노화 세포의 아폽토시스 저항성은 심장 배당체에 의해 유도된 세놀리시스에 대한 본질적인 장벽입니다

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추상적인노화 세포의 표적 제거 분석은 노화 방지 요법의 핵심 추세 중 하나입니다. 심장 배당체는 최근 광범위한 스펙트럼 senolytics로 입증되었습니다. 여기에서 우리는 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)에 대한 심장 배당체의 senolytic 특성을 테스트했습니다. 심장 배당체는 다양한 기원의 노화 hMSC에 대한 세놀리틱 능력이 없었습니다. 생물학적 및 생물 정보학 접근 방식을 사용하여 우리는 '심장 배당체에 민감한'A549 및 '민감하지 않은'hMSC에서 노화 발달을 비교합니다. 분석의 부재는 노화된 hMSC에서 효과적인 칼륨 수입 및 증가된 세포자멸사 저항성에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌습니다. "항세포자멸사 방어"를 약화시키면 hMSC가 분석에 취약합니다. 우리는 이전에 노화의 공통된 특징으로 인식되었던 세포자멸사 저항성이 실제로 노화 세포의 일반적인 특징이 아님을 밝혔습니다. 또한, apoptosis-proline 노화 세포만이 심장 배당체 유도 분석에 민감합니다. 따라서 우리는 분석의 효과가 노화 세포가 증식하는 세포와 비교하여 실제로 세포 사멸 저항성이 되는지 여부에 달려 있다고 추측할 수 있습니다.

키워드줄기 세포. 세놀리시스·노화·아포토시스·스트레스 저항성

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소개

오늘날 세포 노화는 다양한 스트레스 자극에 대한 일부 유사분열 후 세포뿐만 아니라 암 및 줄기 세포를 비롯한 거의 모든 유형의 증식하는 세포의 일반적인 반응으로 간주됩니다[1-3]. 세포 노화의 유형은 유도 인자의 기원에 따라 구별될 수 있습니다. 산화 스트레스, 열 충격, UV 및 y 방사선 등) 및 화학 요법 유도(화학 요법 약물에 대한 반응으로 암세포에서 활성화됨)[4-7]로 인한 DNA 손상에 의해 매개됩니다. 노화 세포가 발현하는 마커는 세포 유형과 노화 유도에 사용되는 손상 모두에 따라 이질성이 있습니다. 그러나 대부분의 노화 세포 유형에는 몇 가지 공통적인 특징이 있습니다. 모든 종류의 분열 세포에서 노화의 본질적인 특징은 비가역적 증식 손실이다[8].시스탄체 튜불로사 추출물세포주기 정지의 비가역성은 cyclin-dependent kinase(CDK) 억제제 p16과 p21에 의해 조절되며 종종 종양 억제 단백질 p53에 의해 조절됩니다[8,9]. 노화 세포의 다른 중요한 특징은 지속적인 DNA 손상 반응의 활성화입니다. 리보솜 생합성 및 단백질 합성 장애의 결과로 종종 발생하는 세포 비대; 리소좀 분해 장애 및 나머지 분해 시스템의 기능 장애; 특정 리소좀 효소 노화 관련{7}}갈락토시다제의 활성 증가; 다양한 미토콘드리아 변화; 전염증 인자, 기질 분해 효소, 활성 산소 종 등으로 구성된 노화 관련 분비 표현형(SASP)의 획득; 노화 관련 이색 초점의 형성 및 노화 관련 인공위성의 팽창을 포함하는 후성 유전적 및 염색질 경관 변화[{13}}]. 즉, 노화 세포는 대사 활동과 활력을 보존하지만 그 기능은 기원 세포.

Cistanche 캔 안티 에이징

이제 노화 세포가 주변 세포와 세포 적소에 영향을 미치는 주변 미세 환경을 수정할 수 있다는 것이 분명해지며, 이는 조직 기능 장애로 이어질 수 있으므로 노화 및 노화 관련 질병의 진행과 관련될 수 있습니다[11,12]. 이를 염두에 두고 오늘날에는 노화 세포[13-15]를 표적으로 "죽이는" 전략에 더 많은 관심이 집중되고 있습니다. 이를 위해 세놀리틱스(senolytics)라는 새로운 종류의 약물이 활발히 개발되고 있습니다. Senolytics는 세포 사멸에 대한 노화 세포의 저항에 기여하는 신호 전달 경로를 표적으로 삼아 노화 세포에서 우선적으로 세포 사멸을 유도합니다[16]. 세놀리틱스 목록은 지속적으로 새로운 약제로 보충되고 있습니다. 언급된 세놀리틱 활성을 가진 가장 알려진 화합물은 다사티닙(다중 티로신 키나아제 억제제)과 케르세틴(천연 플라보놀)의 조합인 나비토클락스(Bcl{5}} 계열 억제제), Hsp90 억제제, MDM2 억제제, FOXO{ {8}}p53 간섭 펩타이드, BET 계열 단백질 분해제, uPAR 특이적 CAR-T, 갈락토 접합 navitoclax 및 다양한 세놀리틱 천연 화합물[16-24]. 최근에 고처리량 약물 스크리닝을 사용하여 두 개의 독립적인 연구 그룹이 심장 배당체, 특히 ouabain, digoxin 및 bufalin을 광범위한 senolytics로 확인했습니다[25,26].cistanche tubulosa 리뷰선언된 거의 모든 세놀리틱에는 바람직하지 않은 부작용이나 일부 세포 유형에 대한 비효율과 같은 한계가 있다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 거의 모든 출생 후 기관/조직에서 발견되는 중간엽 줄기 세포(MSC)는 자가 재생(대칭 분할) 및 분화 능력을 특징으로 하여 상주 조직의 유지 및 재생에 기여합니다[27]. 이러한 고유한 특성과 강력한 항염 및 면역억제 기능으로 인해 MSC는 당뇨병, 다발성 경화증, 심근경색증 등 다양한 질병의 치료를 위한 세포 대체 요법에 광범위하게 적용됩니다[28]. 그러나 분화된 자손 및 기타 단능 세포와 유사하게 MSC는 종양유전자의 활성화 및 스트레스 자극에 대한 반응으로 복제적이거나 조기에 노화할 수 있습니다. 줄기 세포 풀의 감소, 조직 유지 및 재생 감소, 분화 능력 손상, SASP 매개 노화 확산, 혈관 신생 특성 감소, 줄기 세포 틈새의 변형 [29,{8}}]. 적절한 MSC 기능의 생물학적 중요성을 고려할 때 노화 MSC는 분석의 중요한 대상으로 간주될 수 있습니다. 이러한 제안에 따라, 노화 MSC 제거의 가능한 유리한 결과를 강조하는 많은 리뷰가 지난 1년 동안 발표되었습니다[29, 31,34,35]. 그럼에도 불구하고 이 문제[{13}}]와 관련된 실험 데이터는 몇 개뿐입니다.

현재 연구 내에서 우리는 처음으로 심장 배당체, 즉 ouabain 및 bufalin이 자궁내막(END-MSC), 지방 조직(AD-MSC), 치수(DP-MSC) 및 Warton jelly(WJ-MSC). 또한, 우리는 이전에 설명한 바와 같이 두 심장 배당체가 senes-cent A549 및 SK-HEP-1에서 우선적으로 세포자멸사를 유도할 수 있음을 확인합니다. 파일럿 연구에서 [25,26]. Nat/K 플러스 -ATPase 차단 및 관련 유전자의 발현 수준으로 인한 이온 항상성의 변경을 평가함으로써 우리는 ouabain-유도 분석의 부재가 노화 END-에서 보상적 K 플러스 수입의 향상된 효과에 의해 매개될 수 있음을 밝힙니다. 노화 A549와 비교한 MSC. 또한 고급 생물 정보학을 사용하여 ouabain 유도 분석에 내성이 있는 END-MSC의 노화가 세포자멸사 내성 표현형의 획득을 수반하는 반면 ouabain에 민감한 A549의 노화는 그렇지 않음을 보여줍니다. 중요한 것은 심장 배당체 치료 전에 항세포사멸 단백질 MCL{19}}의 활성을 차단하면 세포사멸 저항성 노화 END-MSC가 분석된다는 것입니다. 따라서 우리는 세포자살 저항성이 노화 세포의 일반적인 특징이 아니라는 분명한 증거를 제공합니다. 얻은 데이터를 기반으로 분석적 접근의 효과는 세포가 노화 발달 동안 실제로 세포자멸사 저항성이 되었는지 여부에 달려 있다고 결론지었습니다.

재료 및 방법

세포

END-MSC, WJ-MSC, DP-MSC, AD-MSC, A549 및 SK-Help는 Russian Collection of Cell Cultures(Institute of Cytology, Saint-Petersburg, Russia)에서 입수했습니다. A549 및 SK-Help 라인은 핵학, 종양원성, 동종효소(LDH 및 G6PD) 테스트 및 STR 분석을 통해 인증되었습니다. 세포를 10% FBS(HyClone), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco BRL) 및 1% 글루탐산(Gibco BRL)이 보충된 완전 배지 DMEM F12(Gibco BRL)에서 배양했습니다. 모든 세포는 일상적으로 마이코플라스마 오염에 대해 테스트되었습니다.

노화 및 스트레스 유발 조건

산화 스트레스 유발 노화를 위해 END-MSC/WJ-MSC를 200 uM/100 uM H2O(Sigma)로 1시간 동안 처리했습니다. 독소루비신 유도 노화를 위해 DP-MSC/A549에 1μM의 독소루비신(Veropharm)을 3일 동안 처리했습니다. 각 경우에, 세포는 처리 후 14일 이내에 노화된 것으로 간주되었다. 복제 노화의 경우 4차 계대 이전의 AD-MSC는 대조군 세포로, 10차 계대 이후의 세포는 노화 세포로 확인되었습니다. etoposide에 의한 노화에 대해 A549/END-MSCs/SK-Help에 2 uM/5 uM/3 uM etoposide(Veropharm)를 3일간 처리하고 노화 유도 후 7일 이내에 분석하였다. 이 경우 처리 설계는 RNA-seq 데이터가 시작된 연구에서 설명한 것과 완전히 일치했습니다(Wang et al., 2017). 우리가 세놀리틱 화합물로 적용한 두 개의 심장 배당체 - Ouabain(Sigma) 및 Bufalin(Calbiochem).

대조군과 노화 END-MSC 또는 A549 간의 스트레스 저항성을 비교하기 위해 세포를 4{6}}0/800 uM H2O2(Sigma)로 1시간 동안 처리하거나 0.3/1 uM 스타우로스포린(Sigma)을 처리했습니다. 스트레스 유도 48시간 후 세포 생존율을 분석했습니다.

MCL-1 활동을 차단하기 위해 END-MSC를 3일 동안 10uM의 A-1210477(Sigma)로 전처리했습니다.

유세포 분석

세포 생존율, 증식, 세포 크기, 자가형광, 세포자멸사 속도, caspase 3/7 절단, 미토콘드리아 막 전위 및 막 탈분극의 측정은 유세포 분석에 의해 수행되었습니다. CytoFLEX(Beckman Coulter)를 사용하여 유세포 분석을 수행하고 CytExpert 소프트웨어 버전 2.{4}}를 사용하여 얻은 데이터를 분석했습니다. 부착 세포를 PBS로 2회 헹구고 트립신 처리에 의해 수확하였다. 분리된 세포를 풀링하고 새로운 배지에 재현탁한 다음 계수하고 자가형광에 대해 분석했습니다. 세포 생존 능력에 접근하기 위해 분석 직전에 각 샘플에 50ug/ml 요오드화 프로피듐(Life Technologies)을 첨가했습니다. 세포 크기는 PI-음성 세포의 cytometric 전방 광산란에 의해 평가되었습니다. 아폽토시스 유도는 제조사 지침에 따라 Annexin-V-APC(Invitrogen) 및 DAPI(Sigma) 동시 염색을 사용하여 확인되었습니다. Caspase 활성은 제조업체 프로토콜에 따라 CellEventTM Caspase{11}}/7 Green Flow Cytometry Assay Kit(Invitrogen)를 사용하여 평가되었습니다. 비율 측정 염료 JC{13}}(Invitrogen)를 사용하여 미토콘드리아 막 전위의 손실을 평가했습니다. 염색 절차는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 멤브레인 탈분극을 위해 우리는 DiBAC4(3) 형광 프로브(Invitrogen)를 사용했습니다.

노화 관련 -갈락토시다아제 염색

노화 관련 -갈락토시다제(SA- -Gal) 염색은 제조업체의 지침에 따라 노화 -갈락토시다제 염색 키트(Cell Signaling Technology)를 사용하여 수행되었습니다. 이미지의 정량적 분석은 앞에서 설명한 알고리즘에 따라 MatLab 패키지를 적용하여 생성되었습니다[41]. 각 실험 포인트에 대해 무작위로 선택된 50개 이상의 세포가 분석되었습니다.

웨스턴 블로팅

Western blotting은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[41]. SDS-PAGE 전기영동, 니트로셀룰로오스 막으로의 이동 및 ECL(Thermo Scientific) 검출을 사용한 면역블롯팅을 표준 제조업체의 프로토콜(Bio-Rad Laboratories)에 따라 수행했습니다. 다음 단백질에 대한 항체가 사용되었습니다: 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)(클론 14C1{24}}), 포스포-p53(Ser15), p21(클론 12D1), 포스포-Rb(Ser807/811) , HMGB1(클론 D3E5), 뿐만 아니라 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항토끼 IgG. 희석 비율은 모든 1차 항체의 경우 1:1000, 2차 항체의 경우 1:7000이었습니다. 모든 항체는 Cell Signaling에서 구입했습니다. Scion Image 4.0(Scion Corporation)을 사용하여 모든 겔 및 블롯에서 밴드의 배경 빼기 밀도를 선택하고 결정했습니다.

전사체 분석

다음 3가지 유전자 발현 옴니버스(GEO)RNA-seq 데이터 세트의 샘플이 분석에 사용되었습니다. GSE122081(제어 및 노화 IMR{12}} 세포에 대한 GSM{8}}GSM3454484 및 GSM{10}}GSM3454502); 데이터세트 GSE160702(제어 및 노화 END-MSC의 경우 각각 GSM{14}}GSM4877898 및 GSM{16}}GSM4877910) 모든 데이터 세트의 데이터는 동일한 방식으로 처리되었습니다.

Raw는 기본 옵션을 사용하여 BBtools 패키지(버전 38.75)에서 FilterByTile 및 BBDuk 스크립트를 통해 품질 필터링 및 어댑터 트리밍을 거친 데이터를 읽습니다. 나머지 읽기는 FastqPuri 패키지(버전 1.0.7)의 삼분기 스크립트를 사용하여 추가로 필터링 및 트리밍되었습니다.시스탄체 영국N이 포함되어 있거나 품질이 27로 설정된 품질 임계값 미만인 경우 읽기의 양쪽 끝에 트리밍 작업이 적용되었으며 25개 염기보다 짧은 모든 읽기는 폐기되었습니다. 트리밍의 품질 관리는 FastQC 소프트웨어(버전 0.11.7) 및 FastqPuri 스크립트로 이루어졌습니다. 모든 작업을 통과한 읽기는 초기 데이터의 90% 이상을 구성합니다.

선택적 정렬 모드에서 실행되는 연어 경량 매핑(버전 1.1.{2}})을 사용하여 전사체 풍부도를 추정했습니다. 미끼 목록은 Gencode 인간 참조 게놈 GRCh38.p13(릴리스 33)을 기반으로 생성되었으며, kmer 크기 21을 사용하여 연결된 전사체 및 게놈 Gencode 참조 파일(릴리스 33)에 대한 인덱스를 구축하는 데 추가로 사용되었습니다. 매핑 작업이 실행되었습니다. 추가 플래그 사용——numBootstraps 30——스팽글——gcBias—— 매핑을 확인합니다. 결과 매핑 비율은 약 70%였습니다.

추가 데이터 처리는 패키지 Tidyverse 컬렉션(버전 1.3.0)과 함께 R 버전 3.6.3을 사용하여 수행되었습니다. 추정된 유전자 수, 메타데이터 및 전사 범위를 R에 로드하고 tximeta(버전 1.4.5)를 사용하여 유전자 수준으로 요약했습니다. 결과 카운트 매트릭스는 모든 샘플에 걸쳐 5개 이상의 추정 카운트를 갖는 행을 포함하도록 필터링되었으며, 결과 매트릭스는 20,400개의 유전자를 포함했습니다.

PCA 및 히트맵 표현의 경우 DESeq2 패키지(버전 1.26.0)의 로그 변환을 사용하여 읽기 수를 정규화했습니다.시스탄체 위르쿵히트맵은 유전자 필터(버전 1.38.0) 및 히트맵(버전 1.0.12)R 패키지를 사용하여 구성되었습니다. 유전자 온톨로지 용어 "Cellular senescence"(GO 009{19}}398)와 관련된 유전자에 의한 정규화된 읽기 수의 하위 집합을 통해 노화 변수에 의한 분할 샘플의 검증을 수행했습니다. 세포 노화 상태, ouabain 처리 반응 및 표시된 요인의 상호 작용에 대한 설계 공식 제어의 마지막 변수에 대해 DESeq2를 사용하여 차등 발현 분석 및 로그 배수 변화 추정을 계산했습니다. 미분 표현 테스트를 강화하기 위해 팜 패키지(버전 1.8.{28}})의 적응형 수축 추정기의 조합을 사용하고 0.667과 동일한 추가 로그 폴드 변경 임계값을 지정하는 로그 폴드 변경 수정이 적용되었습니다. 결과적으로 축소된 추정치는 Benjamin-Hochberg 방법에 따라 다중 비교를 위해 조정된 p 값을 사용하여 클러스터 프로필(버전 3.14.3) 및 fuse(버전 1.12.0)R 패키지를 사용하여 유전자 순위 지정 및 유전자 세트 농축 분석 실행에 추가로 사용되었습니다. 대조군 및 노화 AD-MSC용 Affymetrix 마이크로어레이 샘플은 GEO 데이터베이스(GSE66236)에서 얻었고 log2 및 분위수 카운트 정규화를 사용하여 Phantasus 웹 애플리케이션으로 처리되었습니다. 유전자 세트 농축 분석은 퓨즈(버전 1.12.0)R 패키지를 사용하여 수행되었습니다.

RNA 추출, 역전사 및 실시간 PCR

RNA 추출, 역전사 및 실시간 PCR은 이전 연구에서 설명한 대로 수행되었습니다[32]. RNA 추출용 시약(ExtractRNA 시약), 역전사(MMLV RT 키트) 및 실시간 PCR(HS SYBR 키트)을 위한 시약은 Evrogen에서 구입했습니다. 유전자 발현 수준은 조사된 모든 유전자에 대해 실시간 PCR BioRad CFX{4}} 증폭기(BioRad)를 사용하여 평가되었습니다. , 72도에서 15초 동안 합성. 반응의 특이성을 제어하기 위해 용융 곡선 분석이 적용되었습니다. GAPDH 발현을 기준으로 사용하는 표준 2deltaCt 정량 방법과 함께 Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어(BioRad)를 사용하여 얻은 데이터에 대한 다음 분석을 수행했습니다. 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있습니다.

통계 분석

두 그룹 간의 차이에서 유의성을 얻기 위해 Student's t-test 또는 Welch's t-test를 적용했습니다. 그룹 간의 다중 비교를 위해 Tukey의 HSD를 사용한 ANOVA가 사용되었습니다. 달리 표시되지 않는 한 모든 정량적 데이터는 평균±표준편차로 표시되며 별표는 다음과 같이 유의한 차이를 나타냅니다. ns, 유의하지 않음,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

결과

H2O{1}}처리된 END-MSC는 조기 노화에 들어갑니다.

본 연구에서는 hMSC를 정의하기 위해 ISCT에서 제안한 최소 기준을 충족하는 박리된 자궁내막(END-MSC)에서 분리된 인간 중간엽 줄기세포를 사용했습니다[41]. 이전에 우리는 END-MSC의 조기 노화의 다양한 측면을 연구하기 위해 신뢰할 수 있는 실험 모델을 개발했습니다[30]. 즉, 우리는 치명적인 산화 스트레스를 받은 END-MSC가 영구적인 DNA 손상 병소 및 활성 DNA 손상 반응, 고전적인 p53/p21/Rb에 의해 매개되는 비가역적 세포 주기 정지를 포함하여 노화 세포의 모든 전형적인 특징을 점진적으로 획득함을 보여주었습니다. 경로, 증식 손실, 세포 비대, SA{8}}Gal 염색의 출현 및 노화 관련 분비 표현형의 발달 [30, 32, 42]. 여기에서 우리는 디자인된 모델을 적용하여 ouabain의 senolytic 효과를 연구하고 이온 항상성의 기본 세포 내 변경을 밝힙니다. 처음에 가장 일반적인 매개변수를 추정하여 단일 용량(1시간, 200μM) H2O 처리가 END-MSC에서 노화를 유도하기에 충분하다는 것을 확인했습니다. 중요하게는, 스트레스를 받은 END-MSC는 산화 스트레스 2주 후에 노화된 것으로 간주되었습니다. 따라서 모든 노화 마커는 H-Oz 처리 후 14일 이내에 평가되었습니다. 실제로, END-MSC의 H-Oz 처리는 증식 차단, 증가된 세포 크기로 표시되는 세포 비대, 자가형광의 상승에 의해 검출된 리포푸신의 축적, SA{22}}Gal의 출현, p21/Rb 경로와 HMGB1의 손실은 함께 선택한 실험 조건에서 노화 확립을 지원합니다(그림 ac, e, f).

조직 및 유기체 수준에서 노화 세포의 가장 해로운 영향은 수명이 연장된 결과로 여겨집니다. 이 점과 일치하게, H2Oβ 처리된 END-MSC는 노화 발달의 후기 단계에서도 높은 생존력을 유지하였다(노화 END-MSC의 생존력은 초기 산화 스트레스 후 17일(14일+3일)에 평가됨)(그림 1d). ). 요약하자면, END-MSC의 치명적인 H2O{9}}치료는 조기 노화의 적절한 모델이며 END-MSC에 대한 세놀리틱 화합물의 영향을 조사하는 것과 관련이 있습니다.

심장 배당체 ouabain은 광범위한 농도 범위에서 노화 END-MSC에 대한 세놀리틱 활성이 없습니다.

최근 증거에 따르면 ouabain, digoxin 및 bufalin을 포함한 심장 배당체는 용혈 활성이 있는 화합물 계열을 나타냅니다[25,26]. 오늘날 심장 배당체는 광범위한 senolytics로 간주되지만 노화 hMSC에 대한 영향에 관한 데이터는 부족합니다. 따라서 여기에서 우리는 ouabain이 노화 END-MSC에서 선택적으로 죽음을 유도할 가능성이 있는지 여부를 테스트했습니다. 이를 위해 우리는 넓은 농도 범위(10-'에서 10~M까지)에서 ouabain으로 처리한 후 대조군과 노화 END-MSC의 생존력을 평가했습니다. 흥미롭게도, 적용된 농도 중 어느 것도 ouabain 적용 후 첫날에 대조군과 노화 세포 모두의 생존력이 눈에 띄게 감소하지 않았습니다(그림 2 및 보충 그림 S1).

그러나 ouabain 치료 후 3일째에 대조군 END-MSC의 생존력에서 상당한 용량 의존적 감소가 나타났습니다(그림 2a 및 보충 그림 S1). 예상외로 노화 세포는 테스트된 각 농도에서 ouabain에 더 내성이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이 결과에 따라10-M ouabain은 노화 세포(15.01% An+/PI)에 비해 대조 세포(20.75% An + /PI-및 36.47% An + /PI +)에서 더 쉽게 세포 사멸을 유도했습니다. - 및 12.15% An + /PI + )(그림 2b). 얻은 결과는 노화 END-MSC의 맥락에서 ouabain이 세놀리틱 활성을 갖지 않음을 분명히 보여줍니다.

ouabain의 세놀리틱 작용에 대한 노화 유도 자극의 가변성과 관련된 가능한 효과를 배제하기 위해 추가 실험 세트를 수행했습니다. 즉, 조기 노화를 유도하기 위해 산화 스트레스 대신 etoposide로 END-MSC를 처리했습니다.감귤류 바이오플라보노이드Etoposide로 처리된 END-MSC는 노화 세포에 전형적인 모든 특징을 보였다(그림 3a-e).

중요하게도, ouabain은 etoposide 처리된 노화 END-MSC에 대해 용혈 작용이 없었습니다(그림 3f 및 보충 그림 S2). 이 데이터는 위의 결과에 대한 추가 확인을 제공하고 ouabain 유도 분석의 부족이 노화를 유도하는 데 사용되는 구체적인 노화 유발 요인의 결과가 아니라는 증거를 제공합니다.

그림 1 산화 스트레스 유발 END-MSC 조기 노화 모델의 검증. 노화 END-MSC는 느슨한 증식, b 비대, c 상승된 자가형광 획득, 높은 세포 생존력 유지 d 및 e가 대조군과 비교하여 SA{4}}Gal 활성을 나타냅니다. f 제어 및 노화에서 p53 및 Rb의 인산화 수준 및 p21 및 HMGBI 단백질의 발현 수준 END-Ouabain은 다양한 기원의 인간 중간엽 줄기 세포에 대해 용혈 작용이 없습니다. , 우리는 지방 조직, 치수 및 Wharton's jelly를 포함한 다른 출처에서 분리된 hMSC에 대한 ouabain 효과를 분석했습니다. 데이터를 추가로 강화하기 위해 AD-MSC의 경우 복제 노화, DP-MSC의 경우 독소루비신 유도 노화, WJ-MSC의 경우 산화 스트레스 유발 노화와 같은 다양한 노화 모델을 적용했습니다(그림 4a-f).

그림 4g에서 볼 수 있듯이 다양한 유형의 hMSC는 ouabain 처리 시 생존력이 달랐습니다. 예를 들어 대조군과 노화 DP-MSC는 모두 WJ-MSC보다 ouabain 작용에 훨씬 더 내성이 있었습니다(그림 4g 및 보충 그림 S3b, 씨). 그럼에도 불구하고 ouabain은 두 가지 유형의 노화 hMSC에서 세놀리시스를 유도할 수 없었습니다(그림 4g 및 보충 그림 S3). 함께 얻은 데이터는 ouabain 유도 분석의 부재가 다양한 유형의 hMSC에 대한 일반적인 특징임을 보여줍니다. MSC. 제시된 값은 평균±SD입니다. 및 d에서 다중 그룹 비교의 경우 일원 분산 분석이 적용되었습니다. n=3, ns는 유의하지 않음,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다

심장 배당체 부팔린은 노화 END-MSCS를 죽이지 못합니다

hMSC에 대한 강심배당체의 세놀리틱 작용의 부재를 확인하기 위해, 강심배당체 계열에 속하는 명시된 세놀리틱 활성을 갖는 또 다른 화합물인 부팔린을 적용했습니다[25]. Bufalin은 넓은 농도 범위(10-7에서 10-5 M까지)에서 대조군과 H2O2-처리된 노화 END-MSC의 생존력에 거의 영향을 미치지 않았습니다(그림 5a 및 보충 그림 S4a).

우리가 ouabain 치료에 대해 관찰한 것과 유사하게, 산화 스트레스 또는 에토포사이드에 반응하여 노화된 ESC의 생존력이 영향을 받지 않았기 때문에 부팔린에 대한 분석의 부재는 노화 유도 자극과 무관했습니다(그림 5a, b, 보충 그림 5). S4a, b). 위에서 설명한 결과는 심장 배당체가 노화 END-MSC에서 표적 사멸 유도에 효과가 없는 것으로 판명되었음을 확인합니다. MSC. 제시된 값은 평균±SD입니다. 및 d에서 다중 그룹 비교의 경우 일원 분산 분석이 적용되었습니다. n=3, ns는 유의하지 않음,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

심장 배당체 부팔린은 노화 END-MSCS를 죽이지 못합니다

hMSC에 대한 강심배당체의 세놀리틱 작용의 부재를 확인하기 위해, 강심배당체 계열에 속하는 명시된 세놀리틱 활성을 갖는 또 다른 화합물인 부팔린을 적용했습니다[25]. Bufalin은 넓은 농도 범위(10-7에서 10-5 M까지)에서 대조군과 H2O2-처리된 노화 END-MSC의 생존력에 거의 영향을 미치지 않았습니다(그림 5a 및 보충 그림 S4a).

우리가 ouabain 치료에 대해 관찰한 것과 유사하게, 산화 스트레스 또는 에토포사이드에 반응하여 노화된 ESC의 생존력이 영향을 받지 않았기 때문에 부팔린에 대한 분석의 부재는 노화 유도 자극과 무관했습니다(그림 5a, b, 보충 그림 5). S4a, b). 위에서 설명한 결과는 심장 배당체가 노화 END-MSC에서 표적 사멸 유도에 효과가 없는 것으로 판명되었음을 확인합니다.

그림 2 Ouabain은 넓은 농도 범위에서 H2O2-노화성 END-MSC에 대해 용혈 활성이 없습니다. 1077,10~6,{10}} M ouabain으로 처리한 후 3일 동안 대조군 및 노화 END-MSC의 상대적 세포 생존율(%). b Annexin V/DAPI 이중 염색에 의해 평가된 10-6 M ouabain 시 END-MSC에서 세포자멸사 유도. n{13}} 독립적인 실험. 모든 데이터는 평균±SD에 해당합니다. 통계적 유의성은 Welch의 t-검정에 의해 평가되었습니다. ns 유의하지 않음,***p<>

심장 배당체인 ouabain과 bufalin은 노화 A549 및 SK-Hep1 세포에서 선택적으로 세포 사멸을 유도할 수 있습니다

우리의 결과가 심장 배당체의 광범위한 세놀리틱 작용에 관한 최근 발표된 증거와 일치하지 않는다는 사실을 고려하여 관련 연구에 설명된 세포 모델을 사용하여 이 효과를 재현하기로 결정했습니다[25,26]. 따라서 우리는 대조군 및 노화 A549 폐암 세포를 사용하여 일련의 실험을 수행했습니다. A549 세포의 노화는 에토포사이드 처리에 의해 유도되었다. A549 세포의 에토포사이드 유도 노화는 자주 사용되며 따라서 치료 유도 노화의 잘 특성화된 모델입니다[4]. 또한, ouabain은 etoposide 처리된 노화 A549 세포[25]를 선택적으로 사멸시키는 것으로 나타났습니다. A549의 노화를 확인하기 위해 증식 속도, 세포 크기, lipo-fine 축적, SA{15}}Gal 염색, 활성화 상태를 평가했습니다. p53/p21/Rb 경로 및 HMGB1의 발현 수준(그림 6a-e).

노화 암 세포에 대한 ouabain의 용혈 활성을 확인하기 위해 먼저 용량 의존적 세포 생존력을 추정했습니다. 위에서 설명한 결과와 일치하여 ouabain 적용 후 24시간 이내에 생존 가능한 대조군 또는 노화 A549 세포 수의 유의한 감소를 감지할 수 없었습니다(보충 그림 S5a). 그러나 처리 후 3일 만에 ouabain은 노화 A549 세포의 생존 능력을 용량 의존적으로 유의하게 감소시킨 반면 대조군 A549 세포의 수는 훨씬 적은 정도로 감소했습니다(그림 7a 및 보충 그림 S5a). 즉, 동일한 용량으로 처리된 노화 A549 세포의 50%에 비해 대조군 세포의 약 90%가 10- M ouabain에서 생존력을 보존했습니다(그림 7a). 또한, 노화 A549 세포는 대조군보다 부팔린 유도 세포 사멸에 더 취약했습니다(그림 7b)(그림 5b 및 보충 그림 S5b).

발표된 데이터에 따르면 ouabain은 노화된 A549 세포에서 카스파제{0}}의존성 세포자멸사를 촉발했습니다[26]. 실제로, 우리는 10-6M ouabain으로 처리된 노화 암세포에서 이중 양성 및/또는 PI-분획의 상당한 증가를 밝혔습니다(그림 7c). 또한 형광 분석을 사용하여 ouabain 처리된 노화 A549 세포에서 caspase{6}}의 활성화를 관찰했습니다(그림 7d). 종합하면, 이러한 결과는 다른 저자가 설명한 데이터와 완전히 일치하며 A549에 대한 ouabain의 용혈 활성을 확인합니다.

또한, 우리는 A549에서 노화를 유발하기 위해 etoposide 대신 doxorubicin을 사용했습니다(그림 8a-e). 예상대로 독소루비신 처리 노화 A549와 에토포사이드 처리는 대조군에 비해 ouabain과 bufalin 모두에 대해 더 높은 민감성을 보여주었습니다(그림 8g 및 보충 그림 S6). 후자는 심장 배당체의 세놀리틱 효과가 노화 유도 자극과 무관하다는 것을 확인합니다. 따라서 심장 배당체에는 실제로 세놀리틱이 있습니다.

그림 3 Ouabain은 etoposide 처리된 노화 END-MSC에서 senolysis를 유도할 수 없습니다. END-MSC에 대한 에피소드 유발 노화 모델 검증: a 증식 능력, b 세포 크기, c 자가형광 수준 및 d SA{5}}Gal 활성, e Rb의 인산화 수준 및 p21 및 HMGBI 단백질의 발현 수준. f 10-6 ouabain으로 처리한 후 대조군 및 노화 세포의 상대적 세포 생존율(%). 값은 평균±SD입니다. 여러 그룹의 경우 일원 분산 분석이 적용되었습니다.n{9}}, ns는 중요하지 않음,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

마지막으로 Guerrero et al.에 따라 심장 배당체의 세놀리틱 효과가 입증된 또 다른 세포 모델인 에토포사이드 처리 간암 세포 SK-Help에 대한 분석 실험을 재현하기로 결정했습니다. 연구 [25] (그림 9a-e). Etoposide로 처리된 노화 SK-Help는 대조군에 비해 두 제제 모두에 대해 더 높은 민감도를 보여 이 세포 유형에 대한 심장 배당체의 용혈 작용을 입증했습니다(그림 9f 및 보충 그림 S7).

이러한 데이터는 함께 심장 배당체에 의해 유도된 용혈의 선택성이 구체적인 노화 유발 요인보다 세포 특성에 더 의존한다는 것을 증명합니다.

이 문서는 Cellular and Molecular Life Sciences(2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s{6}}x에서 발췌했습니다.