적절한 운동 수준은 쥐의 수술 후 신경가소성과 인지 기능을 향상시키기 위해 장내 세균총 불균형과 발레르산 증가를 약화시킵니다. 3부
May 09, 2024
재료 및 방법
실험 프로토콜 및 절차는 버지니아 대학교 동물 관리 및 사용 위원회(미국 버지니아주 샬로트빌, 프로토콜 번호: 3114)의 승인을 받았습니다.
기억력은 우리가 일상생활에서 자주 사용해야 하는 능력 중 하나입니다. 이는 사람들을 더 똑똑하고, 더 민감하게 만들고, 직업 및 대인 관계에 더 도움이 되도록 만들 수 있습니다. 그래서 많은 사람들이 기억력을 향상시키고 싶어합니다. 실험 프로토콜과 기억 사이에는 관계가 있습니다. 다음에는 이 문제를 살펴보겠습니다.
첫째, 실험 프로토콜은 사람들의 기억력을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험에서 사람들은 실험 작업을 완료하기 위해 특정 단계를 따라야 합니다. 이러한 단계별 활동은 인간의 뇌를 높은 주의력과 집중력 상태로 만들어 뇌 기능의 수행을 촉진할 수 있습니다. 동시에, 실험 중에 몇 가지 실험 데이터와 실험 단계를 기억해야 하며, 이는 또한 뇌의 기억 기능을 발휘하게 됩니다. 이런 식으로 반복적으로 연습하면 기억력이 점차 향상될 것입니다.
둘째, 기억과정에서의 감각경험 역시 실험계획의 설계와 밀접한 관련이 있다. 실험에서 디자이너는 종종 실험 중에 특정한 특정 작업을 설정하므로 참가자는 숫자 기억 및 쓰기, 색상 블록의 기억 및 인식 등과 같은 동일한 작업을 여러 번 반복해야 합니다. 이러한 반복적인 경험은 사람들의 정신력을 강화할 수 있습니다. 주의력과 기억력이 향상되어 사람들이 이 정보를 장기 기억으로 처리하는 것이 더 쉬워집니다.
또한 실험에서는 대표적인 자극물질(이미지, 소리, 냄새 등)을 활용하는 것도 좋은 결과를 낼 수 있다. 이러한 자극은 뇌의 흥분과 기억 과정을 촉발하여 사람들의 기억 능력을 향상시킬 수 있기 때문입니다. 동시에, 이러한 자극은 생활 환경 및 상황과 결합될 수 있으므로 분리 발생을 줄이고 정보를 더 쉽게 기억하고 응집력 있게 만들 수 있습니다.
요약하자면, 실험 계획은 인간의 기억력을 향상시키는 데 중요한 역할을 합니다. 실험을 통해 사람들은 인지 능력을 발휘하고 기억력 수준을 향상시키는 동시에 뇌 기능을 향상시킬 수 있습니다. 그러므로 우리는 기억력 수준을 향상시키고 직업, 인간관계, 건강에 더 큰 기여를 하기 위해 계속해서 새로운 실험 방법을 배우고 더 많은 실험에 참여해야 합니다. 기억력 향상이 필요하다는 것을 알 수 있는데, 시스탄체 데저티콜라에는 항산화, 항염증, 항노화 효과가 있어 뇌의 산화 및 염증 반응을 감소시켜 뇌를 보호할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 신경계의 건강. 또한 Cistanche Deserticola는 신경 세포의 성장과 복구를 촉진하여 신경 네트워크의 연결성과 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이러한 효과는 기억력, 학습 능력, 사고 속도를 향상시키는 데 도움이 될 수 있으며, 인지 기능 장애 및 신경퇴행성 질환의 발병을 예방할 수도 있습니다.
모든 동물 실험은 2011년에 개정된 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드(NIH 간행물 번호 80-23)에 의해 수행되었습니다. 주요 자료의 출처는 보충 자료의 주요 리소스 표에 나열되어 있습니다.
동물 및 실험 설계
체중이 19~22g인 8주령 수컷 C57BL/6 J 마우스를 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 일정한 환경 조건(온도 22~24도, 12시간 명/암 주기, 50 ± 10% 습도) 하에서 유지되는 방에 보관했습니다. 그리고 물.
그들 모두는 실험 전 일주일 동안 적응하도록 허용되었다. 첫 번째 실험에서 그들은 무작위로 다음 그룹으로 배정되었습니다: (1) 대조군(마취 및 수술에 노출되지 않음), (2) 운동 그룹(35~40% 최대 능력으로 운동하지만 마취 및 수술에 노출되지 않음) , (3) 수술 그룹(2시간 동안 이소플루란 마취 하에 15분 동안 좌경동맥 노출) 및 (4) ~ (6) Exe-1+Sur, Exe-m+Sur 및 Exe-h+Sur 그룹: 35세에서 운동 각각 -40%, 55-60%, 75-80%의 최대 용량을 갖고 마취와 수술을 받았습니다.
수술 후 4일(n=20)부터 학습 및 기억 테스트에 동물을 사용하거나 수술 후 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 7일에 생화학적 분석을 위해 뇌를 수확했습니다. (n=9 또는 14), 수술 후 48시간 및 19일 후의 면역형광 염색(n=6) 및 수술 후 19일의 골지 염색(n=8).
수술 후 7일에 SCFA를 측정하기 위해(n=7) 수술 후 3일과 7일에(n=8) 또는 16개의 S 분석을 위해 처음 4개 그룹의 마우스에서 혈액과 대변을 채취했습니다. 4-주간 운동 프로토콜 종료(n=8) 또는 처음 2개 그룹(n=16)의 해당 시간에. 조직 수확을 위한 마우스는 학습 및 기억 테스트에 사용된 다양한 마우스 코호트였습니다. 두 번째 실험에서 마우스는 (1) Transcontrol+Sur 그룹과 (2) Trans-exe+Sur 그룹에 무작위로 할당되었습니다.
첫 번째 그룹의 생쥐는 항생제 치료 후 7일 연속으로 하루에 한 번 위관 영양법으로 대조군의 대변 용액 500ul를, 관장법으로 600ul를 투여하여 수용자의 고유 장내 미생물을 제거했습니다. 두 번째 그룹의 마우스는 항생제 치료 후 연속 7일 동안 하루에 한 번 위관영양으로 운동쥐의 배설물 500ul를 투여받았고, 관장으로 600ul를 투여받았다. 16S 분석을 위해 대변 이식 후 14일 후에 수혜자의 대변을 채취했습니다. 그런 다음 쥐에게 수술을 실시했습니다.
학습 및 기억력은 수술 후 4일째(n=15)부터 평가되었습니다. 뇌는 첫 번째 실험(n{2}})과 마찬가지로 생화학적 연구를 위해 수확되었습니다. 세 번째 실험에서는 마우스를 (1) Transcontrol 그룹과 (2) Trans-control+Sur 그룹에 무작위로 할당했습니다. 두 그룹의 마우스는 대조군 마우스의 대변을 이식 받았습니다. 두 번째 그룹은 대변 이식 후 14일 만에 수술을 받았다. GDNF(n{9}})를 측정하기 위해 수술 2일 후 해마를 수확했습니다. 네 번째 실험에서 마우스를 무작위로 (1) 대조군(이 연구에 설명된 어떠한 실험 조건에도 노출되지 않은 순수 마우스), (2) 7일 동안 항생제를 투여한 항생제 그룹, (3) 대조 마우스의 분변을 이식받은 Trans-대조군.
배변 이식 완료 후 19일(항생제 그룹에서는 항생제 치료 완료 후 26일)에 학습 및 기억력을 평가했습니다(n= 12). 다섯 번째 실험에서 마우스를 무작위로 (1) 대조군, (2) 대조 마우스의 대변을 이식받은 Trans-대조군, (3) 수술 마우스의 이식을 받은 Trans-surgery 집단.
대변 이식은 두 번째 실험에서 설명한 대로 수행되었습니다. 16S 분석을 위해 대변 이식 14일 후 수혜자의 대변을 채취했습니다(n{2}}). 배설물 샘플을 채취한 지 4일 후에 학습 및 기억을 평가했습니다(n=17). 여섯 번째 실험에서 마우스를 무작위로 (1) 수술 및 일반 식염수(NS) 200μl를 복강내 주사한 그룹으로 배정했습니다. (2)운동 + 생리식염수 + 200 µl NS를 복강내 주사한 수술 그룹 4-주 동안 일주일에 한 번 최대 용량의 35-40% 운동 후 수술, (3 ) 운동+발레르산+발레르산(200μl당 200mg/kg)을 주 1회 복강주사로 투여한 수술군4-최대 용량의 35~40%로 운동한 후 수술.
주사는 주중 첫 번째 운동일 오전에 시행하였고, 수술 당일 추가 주사를 1회 시행하였다. 행동(n=13) 및 생화학적(n=10) 결과는 두 번째 실험에서와 같이 평가되었습니다. 일곱 번째 실험에서는 13-주령(체중 23~27g) 수컷 C57BL/ 6마리의 J 마우스를 무작위로 (1) 대조군, (2) 4일 동안 매일 1회 뇌실내 주사로 4μl NS를 투여한 NS 그룹, (3) 4μl의 뇌실내 주사로 4mg/kg을 투여한 발레르산 그룹에 무작위로 배정했습니다. 4일 연속으로 1일 1회 주사한다. 왼쪽 및 오른쪽 뇌실은 교대로 주입되었습니다. 학습 및 기억은 주입 4일 후 평가되었습니다(n= 15).
여덟 번째 실험에서 마우스를 무작위로 (1) 수술 당일부터 4일 동안 연속해서 1일 1회 DMSO를 뇌실내 주사로 투여한 수술 + DMSO 그룹, (2) 수술 + C3ar 길항제(SB290157)를 투여한 C3ar 길항제 그룹으로 배정했습니다. ) 수술일부터 4일 동안 1일 1회 뇌실내 주사로, (3) 35세에 4-주 운동 후 수술일부터 4일 연속으로 1일 1회 DMSO를 뇌실내 주사로 투여한 운동 +DMSO + 수술군 –40% 최대 용량 및(4) 운동 + C3ar 작용제 + C3aragonist를 뇌실내 주사로 1일 1회 투여받은 수술 그룹 4-주 다음 수술일부터 4일 연속 최대 용량의 35~40%로 운동 . 행동 테스트는 위에 명시된 대로 수술 후 4일부터 시작되었습니다(n=15).
아홉 번째 실험에서 마우스를 무작위로 (1) 대조군, (2) 수술군, (3) 수술 시 뇌실내 주사로 GDNF를 투여한 수술 + GDNF 그룹, (4) 수술 + 열 불활성화 GDNF 그룹으로 배정했습니다. 수술 시 뇌실내 주사로 열불활성화 GDNF를 투여받은 그룹. 해마는 ELISA 연구를 위해 수술 후 48시간 후에 수확되었습니다(n=12). 1주일의 적응 후, 체중 30-36 g의 늙은 쥐(18-월령 수컷 C57BL/6 Jmice)를 실험에 사용했습니다. 세 가지 연구. 첫 번째 실험에서 늙은 쥐는 무작위로 (1) 대조군, (2) 쥐가 4-주간 최대 능력의 35~40%로 운동한 운동군, (3) 수술군, (3) 수술군으로 배정되었습니다. (4) 쥐가 수술 전 최대 용량의 35~40% 수준으로 4-주간 운동한 Exe+Sur 그룹. 동물은 수술 후 4일(n=12)부터 학습 및 기억 테스트에 사용되었거나 수술 후 48시간(n=10 또는 12)에 생화학적 분석을 위해 뇌를 수확하고 48시간에 면역형광염색을 위해 뇌를 채취했습니다. 수술 후 19일(n=6), 골지염색의 경우 수술 후 19일(n=8)입니다.
수술 후 7일(n=7)에 SCFA 측정을 위해, 수술 후 3일과 7일(n=8) 또는 마지막에 16개의 S 분석을 위해 4개 그룹의 마우스에서 혈액과 대변을 채취했습니다. 4-주의 운동 프로토콜 또는 처음 2개 그룹(n=16)에서 해당 시간에. 조직 수확을 위한 마우스는 학습 및 기억 테스트에 사용되는 다양한 집단이었습니다. 두 번째 실험에서는 늙은 쥐를 무작위로 (1) Trans-Old Control+Sur 그룹과 (2) Trans-Old Exe+Sur 그룹으로 배정했습니다. 이 쥐들은 대변 이식 후 14일 후에 수술을 실시했습니다. 어린 성체 쥐를 대상으로 한 두 번째 실험. 학습과 기억력은 수술 후 4일째부터 평가되었습니다(n=10).
세 번째 실험에서는 늙은 쥐를 무작위로 (1)수술 + NS 그룹; (2) 운동 + NS + 수술 그룹; (3)운동 + 발레르산 + 수술 그룹. 이 쥐들은 어린 성체 쥐를 대상으로 한 여섯 번째 실험에서 설명한 대로 운동 조건화와 발레르산을 투여받았습니다. 행동 결과는 수술 후 4일(n{4}})부터 테스트되었습니다. 위에 설명된 표본 크기(n)는 각 그룹/조건에 무작위로 배정된 동물의 수를 나타냅니다. 이러한 동물 수는 각 실험의 최소 3회 반복의 합계입니다. 동물은 각 실험에서 컴퓨터 생성 무작위 테이블을 기반으로 그룹에 무작위로 배포되었습니다.
최대 운동능력 결정 및 운동훈련
수술 전, {{0}}주령 및 18-개월령 쥐에게 개별 쥐의 최대 운동 능력을 측정한 후 4-주간 러닝머신 유산소 운동을 실시했습니다. 이 결정은 이전에 설명한 것과 유사한 방식으로 수행되었습니다[47, 48]. 간단히 말해서, 첫날 충격 그리드를 25V, 0.3mA, 2Hz로 초기 설정하고 속도와 경사도를 0으로 10분 동안 유지하면서 생쥐를 트레드밀에 적응시켰습니다. 그런 다음 런닝머신 속도를 10분 동안 50°로 설정된 경사도를 사용하여 10cm/s로 증가시켰습니다. 다음으로 트레드밀 속도와 경사도를 5분 동안 15cm/모래 100으로 증가시켰습니다.
The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50%의 시간이 그리드에 있습니다. 및/또는 (3) 수동으로 자극하려는 동기가 부족합니다. 하나 이상의 기준이 충족되면 마우스를 해당 레인에서 즉시 제거했습니다. 다음 날, 쥐는 다시 탈진 기준 중 하나에 도달할 때까지 평균 최대 속도의 절반(어린 쥐의 경우 35cm/s, 늙은 쥐의 경우 30cm/s)과 100도의 경사로 동일한 런닝머신에서 달렸습니다. 지속적인 운동은 각 마우스의 최대 운동 능력으로 기록되었습니다. 이 두 프로토콜 후에는 운동 후 눈에 띄는 공격적인 행동을 피하기 위해 마우스를 30분 동안 별도로 보관했습니다.
After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >연속 3일 동안의 전체 시간의 3%가 제외됩니다.
운동 그룹과 동일한 실험 세트의 비운동 그룹은 매일 약 30-40분 동안 움직이지 않는 런닝머신에 배치되었습니다. 그들은 움직이지 않는 런닝머신에 머무는 동안 운동 그룹의 쥐가 매일 받는 평균 충격량인 총 5초 동안 10회의 충격을 받았습니다. 실험 세트에 운동 그룹이 없으면 실험 세트의 어떤 쥐도 충격을 받지 않았습니다.
항생제 치료
이식된 미생물군의 집락화를 촉진하기 위해, 수혜자 마우스에게 우리와 다른 연구자들이 설명한 대로 원래의 장내 미생물군을 제거하기 위해 연속 7일 동안 하루에 한 번씩 항생제 치료를 받았습니다[11, 36]. 간단히 말해서, 첫날 위관 영양법으로 10% 황산 마그네슘(200 ul/10 g, 3시간 간격으로 2회)으로 정화한 후 C57BL/6 J 마우스에 아목시실린/클라불란산(200 mg/kg), 메트로니다졸( 7일 연속으로 1일 1회 아침 위 위관영양법으로 200mg/kg) 및 세파졸린(2g/kg)(위관영양법은 300ul, 관장법은 400ul NS), 아목시실린/클라불란산(20mg/kg) ), 메트로니다졸(20mg/kg) 및 세파졸린(300mg/kg)을 매일 200ul NS로 동일한 7일 동안(오후 4시~5시) 복강내 주사합니다. 박테리아 교차 오염을 방지하기 위해 기술자가 환기 후드에서 깨끗한 가운과 장갑을 착용하고 마우스 취급 및 매일 케이지 및 물병 교체를 수행했습니다. 효과를 확인하기 위해 16S 분석을 위해 마지막 처리 후 24시간 후에 테세미스의 대변을 수집했습니다.
대변 이식
대조군 마우스, 4-주 운동 완료 직후 마우스, 수술 후 2~8일 후 마우스로부터 배변 후 30분 이내에 수집된 신선한 배설물 펠릿을 100 mg/ml 멸균 식염수로 희석했습니다. 7개의 모든 배설물 펠렛은 – 각 실험 조건에 따라 10명의 기증자를 혼합하고 식염수에 함께 재현탁시켰습니다. 간략하게 말하면, 배설물을 5분 동안 와류 혼합한 후 70μm 나일론 세포 여과기를 통과시켜 소화되지 않은 음식물 및 입자상 물질을 제거했습니다. 수용자 생쥐는 연속 7일 동안 마지막 항생제 투여 후 24시간부터 아침에 위관 영양법으로 해당 분변 용액 500ul를, 오후에 관장으로 600ul를 받았습니다. 이식된 마우스는 대변 이식 후 2주 동안 유지한 후 16S 분석 및 수술을 위해 대변 수집을 실시했습니다.
마취 및 수술
수술은 이전에 설명한 대로 좌측 경동맥 노출이었습니다[6]. 간단히 말하면, 마우스를 2% isoflurane으로 마취하고 수술 중에 100% 산소가 공급된 안면 마스크를 사용하여 자발 호흡을 유지했습니다. 직장 온도를 모니터링하고 가열 담요를 사용하여 37도를 유지했습니다. 마우스를 isoflurane으로 20분 이상 마취시킨 후 미주신경의 손상 없이 2- cm 길이의 목 정중선 절개 및 1- cm 길이의 총동맥 노출을 통한 연조직 박리를 시행하였다. 그런 다음 상처를 세척하고 4-0 수술용 봉합사를 사용하여 봉합했습니다. 수술 절차는 불임 상태에서 수행되었으며 어린 생쥐와 12분 된 생쥐에서는 약 15분 동안 지속되었습니다. 전신마취의 총 소요시간은 2시간이었습니다. 수술 후 모든 동물에는 3mg/kgbupivacaine을 피하 주사했습니다. 마취 중에는 발가락 꼬집기에 대한 반응이 관찰되지 않았습니다.
뇌실내 주사
위에서 설명한 대로 일부 마우스 그룹에는 뇌실내 주사를 받았습니다. 간략하게, 이들 마우스를 정위 머리 프레임에 엎드린 자세로 배치했습니다. 주사 부위는 다음과 같습니다: 1.00 mm 내외측, -0.3 mm Bregma의 전후 및 -2.5 mm 배측 복부 깊이. 수술 및 GDNF 그룹의 마우스는 1{{의 뇌실내 주사를 받았습니다. 이전 연구[6, 26]에 설명된 대로 3ul 인산염 완충 식염수(PBS)에 20}} ug/kg 재조합 마우스 GDNF를 넣었고, 수술과 열 불활성화 GDNF 그룹의 마우스는 열 변성(1000C에서 5분간) 주사를 받았습니다. ) GDNF 솔루션. 수술 중인 마우스와 C3ar 길항제 그룹은 수술 후 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 5% DMSO를 함유하는 3ul PBS 중 10ug/kg SB290157을 받았습니다. 운동과 C3ar 작용제 및 수술 그룹의 마우스는 SB290157과 동시에 5% DMSO가 포함된 3ul PBS에 1ug/kg의 C3ar 작용제를 투여받았습니다. 여섯 번째 실험의 발레르산 그룹에 속한 마우스는 4일 연속으로 4μl에 4mg/kg의 발레르산을 투여받았습니다.
행동 테스트
학습과 기억은 새로운 물체 인식과 Barnes 미로 테스트를 통해 평가되었습니다. 모든 행동 테스트는 오전 10시00 - 오후 5시00에 방음실에서 실시되었습니다. 학습 및 기억력 테스트에 사용된 마우스는 이러한 테스트의 영향을 피하기 위해 생화학 연구에 사용되지 않았습니다.
새로운 객체 인식 테스트
우리와 다른 사람들이 이전에 설명한 대로[20, 49, 50], 수술 후 4일 동안 습관화를 위해 생쥐를 5분 동안 개방형 챔버에 두었습니다. 테스트는 아래와 같은 방식으로 진행되었습니다. 학습일에 동일한 물체 두 개를 챔버의 인접한 각도에 배치했습니다. 마우스를 대상물 쪽으로 등을 돌리고 챔버에 넣고 5분 동안 자유롭게 챔버를 탐색하도록 허용했습니다. 두 물체에 대한 총 탐색 시간이 다음과 같을 경우 동물은 제거되었습니다.<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.
반스 미로
수술 7일 후, 이전에 설명한 대로 동물을 Barnes 미로에 배치하여 공간 학습 및 기억력을 테스트했습니다[6, 49]. Barnes 미로는 20개의 동일한 간격의 구멍이 있는 원형 플랫폼입니다(SDInstruments, San Diego, CA). 구멍 중 하나는 표적 상자라고 불리는 암실에 연결되었습니다. 테스트는 반스 미로 중앙에 동물을 배치하는 것으로 시작되었습니다. 플랫폼에서 발산되는 혐오성 소음(85dB)과 밝은 빛(200W)을 사용하여 쥐가 이 상자를 찾도록 유도했습니다. 4일 동안 훈련한 후 5일차와 12일차에 참조 기억을 테스트했습니다. 이 기간 동안 테스트는 수행되지 않았습니다. 5일부터 12일까지. 각 시험 동안 대상 상자에 들어가는 지연 시간은 ANYMaze 비디오 추적 시스템(SD Instruments)에 의해 기록되었습니다.
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