서 우리는 약물 전달에 대한 유체 흐름의 지속(7일) 전단 응력 효과에 초점을 맞춰 다음과 같은 지속 전단 응력을 더 잘 모방했습니다.신장멋진생체 내 세포.
약물 수송체가 지속적인 전단 응력에 어떻게 반응하는지 이해하면 신장에 의한 생체 내 약물 취급에 대한 시험관 내 예측을 향상시킬 수 있습니다. 정확하게 설계된 신장의 체외 모델은 전임상 테스트를 표준화하고 약물 실패율을 줄일 수 있습니다.
이 작업에서 평행판 미세유체 생물반응기는 OCT2와 MATE1에 의한 유기 양이온 수송에 대한 지속적인 전단 응력의 영향을 결정하는 데 사용되었습니다.신장세뇨관세포주. Hopfer 그룹(Orosz et al, 2004) 및 RPTECs(CRL{1}}: American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al., 2008), 이중 형질감염된 hOCT2/hMATE1 MDCK 세포는 여러 가지 이유로 이 연구에 가장 적합한 선택으로 간주되었습니다. 첫째, MDCK 세포는 트랜스웰 삽입물에 대한 강력한 부착을 일관되게 보여주므로 유체 흐름의 초기 응력을 견딜 수 있습니다. 둘째, 이러한 세포는 누출을 방지하고 마커 기질의 세포간 수송 연구에 필수적인 단단한 단층을 형성합니다. 마지막으로, 수송체의 외인성 발현은 능동 수송 및 섭동 효과의 개선된 검출을 허용한다.
언더플로 배치된 세포는 합류 단층을 형성하고 세포 주변부에 밀착 접합 단백질을 국한시켰다. 그들은 또한 이눌린 투과성에 의해 측정된 바와 같이 높은 장벽 기능을 유지했습니다. 체액과 단백질 누출을 방지하는 단층을 형성하는 상피 세포의 능력은 세뇨관의 적절한 기능에 매우 중요합니다. 여기에서 MDCK 세포를 통한 누출은 1일 1ug/cm² 미만으로 최소화되었으며 인간 세포를 통한 누출보다 현저히 낮습니다. 우리는 이전에 인간 신장 세포 단층이 10-20 ug/cm²/일 이눌린 누출이 있음을 보여주었고(Brakeman et al., 2016), 이는 hOCT2/hMATE1 MDCK 세포가 강력한 단층을 형성했다는 결론을 뒷받침합니다.
ASP 플러스의 수송은 정적 대조군과 비교하여 72시간 동안 다양한 수준의 전단 응력에 노출된 hOCT2/hMATE1 MDCK 세포에서 유의하게 증가했습니다. ASP 플러스는 OCT2(SLC22A2)에 의해 흡수되고 MATE1(SLC47A1)에 의해 유출됩니다.신장메트포르민 및 시스플라틴과 같은 일반적으로 사용되는 약물의 분비(Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013). 근위 세뇨관 이온 수송체에 대해 전단 응력의 유사한 효과가 보고되었습니다. 증가된 전단 응력에 대한 반응으로 알부민 흡수, 이온 재흡수, 메갈린 및 튜불린 발현 및 기능의 증가가 보고되었습니다(Overgaard et al..2009; Duan et al.2010: Ferrell et al..2012: Raghavan et al., 2014). 의 노출신장전단 응력에 대한 근위 세뇨관 세포는 또한 감소된 세포자멸사 및 급성 시스플라틴 독성으로부터의 빠른 회복 및 유기 음이온 수송의 향상된 억제와 관련이 있습니다(Jang et al.2{1}}13). 유체 흐름의 전단 응력이 근위 세뇨관에 지속적으로 존재하기 때문에 이러한 발견은 종합적으로 신장 약물 처리 및 독성을 예측하기 위해 보다 생리학적인 시험관내 모델 시스템의 사용을 뒷받침합니다. 전단 응력의 0.5와 2.0 dynes/cm² 사이에 수송체 기능에 큰 차이가 없다는 점은 주목할 만합니다. Essig와 Friedlander의 이전 연구(2{11}}03)에서는 세포 형태의 변화를 이끌어내기 위해 0.17dynes/cm2의 최소 전단 수준이 필요하다는 것을 발견했으며 다른 연구에서는 다음과 같은 영향을 측정했습니다. 최대 1dyne/cm²의 생리학(Duan et al., 2010). 이것은 신장 약물 수송체의 기능에 대한 더 높고 지속적인 전단 응력 수준의 영향을 조사한 첫 번째 연구이며, 우리가 예상하는 전단 응력 0.5와 2.0 dynes/cm² 사이의 생물학적 차이의 크기가 가능합니다. 평가된 값은 우리 분석에서 이러한 전단 응력 수준 간의 차이를 식별할 수 있을 만큼 충분히 크지 않았습니다. 추가 조사가 필요하지만, 우리의 결과는 생리학적으로 관련된 모델에 필요한 조건과 질병으로 인한 증가된 전단 응력 수준이 신장 약물 취급에 미치는 영향을 밝힙니다.
우리 실험 방법의 한계 중 하나는 hOCT2/hMATE1 MDCK 세포(Konig et al..2011)에 대해 이전에 설명한 실험 방법을 모방하여 정점 및 기저 측 모두에서 pH 7.4의 배지를 사용하여 pH 7.4에서의 수송만 처리했다는 것입니다. 정점에서 기저까지의 pH 구배는 OCT2 및 MATE1 기능에 영향을 미칠 수 있으며 일반적으로 생리학적 조건에서 pH 구배가 있습니다(Muller et al., 2013). 따라서 우리의 방법은 정점에서 기저까지의 pH 구배와 OCT2 및 MATE1 기능에 대한 전단 응력 사이의 상호 작용을 평가하는 능력을 제한했습니다. 우리는 모든 실험 조건에서 일관된 pH 7.4를 사용했기 때문에 이러한 pH 구배의 부족이 우리의 발견에 영향을 미쳤을 가능성은 없지만 정점에서 기저 pH 구배가 있는 경우 OCT2 및 MATE1 수송에 대한 우리 발견의 적용 가능성을 잠재적으로 제한합니다.
놀랍게도, 형질감염된 인간 및 내인성 OCT2의 mRNA 발현은 정적 대조군과 비교하여 모든 수준의 전단 응력에 노출된 세포에서 증가하였다. 이러한 수송체 발현의 상향조절은 내인성 P-GP 발현 또는 형질감염된 MATE1에 대한 측정 가능한 효과 없이 특이적이었다. 수송체 발현의 상향 조절은 수송 증가의 이면에 있는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하며, 이는 향상된 mRNA 안정성 또는 증가된 mRNA 전사의 결과일 수 있습니다. 형질감염된 OCT2가 거대세포바이러스 프로모터 아래에서 발현되었고 내인성 유전자 발현 조절 메커니즘의 대상이 되어서는 안 되므로 형질감염된 OCT2와 내인성 수송체가 모두 상향조절되었다는 점에 주목하는 것이 흥미롭습니다. 놀라운 사실이지만 이러한 관찰은 전례가 없습니다. 관류에 노출된 OAT1 형질감염된 근위 세뇨관 세포에 대한 유사한 효과가 보고되었지만 증가된 발현에 대한 메커니즘은 여전히 불분명합니다(Jansen et al., 2016). 다른 연구에서 Nrf2 신호전달은 전단 응력에 대한 반응으로 내인성 MATE{7}}K 발현을 증가시키는 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다(Fukuda et al., 2017). 이에 대한 추가 연구가 필요하며 향후 조사의 주제가 될 것입니다.
우리는 또한 정점 전단 흐름의 도입이 세포의 평방 센티미터당 단백질 함량을 증가시켰음을 확인했습니다. 이 효과는 전단의 0.5 및 2dynes/cm² 모두에 대해 동일한 크기였으며, 이는 mRNA 발현 및 ASP 플러스 수송에서 나타나는 효과와 유사합니다. 전단 응력이 키를 증가시킨다는 증거가 있습니다.신장제곱센티미터당 더 큰 부피의 세포를 생성하여 제곱센티미터당 단백질의 증가 가능성이 있는 상피 세포; 그러나 이전에 발표된 이 현상은 더 많은 양의 데이터에서 사소한 관찰일 뿐이며 정량화되지 않았습니다(Long et al., 2017). 정점 전단 흐름이 있는 상태에서 성장한 세포의 총 단백질 증가는 건강한 사람의 정상적인 단백질 함량을 나타낼 수 있습니다.신장멋진정점 전단 흐름에 세포의 노출에 의해서만 달성될 수 있는 상피 세포. 따라서 정적 배양에서 성장한 세포의 낮은 수준의 단백질 함량은 급성 신장 손상과 같은 낮은 정단 여과액 흐름의 상황에서 임상적으로 발생할 수 있는 비정상적인 세포 상태를 나타낼 수 있습니다. 이 현상은 더 연구할 가치가 있습니다.
섬모는 근위 세뇨관에서 기계 감각 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다(Raghavan 및 Weisz,2{14}}16). 따라서 여기에 보고된 증가된 OCT2 및 MATE 매개 수송에 중요한 역할을 하는지 여부를 확인하기 위해 섬모 제거가 수송체 기능에 미치는 영향을 측정했습니다. 우리 연구에서 섬모 제거에 의한 ASP 플러스 수송의 전단 의존적 증가의 완전한 차단은 Raghavan et al.의 연구에서 발견된 효과와 유사합니다. (2{16}}14), 체액 흐름에 대한 반응으로 세포내이입에서 섬모 의존성 상향조절을 입증했습니다. 황산 암모늄은 간접적으로 용질 수송에 영향을 미칠 수 있는 세포 행동 및 기능에 대해 특성화되지 않은 다른 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 가능한 오프 타겟 효과에도 불구하고, 이 탈피 방법은 유기 용질의 운반체 매개 운동에 대한 모양체 감지의 역할을 테스트합니다. 섬모의 기계 감각 단백질과 수송체 사이의 신호 전달 메커니즘은 현재 알려져 있지 않습니다. 한 가지 가설은 유기 양이온 수송체의 기능이 변경된 이온 수송에 의해 변경된다는 것입니다. 섬모 제거는 특히 Nat/K plus를 감소시켜 근위 세뇨관 세포의 용질 운동성을 변경하는 것으로 알려져 있습니다. ATPase 막 국소화 및 세포주변 수송 변형(Overgaard et al.., 2009). 이로 인해 H 기울기에 의존하는 안티포터인 MATE1 기능이 변경될 수 있습니다. 또 다른 가설은 전단 응력의 감지가 유기 양이온 수송체의 발현에 영향을 미친다는 것입니다. 전단 응력은 Nrf2 신호를 통해 MATE{11}}K 기능을 조절합니다(Fukuda et al., 2017). 다른 유기 양이온 수송체는 기계감각 섬모가 제거될 때 제거될 전단 응력에 유사하게 반응할 수 있습니다. 이것의 대부분은 알려지지 않았으며 추가 연구가 필요합니다. 흥미롭게도 섬모 제거는 0.2 dynes/cm²의 전단 응력에 노출된 세포에 의한 ASP 플러스 수송에 큰 영향을 미치지 않았지만 전단 응력이 0.5 dynes/cm²로 증가했을 때 강력한 효과가 관찰되었습니다. 이것은 섬모가 임계 전단 응력 수준을 감지한다는 것을 시사합니다. 차례로, 수송에 대한 측정 가능한 효과가 예상되기 전에 수송체 발현 및 기능의 섬모 신호 변화가 예상됩니다. 전반적으로, 섬모의 전단 응력 감지에 대한 유기 양이온 수송의 의존성은 관련된 기계적 감각 신호 전달 경로와 전단에 대한 강력한 반응을 유발하는 데 필요할 수 있는 최소 수준의 응력에 대한 통찰력을 제공합니다.
요약하면, 이러한 데이터는 유체 흐름의 전단 응력이 MDCK 세포에서 유기 양이온 수송체 기능 및 발현에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 또한, 유기 양이온 수송의 상향 조절은 섬모의 존재에 의존했습니다. 우리는 정점 전단 응력이 체외 모델링의 중요한 구성 요소라고 제안합니다.신장멋진세포와 약물의 신장 분비 제거 및 신독성을 모델링하는 중요한 구성요소가 될 가능성이 있습니다. 기계적 스트레스 신호가 수송체 활동과 발현을 증가시키는 특정 메커니즘은 여전히 불분명하며 추가 연구가 필요합니다.
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