Betaine에 의한 루이스 쥐의 실험적 자가면역 포도막염의 감쇠
Jul 20, 2022
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실험적 자가면역 포도막염(EAU)은 자가면역 T 세포의 침윤을 특징으로 하는 인간 자가면역 포도막염의 동물 모델이며, 동시에 전염증성 사이토카인 및 반응성 산소 종의 증가가 있습니다. 이 연구는 베타인이 루이스 쥐에서 EAU의 진행을 조절하는지 여부를 평가하는 것을 목표로 했습니다. EAU는 IRBP(interphotoreceptor retinoid-binding protein) 면역과 연속 9일 동안 비히클 또는 베타인(100 mg/kg)의 경구 투여를 통해 유도되었습니다. 실험 쥐의 희생 당시 비장, 혈액, 망막을 채취하여 T 세포 증식 분석, 혈청학적 분석, 실시간 중합효소연쇄반응 및 면역조직화학에 사용하였다. T 세포 증식 분석은 면역화 후 9일째의 시험관내 분석에서 베타인이 IRBP 항원에 대한 비장 T 세포의 증식에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 혈청학적 분석은 혈청 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 수준이 비히클 처리군에 비해 베타인 처리군에서 증가함을 보여주었다.시스탄체 튜불로사 추출물베타인의 항염증 효과는 EAU가 있는 쥐의 망막에서 혈관 세포 접착 분자 I 및 인터루킨-1을 포함한 염증 유발 관련 분자의 하향 조절에 의해 확인되었습니다. 조직병리학적 소견은 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 I 면역조직화학의 결과와 일치하여 망막 및 모양체의 염증이 비히클 처리군과 비교하여 베타인 처리군에서 유의하게 억제되었음을 추가로 확인하였다. 본 연구의 결과는 베타인이 항산화 및 항염증 활성을 통해 EAU를 완화하는 데 관여함을 시사합니다.
핵심어:항염, 항산화, 베타인, 실험적 자가면역 포도막염, 망막
소개
자가반응 T 세포의 귀소와 단핵구와 같은 염증 세포의 침윤은 EAU에서 포도막염과 망막염을 유발합니다[6]. 망막은 산화 스트레스를 받는 신경교 세포의 활성화로 염증으로 인해 손상됩니다[7].
트리메틸글리신(CH:NO:)이라고도 불리는 베타인은 리시아과의 알칼로이드 및 무독성 천연물질로 대표적인 항산화 물질이다[8]. 베타인은 핵인자 유도 키나아제/I 카파 B 키나아제 및 미토겐 활성화 단백질 키나아제[9], 인터루킨(IL)을 포함한 염증성 사이토카인을 억제하여 인간 심혈관 질환을 통한 핵 인자-kB 관련을 통해 쥐의 노화 관련 염증을 개선합니다.{{ 6}} 및 종양 괴사 인자-a(TNF-a)[10], 덱스트란 설페이트 나트륨 유도 결장 종양 형성[11].cistanche tubulosa 리뷰,또한 베타인은 당뇨병성 망막염이 있는 쥐의 병적 혈관신생/신생혈관을 예방하고[12], 녹내장 동물 모델에서 망막 신경절 세포를 보호하여 시력을 증가시킵니다[13]. 그러나 포도막염에서 베타인의 영향을 뒷받침하는 정확한 기전에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
이 연구에서는 EAU를 완화하는 베타인의 효능을 평가했습니다. 우리는 조직병리학적 검사와 사이토카인 측정을 기반으로 EAU에서 베타인의 항염증 효과를 조사했습니다. 또한, 항산화제로서의 베타인의 특정 기전은 EAU가 있는 쥐에서 평가되었습니다.
재료 및 방법
동물
암수 루이스 쥐(7~9주령; Orient Bio Inc, 경기도, 한국)는 실험실 조건(12-시간 명암 주기, 온도 23±2도)에서 우리 시설에 수용되었습니다. 모든 실험 절차는 제주대학교 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침(허가번호:2020-0012)에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 프로토콜은 실험실 동물의 관리 및 사용(NIH 간행물 번호85-23, 1985, 1996 개정)을 포함하여 국제법 및 NIH 정책을 준수했습니다.
EAU 유도
동일한 부피의 소 광수용체 간 레티노이드 결합 단백질(IRBP)(1 mg/ml; PARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, 코마바이오텍, 대한민국 서울) 및 프로인트 완전 보조제(CFA)로 구성된 혼합 에멀젼 200 ul로 래트를 면역화시켰다. ) 그들의 뒷다리 발바닥에 me mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra(Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA)를 보충했습니다.
실험군
EAU에 대한 베타인(그림 1A)의 효과를 평가하기 위해 4개의 실험군을 다음과 같이 지정했습니다. 정상 대조군(n=8); CFA 대조군(n=8), EAU + 비히클(n=8), EAU + 베타인(n=8). 베타인의 치료 효과를 테스트하기 위한 치료 용량(1 0 mg/kg 체중/일, B2629, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)는 이전 연구를 기반으로 선택되었습니다[14]. 래트를 면역화 후 0일부터 면역화 후 9일까지 베타인으로 경구 처리하였다.
조직 준비
면역화 후 9일째에 CO2 가스 흡입을 통해 깊은 마취하에 래트를 희생시켰다.시스탄체 영국조직병리학적 검사를 위한 조직을 파라핀 왁스에 포매하고 절편화하였다.
마이크로톰(RM 2135; Leica, Nussloch, Germany)으로 5 um 두께로 염색하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색합니다. 혈청 분석 및 실시간 PCR(polymerase chain reaction) 분석을 위해 혈액과 망막을 -80도에 보관하였다.
T 세포 증식 분석
각 그룹의 동물에서 비장 단핵 세포는 우리의 이전 연구에서 설명한 대로 해리되고 부유되었습니다[15]. 그런 다음, 10 ug/ml IRBP(최종 농도)를 웰에 첨가하였다. IRBP로 48시간 자극한 후, 세포를 1 μCi의 'H-메틸 티미딘(비활성 42 Ci/mmol; Amersham, Arlington Heights, IL, USA) 18시간 동안. 그 다음, 세포를 수확하여 티미딘 혼입을 측정하였다.
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혈청학적 분석
샘플링 날짜에 쥐를 희생시키고 심장을 통해 혈액을 수집했습니다. 전혈 샘플을 원심분리기(VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, 대한민국)를 사용하여 혈청과 혈액 세포로 분리했습니다. 혈청 내 SOD(Superoxide dismutase) 활성은 SOD 키트(ab65354; Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 평가되었습니다.
면역조직화학
면역조직화학은 우리의 이전 연구[16]에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자(Ibal)(1:1,000;019-19741, Wako Pure Chemical Industries, Ltd, 오사카, 일본), CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,UK) 및 글루타민 합성효소(GS)(1:5,{14}};MAB302, Chemicon In -ternational, Temecula, CA, USA)를 각각 microg-lia, 대식세포 및 Müller 세포에 대한 마커로 사용했습니다.
실시간 PCR
모든 그룹의 안구 내 총 RNA(그룹당 n=5)는 TRIzol RNA Isolation Reagent(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)로 분리되었으며 cDNA는 CellScript M All-in을 사용하여 준비되었습니다. -One 5X First Standard cDNA Synthesis Master Mix(CellSafe, 경기도, 대한민국). 프라이머 정보는 표 1에 나열되어 있습니다. PCR은 2x SYBR Green(PhileKorea, Seoul, 대한민국)과 다음 프로그램을 사용하는 MIC cycler(BMS, Queensland, Australia)로 수행되었습니다. 55주기의 변성(5초,95) 도 ), 어닐링(20초, 60도 ) 및 확장(10초, 72도 ).
웨스턴 블롯 분석
Western blot analysis는 우리의 이전 연구[16]에서 설명한 것과 동일한 프로토콜에 의해 수행되었습니다.시스탄체 위르쿵Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)(1:1,000;abl19403,abcam,MA,USA) 및 핵인자 적혈구계 관련 인자2(Nrf2)를 포함한 1차 항체 )(1:1,000;sc{15}}, 산타크루즈, 캘리포니아, 미국).
통계 분석
모든 측정은 3회의 독립적인 실험의 평균으로 보고됩니다. 모든 값은 평균의 평균 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. 결과는 분산의 일원 분석을 사용한 후 다중 비교를 위한 Student-Newman-Keuls 사후 테스트를 사용하여 분석되었습니다. p-값<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">
결과
Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 vs.EAU + 차량). 이러한 데이터는 베타인이 IRBP 특이적 T 세포 또는 이들의 자가 반응성에 관여하지 않았음을 나타냅니다.
EAU에서 베타인 상향조절된 혈청 SOD 수준
우리는 SOD를 산화 변형의 마커로 사용하여 혈청의 산화 손상을 평가했습니다. 정상군과 CFA군 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. SOD 활성은 정상 대조군 및 CFA 그룹의 수준과 비교하여 EAU + 비히클 그룹에서 유의하게 감소했습니다. Betaine 처리는 SOD 활성 수준을 정상 대조군 및 CFA 그룹의 수준으로 유의하게 회복시켰다(Fig. 2). 이 결과는 베타인 처리가 EAU가 있는 쥐의 산화 스트레스를 억제했음을 나타냅니다.
Betaine은 EAU로 유도된 쥐의 모양체와 망막에서 Ibal 양성 세포의 침윤을 감소시켰습니다.
모양체는 풍부한 혈관으로 인해 주요 염증 세포 침윤 부위입니다[18]. 정상군과 CFA군에서는 모양체에서 소수의 원형 세포만이 검출된 반면(도 3A, 3B), EAU 유도군에서는 일부 원형 세포의 침윤이 확인되었다(도 3C의 화살표 ,3D). 정상(그림 3E) 및 CFA(그림 3F) 그룹은 Ibal 면역반응성에서 관찰된 것과 유사한 결과를 일관되게 표시했습니다. Ibal-양성 면역반응성은 EAU + 비히클 및 EAU + 베타인 그룹에서 증가했습니다(도 3G, 3H의 화살촉). 그러나 Ibal 양성 세포의 수는 EAU + 비히클 그룹에 비해 EAU + Betaine 그룹에서 유의하게 감소했습니다(그림 3I). 또한 섬모체에서 염증 세포 침윤의 정확한 위치를 평가하기 위한 추가 접근 방식으로 EDI의 국소화를 분석했습니다. ED{16}}양성 세포는 정상(그림 3G) 및 CFA(그림 3K)에서 거의 검출되지 않았습니다. )여러 떼. 대조적으로, EAU+Vehicle 및 EAU+베타인 그룹에서 수많은 ED{19}}양성 세포가 감지되었습니다(그림 3L,3M의 이중 화살촉).감귤류 바이오플라보노이드ED{1}}양성 세포 수에 대한 반정량적 분석은 베타인 처리가 EAU로 유도된 쥐의 모양체에서 염증 세포의 침윤을 억제한다는 것을 확인했습니다.
다음으로 망막의 조직병리학적 변화를 조사하였다(Fig. 4). EAU가 있는 망막에서는 몇 개의 염증 세포가 감지되었지만 정상 및 CFA 쥐 망막에서는 감지되지 않았습니다(그림 4A~4D). 병변은 EAU의 중증도에 따라 조직병리학적으로 점수를 매겼으며[17], 망막 염증의 완화를 나타내었다(그림 4E). 망막 염증을 나타내는 미세아교세포 및 뮐러 세포 활성화는 각각 전체적(도 4F~4I) 및 GS 면역반응성(도 4K~4N)에 기초하여 확인되었다. 미세아교세포에서 Ibal의 국소화는 정상 및 CFA 그룹에서 매우 드물었습니다(각각 그림 4F,4G의 화살촉). 미세아교세포의 활성화는 베타인 처리에 의해 EAU 쥐(그림 4H의 화살촉)에서 억제되었다(그림 4I, 4J). GS-양성 면역반응성 결과는 망막의 전체 면역반응성 결과와 유사하였다(Fig.4K~4N). EAU + 비히클 그룹에서 활성화된 뮐러 세포는 더 낮은 GS-면역반응성 수준을 가졌다(도 40).
Betaine은 EAU에서 접착 분자 및 전염증 매개체를 억제했습니다.
다음으로 Real-Time PCR을 사용하여 접착 분자 발현을 조사했습니다(그림 5A). EAU + Betaine 그룹에서 혈관 세포 부착 분자 1(VCAM1)mRNA 수준의 급격한 감소가 관찰되었습니다(p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">
베타인은 항산화 효소 카탈라아제(CAT) 및 SODinEAU를 상향 조절했습니다.
혈청 내 산화적 손상 수준에 대한 연구를 통해 CAT, SOD1, SOD2 및 SOD3을 포함한 항산화 효소의 항산화 반응 상태를 조사하게 되었습니다(그림 5C). 우리는 EAU 플러스 비히클 그룹과 비교하여 EAU 플러스 베타인 그룹의 안구에서 CAT, SOD1, SOD2 및 SOD3의 유의하게 상향 조절된 발현 수준을 관찰했습니다.
Betaine은 Keapl-Nrf2 경로를 활성화했습니다.
베타인의 항산화 효과를 뒷받침하기 위해 Keapl-Nrf2 경로를 조사하였다(Fig. 6). Keapl의 단백질 수준(0.75±0.05 배 변화,p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">
정상적인 통제와 비교. 반면에 Keapl과 Nrf2는 EAU와 Vehide 그룹에 비해 1.46±0.00 폴드 변화 또는 1.13±0.34 폴드 변화를 보였습니다(p<0.01 and=""><0.001,>
논의
이것은 베타인이 항염증 및 항산화 효과를 통해 EAU 발병의 진행을 완화하지만 T 세포 증식을 억제하지는 않는다는 것을 보고한 첫 번째 연구입니다(그림 7의 개략도).
자가면역 질환의 원형인 EAU를 사용하여 입증된 자가면역 질환에서 베타인의 조절 효과는 베타인에 의한 산화 스트레스 및 전염증 매개체의 감소로 인한 것으로 생각되지만 T 세포 증식은 감소하지 않는 것으로 생각됩니다[19]. 유사하게, 본 연구는 베타인이 EAU 모델의 배양 상청액에서 T 세포 증식 및 사이토카인 프로파일에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌으며, 이는 베타인이 EAU에서 자가면역 T 세포 증식의 면역 반응에 영향을 미치지 않음을 시사한다. 포도막은 EAU의 표적 기관입니다. 포도막과 망막은 림프관이 없는 면역학적으로 고립된 기관이다[20]. EAU의 자가면역 T 세포는 모양체 동맥과 안동맥을 통해 침입합니다[21]. 산화 스트레스는 염증 반응의 진행에 중요한 신호이며 증가된 활성 산소 종은 내피 기능 장애 및 조직 손상을 유발합니다[22]. 교란된 내피 세포는 염증 세포 및 염증 분자의 통과를 촉진시킨다[22]. 포도막의 염증 매개체와 세포는 망막 색소 상피 세포에서 촉발되어 간상 세포와 원추 세포와 색소 상피 세포 사이의 접합을 방해하여 망막 박리를 유발합니다[23]. 모양체는 안구 염증의 진입 부위입니다. 전형적인 망막 염증은 혈액-망막 장벽의 붕괴로 인해 상주하는 미세아교세포의 활성화와 염증 세포의 침윤에 관여한다[24]. 뇌종양[25], 축삭절제술[26], 바이러스 감염[27]을 포함한 신경병리학적 조건하에서 활성화된 대식세포와 미세아교세포는 Ibal에 의해 구별되었다. 또한 활성화된 상주 미세아교세포는 망막 퇴행성 질환에서 발생하는 병리학적 변화에 관여하고 질환 진행을 악화시키는 염증 매개체를 방출합니다[28]. 이러한 결과는 베타인이 EAU의 주요 표적인 포도막 및 모양체에서 항염증 효과를 발휘하고 혈청의 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 시사한다. 그러나 정확한 메커니즘은 아직 연구해야 합니다.
활성화된 미세아교세포는 망막 퇴행성 질환에서 전염증성 사이토카인의 주요 공급원입니다[29]. IL과 TNF를 포함한 전염증성 사이토카인은 안구 염증[30] 및 망막염[6,29]과 밀접한 관련이 있습니다. 미세아교세포 외에도 뮐러 세포는 망막에서 발생하는 모든 병리학적 사건에서 활성화됩니다[31]. 활성화된 뮐러 세포는 염증 관련 분자를 합성 및 방출하여 망막의 신경염증 효과에 관여합니다[31]. 우리는 베타인이 미세아교세포와 뮐러 세포의 활성화를 억제함으로써 EAU로 유도된 쥐의 염증 반응을 완화한다고 가정합니다. VCAM1의 상향 조절은 염증 세포의 침윤에 크게 관련되어 있습니다[32]. VCAM1은 후기 항원과의 누화를 통해 CD4 Tlym-phagocytes로 촉진됩니다{14}}[3]. 또한, 염증[34]은 뮐러 세포, 성상교세포 및 빛으로 손상된 망막의 망막 색소 상피에서 검출되었으며[35] 손상된 원추 세포[36]가 있는 Nrl'mouse 망막에서 상당히 다양한 수준을 나타냅니다. Serpina3n은 EAU에서 증가합니다. 심한 망막 염증이 있는 쥐는 베타인 처리된 EAU 그룹에서 유의하게 감소했습니다. 쥐의 Serpina3n이 인간 Serpina3의 오르토로그이기 때문에 신경염을 동반한 정신분열증[34]에 대해서도 유사한 발견이 보고되었습니다[37]. 또한 고과당으로 인한 망막 손상에서 IL{27}}의 증가가 관찰되었습니다[38]. 우리는 베타인의 항염증 효과가 EAU로 유도된 쥐에서 VCAM1, Serpina3n 및 IL{34}}의 하향 조절과 관련이 있다고 가정합니다. Keep-Nrf2 경로는 산화 스트레스를 모니터링하는 데 사용됩니다[39]. 베타인은 아세트아미노펜으로 유발된 급성 간 손상 모델에서 Keapl-Nrf2 경로와 관련된 항산화 분자로 알려져 있었습니다[40]. 또한 3H-1,2-dithiole{47}}thione 처리 후 간 유전자 발현 프로파일링을 수행하여 발암물질의 해독을 강화하고 신생물을 보호하는 역할을 합니다[4]. 이 프로파일링의 결과 Keap{49}}Nrf2는 AF033381을 포함한 nrf{51}의존성 3H-1,{54}}디티올{55}}티온 유도성 유전자를 다음과 같이 조절함을 보여주었습니다. betaine homocysteine methyl transferase가 증가하여 해독과 항산화에 관여한다[41]. EAU의 염증 반응은 T 세포 및 대식세포와 같은 염증 세포의 침윤[42]과 특히 초기 단계의 광수용체 미토콘드리아에서 산화 스트레스의 생성에 의해 유도되었다[43]. 이러한 결과에 따르면 베타인 치료는 산화 스트레스 조절의 핵심 경로인 Keap{63}}Nrf2 경로를 조절하여 EAU로 인한 조직 손상을 완화할 수 있는 후보였습니다.
베타인의 항산화 효과는 라디칼 유발 손상 모델에서 널리 평가되었습니다[44]. 레보도파에 의해 유발된 산화 손상 뇌에서 베타인은 대표적인 항산화 효소인 CAT 및 SOD 수준까지 향상되었습니다[4]. SOD1, SOD2, SOD3는 서로 다른 기전에 의해 활성화되며 각각 세포질, 미토콘드리아, 세포외 기질에 국한된다[45]. 베타인은 항산화 분자로서 산화 손상을 줄이는 데 관여합니다[46]. 감소된 산화 스트레스는 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증을 포함한 많은 질병에서 Ibal-양성 대식세포/미세아교세포가 나타내는 염증을 해결하는 것으로 확장되었습니다[47]. 베타인 처리는 EAU + 비히클 그룹의 것과 비교하여 산화 스트레스 마커의 mRNA 수준으로 상향조절되었다. 이 결과는 베타인 처리가 랫트 EAU 모델의 면역 기관에서 T 세포 증식을 방해하지 않으면서 순환계의 산화 스트레스를 감소시켰음을 의미한다.
종합적으로, 본 연구는 베타인이 항산화 및 항염 메커니즘을 통해 EAU로 유도된 쥐의 망막 및 모양체에서 염증을 완화할 수 있음을 시사합니다.
이 기사는 https://doi.org/10.5607/en21011에서 발췌했습니다.
