BMAL의 명백한 부재1-생쥐의 의존성 골격근-신장 교차 대화
Jul 19, 2024
키워드: 생체시계 유전자; 신장 기능; 통합 생리학
1. 소개
일주기리듬은 대부분의 생리학적 과정에서 두드러집니다. 이러한 리듬의 제어는 뇌의 시교차상핵에 있는 중앙 시계에 의해 부분적으로 매개되지만, 말초 일주기 시계도 생리학적 기능의 리듬에 영향을 미칩니다[1]. 분자 시계는 전사-번역 피드백 루프로 구성됩니다. 간단히 말해서, 핵심 단백질인 아릴-탄화수소-수용체-핵-변위자 유사 단백질(ARNTL 또는 BMAL1)과 일주기 운동 출력 주기 카푸트(CLOCK)는 Period 및 Cryptochrome 유전자의 전사를 적극적으로 조절합니다. PER(Period) 및 CRY(크립토크롬) 단백질은 BMAL1/CLOCK의 활성에 대한 피드백을 제공하고 이를 억제합니다([2,3]에서 검토됨). 일주기 조절 과정의 중단은 심혈관 및 신장 질환을 포함한 많은 병리와 관련이 있습니다[4,5]. 현재까지, 표적화된 일주기 혼란에 따른 다양한 기관 시스템 간의 혼선은 잘 이해되지 않았습니다. 이 연구는 골격근에서 핵심 시계 단백질 BMAL1의 결실과 이 시계 중단이 신장에 미치는 잠재적인 영향에 초점을 맞추고 있습니다.
골격근 특이적 BMAL1-유도 녹아웃(iMS-BMAL1 KO) 마우스 모델은 이전에 노화에서 나타나는 것과 유사한 특성을 갖는 것으로 설명되었습니다. 이 마우스는 보행 변화, 이동성 감소, 근육 약화 및 포도당 섭취 장애를 나타냅니다 [6,7]. 신장질환은 노화와 동의어로서 나이가 들수록 신장질환의 유병률이 증가한다[8]. iMS-BMAL1 KO 생쥐에서 보고된 또 다른 특징은 힘줄 석회화가 증가했다는 것입니다[6]. 산-염기 균형과 미네랄 항상성에서 신장의 역할은 뼈 건강과 신장 질환을 직접적으로 연관시킵니다. 결과적으로 우리는 iMS-BMAL1 KO 생쥐가 잠재적으로 신장 질환의 모델이 될 수 있다는 가설을 세웠습니다.
이 연구의 목표는 골격근의 시계 장애가 신장 기능 장애로 이어지는지 확인하는 것이었습니다. 골격근에서 BMAL1이 결실되면 신장의 염증 표지자가 증가합니다. 그러나 신장 기능이나 신장 조직학은 iMS-BMAL1 KO에 의해 영향을 받는 것으로 보입니다. 이러한 데이터는 골격근의 시계 중단으로 인해 테스트된 조건에서 신장에 최소한의 변화가 발생함을 시사합니다.
2. 재료 및 방법
동물. 이 연구에 사용된 마우스 모델은 골격근 특이적 Cre-recombinase 마우스(인간 골격 액틴-Cre)와 교배된 floxed exon 8 BMAL1 마우스[9]를 사용하여 생성되었습니다. iMS BMAL1 KO를 생성하기 위해 연구 5주 전(2mg/일, 5일 복강내 주사)에 타목시펜(해바라기씨유의 15% 에탄올로 제조됨)을 주입하여 Cre를 활성화했습니다. 비히클(해바라기씨유 중 15% 에탄올) 주입된 Cre+ 마우스를 대조군으로 사용했습니다. 수컷 처녀 쥐는 17~19주에 연구되었고, 나이든 쥐는 13~14개월에 연구되었습니다. 모든 실험은 국립 보건원(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 의해 수행되었으며 플로리다 대학교 동물 관리 및 사용 위원회와 노스 플로리다/사우스 조지아 재향 군인 관리 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 및 모니터링을 받았습니다. 생쥐는 온도(20~26°C)와 습도가 조절되고 12:12시간 명암 순환실에 보관되었습니다. 달리 명시되지 않는 한, 마우스에게 물과 표준 18% 단백질 설치류 먹이(no. 2918, Harlan Teklad/Envigo, Madison, WI, USA)를 임의로 제공했습니다.
대사 케이지 연구. 젊은 수컷 마우스 집단(대조군 5마리, KS-BMAL1 KO 5마리)을 대사 케이지에 넣어 소변을 수집하고 음식/물 섭취량을 모니터링했습니다[10]. 1% 한천을 함유한 분말 기반 젤 다이어트(Envigo Teklad Custom Diet)를 준비하여 대사 케이지 수집 전체에 사용했습니다. 대조 식단({{10}}.25% NaCl; 0.6% K; Envigo 99131)으로 수집을 시작하기 전에 마우스에게 대사 케이지에 적응하도록 3일을 주었습니다. 대조군 식이를 기록하고 하루를 보낸 후, 쥐를 5일 동안 칼륨 결핍 식이(0.25% NaCl; 0.0001% K; Envigo 99134)로 치료했습니다. 소변 샘플은 낮과 밤이 끝날 때(Zeitgeber 시간 0과 12) 12시간마다 수집되었습니다. 소변량, 음식 섭취량, 수분 섭취량을 기록했습니다. 소변 전해질 농도는 제조업체의 지침에 따라 불꽃 광도계(Cole-Parmer Model 2655- 00, Vernon Hills, IL, USA)를 사용하여 측정되었습니다. 마우스를 안락사시키고, Zeitgeber 시간 6에 조직을 수집했습니다.
신체 구성. 의식이 있는 젊은 수컷 생쥐의 체성분을 칼륨 고갈 식단 투여 전과 투여 후 5일에 정량화했습니다. 측정은 EchoMRI 정량적 자기 공명 체성분 분석기(Echo Medical Systems, Houston, TX, USA)를 사용하여 Zeitgeber 시간 4-6에서 수행되었습니다[11].
위상 발전 프로토콜. 별도의 나이든 수컷 생쥐 코호트를 먹이(no. 2918, Harlan Teklad)와 물에 자유롭게 접근할 수 있는 바퀴가 장착된 우리에 단독으로 사육했습니다. 케이지는 일정한 공기 교환이 가능한 조명 조절 상자(Actimetrics, Wilmette, IL, USA)에 보관되었습니다. 조명 일정은 녹색 LED(~200lux) 광원을 사용하여 12:12시간 명암 주기로 유지되었습니다. 기준선 1주일 후, 암흑 주기가 7시간 앞당겨졌고, 쥐는 이 새로운 12:12시간 명암 주기 일정을 1주일 동안 유지했습니다. 이 과정을 두 번째로 반복하여 14-h 단계 전진을 생성했습니다. 마우스는 Zeitbeger 시간 2에 2-3 그룹으로 안락사되었고 조직은 단계 진행 2주 후 7-10일에 수집되었습니다.
재조합 특이성. Bmal1 재조합의 특이성을 확인하기 위해 우리는 40ng의 골격근 게놈 DNA와 재조합 및 비재조합 대립 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 PCR을 완료했습니다. (fwd 프라이머: ACTGAAGTAACTTTATCAAACTG, rev 프라이머: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, 재조합 프라이머: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). floxed Bmal1 대립유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 431-bp 생성물을 생성합니다. 두 번째 정방향 프라이머 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30가 포함되어 재조합 산물을 검출했는데, 이는 572 bp에서 밴드를 나타냅니다. PCR 반응 생성물은 1.7% 아가로스 겔에서 실행되었으며, 게놈 밴드와 재조합 특이적 밴드의 식별은 이전에 설명한 대로 모든 타목시펜 처리 동물이 조직 특이적 KO임을 확인했습니다[7,12].
면역조직화학. 흡입제 isoflurane으로 마취한 후 오른쪽 신장을 채취하고 즉시 가로로 반으로 자른 후 periodate-lysine-2% paraformaldehyde에 4°C에서 약 48시간 동안 보관했습니다. 그런 다음 유체를 PBS로 변경하여 처리를 준비했습니다. 각 동물의 신장 샘플을 파라핀에 묻고 4- 마이크로미터 두께의 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 올려 놓았습니다. 섹션은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되거나 BMAL1(D2L7G 세포 신호 전달; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, 미국). 단면은 광학 현미경(Nikon DXM1200F 디지털 카메라가 장착된 Nikon E600, Melville, New York, NY, USA)으로 관찰되었습니다. 그룹 식별자각 슬라이드에서 BMAL1 발현을 검사하거나 다음 기준을 사용하여 관형 손상에 대한 슬라이드의 점수를 매겼습니다: 관형 괴사의 징후를 보인 세뇨관의 비율, 브러시 테두리의 부족, 관형 확장 및 단백질 원주 형성.
양 고추냉이-퍼옥시다제-결합 항토끼 2차 항체와 함께 배양하였다. TBS-T로 30분 동안 추가 세척한 후, 영상화를 위해 30초의 노출 시간으로 SignalFire ECL 시약(Cell Signaling Technology)을 사용하여 검출을 수행했습니다. Fiji를 사용하여 밀도 측정을 수행하고 단백질 존재도를 Ponceau 염색으로 표준화했습니다.
다중 면역분석법. 나이든 수컷 생쥐의 신장 절반에서 피질 및 수질 영역을 해부했습니다. 조직은 300 μL(피질) 또는 250 μL(수질)의 완충액(1% 프로테아제-포스파타제 억제제 칵테일(Thermo Scientific) 1% 1M 에틸렌디아민테트라아세트산, 0.1% Tween 20(인산 염))에서 균질화되었습니다. 완충 식염수). 각 샘플의 단백질 농도는 BCA(Pierce, Thermo Scientific)에 의해 결정되었습니다. MILLIPLEX®에서 상업용 다중 면역분석 키트(cat#의 MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K 및 MKI1MAG-94K; EMD MilliporeSigma)를 사용하여 선택된 분석물질에 대해 균질화물을 이중으로 측정했습니다. MILLIPLEX Analyst 소프트웨어를 통한 데이터 분석 기능이 있는 분석기 3.1 xPONENT 시스템(Luminex 200, Austin, TX, USA). 평균 분석 내 CV는 다음과 같습니다.<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations.
신장 미토콘드리아 분리 및 호흡 측정. 단계 진행 후 신선한 신장 피질 조직을 생쥐로부터 해부했습니다. 미토콘드리아는 제조업체의 지침에 따라 조직용 미토콘드리아 분리 키트(#ab110169; Abcam, Waltham, MA, USA)를 사용하여 분리되었습니다. 미토콘드리아 제제의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Thermo Scientific)를 사용하여 결정되었습니다. 분리균의 미토콘드리아 호흡은 호흡 완충액(MiR05; 05)을 포함하는 37°C로 유지되는 이전에 보정된 목판 기록실(Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria)에서 두 번 측정되었습니다.5 mM EGTA, 3mM MgCl2·6H2O, 60mM 락토 바이오닉산, 20mM 타우린, 10mM KH2PO4, 20mM HEPES, 110mM D-자당 및 1 g/L BSA는 본질적으로 무지방, pH 7.1) [13]. 호흡 완충액의 산소 농도는 공기 포화도(~200μM)와 50μM 사이로 유지되었습니다. 산소 소비율(OCR; ρmol O2/s/mg 미토콘드리아 단백질)은 다음 SUIT(기질-언커플러-억제제-적정) 프로토콜을 사용하여 측정되었습니다(괄호 안에 표시된 시약의 농도는 챔버 내에서 최종 농도임). (1) 누출(L ) 전자 전달 시스템(ETS; E)의 복합체 I(CI)을 통한 전자 흐름을 지원하기 위해 NADH 연결 기질인 피루브산(5mM), 말산염(2mM) 및 글루타메이트(10mM)를 사용한 TCA 주기 자극 후 호흡을 평가했습니다. ); (2) 산화적 인산화(OXPHOS; P)를 아데노신 디포스페이트(ADP; 2.5mM)로 자극하고 PCI로 기록했습니다. (3) 숙신산염(10mM)의 첨가는 ETS(PCI+II)의 복합체 I 및 II를 통한 수렴 전자 흐름을 지원합니다. (4) 시토크롬 c(10 μM)를 첨가하여 미토콘드리아 외막 무결성을 테스트함으로써 미토콘드리아 제제의 품질을 평가했습니다. (5) 분리된 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP; 0.1mM 스톡 용액의 0.5μL 단계)을 최대 분리 호흡에 도달할 때까지 단계적으로 적정하고 최대 ETS 용량(ECI+ II); (6) 로테논(0.5 μM)을 첨가하면 ETS의 복합체 I이 억제되고 나머지 OCR은 복합체 II 기질(ECII)이 지원하는 최대 ETS 용량으로 기록되었습니다. (7) 항마이신 A(2.5μM)를 첨가하면 ETS의 복합체 III이 억제되어 복합체 IV로의 모든 전자 수송이 억제되고, 나머지 OCR은 잔류 비미토콘드리아 산소 소비량(ROX)으로 기록되어 이전의 모든 OCR에서 뺍니다. ; (8) 제어되지 않은 자동 산화를 피하기 위해 아스코르브산염(2mM) 존재 하에 N,N,NO,N0 -테트라메틸-p-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(TMPD; 0.5mM; 0.5mM)를 첨가하여 산소 소비를 다시 자극했습니다. 사이토크롬 c를 감소시키기 위한 인공 기질로서 TMPD); (9) TMPD/아스코르베이트 존재 하의 화학적 배경 산화 속도는 복합 IV 억제제 나트륨 아지드(100mM)를 첨가하여 평가하고 이전 플럭스에서 빼서 시토크롬 C 산화효소 활성(ECIV)의 최대 용량을 얻었습니다. 산소 소비량 데이터는 DatLab 대 7.4(Oroboros Instruments)를 사용하여 수집하고 분석했습니다. 플럭스 제어 비율(FCR)은 최대 ETS 용량(ECI+II)을 기준으로 특정 호흡 상태에서의 산소 소비량으로 계산되었습니다.
유세포 분석. 폐 조직을 소화하고 유세포 분석을 이전에 설명한 대로 수행했습니다[14].
통계 분석. 그래픽 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 가능한 경우 반복 측정을 사용하는 양방향 ANOVA를 사용하여 네 그룹 간의 차이를 분석했습니다. Sidak의 다중 비교 테스트를 사용하여 마우스 그룹과 치료 그룹을 비교했습니다. 두 그룹을 비교하기 위해 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 사용했습니다. GraphPad Prism 버전 9.2 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석을 수행했습니다.
통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다.
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