당뇨병성 신증 효과에 대한 시스탄체 튜불로사의 페닐에타노이드 배당체의 효과를 탐색하기 위한 네트워크 약리학 및 동물 실험을 기반으로 합니다.

개요: 목표시스탄체페닐에탄올 배당체(CPhG) 켜짐당뇨병 신장 질환(DKD) 네트워크 약리학 및 동물 실험을 기반으로 합니다. 방법 분석에는 UHPLC-QE-MS 방법이 사용되었습니다.CPhG의 화학 성분. TCMSP 및 Swiss Target Prediction 데이터베이스는 핵심 구성 요소를 선별하는 데 사용되었습니다. OMIM 및 GeneCards 데이터베이스는 DKD 관련 목표를 얻는 데 사용되었습니다. 공통 타겟을 얻은 후 STRING 웹사이트를 사용하여 단백질 상호작용 네트워크를 구축했습니다. DAVID 데이터베이스는 GO, KEGG 경로 분석에 사용되었으며 Cytoscape 소프트웨어는 "CPhGs 핵심 구성 요소-표적-경로" 네트워크를 구축하는 데 사용되었습니다. 10마리의 쥐를 무작위로 정상군으로 선정하고 나머지 쥐들에게는 고당, 고지방 사료를 먹인 후 STZ를 단회 복강내 주사하여 DKD 모델을 구축하였다. 모델군, dapagliflozin (1 mg/kg)군, CPhGs 고용량, 중용량, 저용량(500, 25{{4{48}}}}, 125)으로 구분하였습니다. mg/kg) 그룹, 각 그룹당 10마리의 동물, 6주 동안 약물 개입, 일반적인 상태를 관찰하고 매주 체중을 측정하고 혈당을 테스트했습니다. 마지막 투여 후 24시간 동안 소변을 수집했습니다. 24-시간 총 소변 단백질(24-UTP)을 검출합니다. 복부대동맥에서 혈액을 채취하여 희생시킨 후 혈청을 분리하여 요소질소(BUN), 요산(UA), 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 고혈압을 검출합니다. 신장 조직의 병리학적 변화를 관찰하기 위해 고밀도 지질단백질(HDL) 및 저밀도 지질단백질(LDL) 수준, HE 염색 및 Masson 염색을 사용하였고, 혈청 IL-1 , IL{{17} 검출을 위해 ELISA를 사용했습니다. }, TNF- 수준, 웨스턴 블롯을 사용하여 신장 조직을 검출했습니다. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3 단백질 발현. 결과 UHPLC-QE-MS 기술을 통해 총 699개의 성분이 검출되었습니다. 스크리닝을 통해 CPhG의 핵심 구성요소 16개와 관련 타겟 323개를 획득했습니다. CPhG와 DKD는 99개의 목표를 공유했습니다. 주요 표적은 STAT3, SRC, EGFR 등이었습니다. KEGG 경로 분석에서는 151개 신호 경로를 스크리닝하여 IL{33}} 신호 경로, PI3K/Akt 신호 경로, TNF 신호 경로 등이 주요 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다. CPhG에 의한 DKD 치료. CPhG는 DKD 쥐의 체중 증가(P<0.01), 물 소비 감소(P<0.01), 포도당 및 지질 대사 조절, 24-UTP 및 BUN 수준 감소(P<0.01), 신장 조직 개선에 효과가 있습니다. . 병리학적 손상은 신장 조직에서 p-JAK2/JAK2 및 p-STAT3/STAT3의 단백질 발현을 감소시켰고(P<0.01), SOCS3의 단백질 발현을 증가시켰다(P<0.01). 결론 CPhG는 아마도 JAK2/를 억제함으로써 다중 구성 요소, 다중 표적 및 다중 경로를 통해 DKD에 개입합니다.

STAT3 신호 전달 경로.

키워드: 시스탄체 페닐에탄올 배당체; 당뇨병성 신장병; UHPLC-QE-MS; 네트워크 약리학; 동물실험; JAK2 /STAT3 신호 전달 경로

CISTANCHE가 신장 환자를 치료하는 데 얼마나 걸리나요?

당뇨병성 신장 질환(DKD)는 당뇨병의 가장 중요한 미세혈관 합병증 중 하나로 다음을 초래하는 주요 요인일 뿐만 아니라만성 신장 질환뿐만 아니라 전 세계적으로 말기 신장 질환(ESRD)의 주요 원인이기도 합니다. 이유 [1-2]. DKD의 임상적 치료는 주로 혈당, 혈압, 혈중 지질을 조절하고, 두 번째로 신장 기능을 보호하고, 신독성 약물의 사용을 지양하며, 생활 습관을 개선하는 것입니다[3-4]. 그러나 DKD의 복잡한 발병기전과 구체적인 중재 대상의 부족으로 인해 현재 치료 옵션에는 한계가 있으며 효과적이지 않습니다. 말기 DKD의 발병률은 여전히 ​​증가하고 있습니다. 그러므로 효과적인 천연약물을 찾는 것은 매우 중요한 의미를 지닌다.

시스탄체 데세르티콜라 Y． 씨． 엄마 또는시스탄체 C.말린 다육질의 줄기는Cistanche tubeulosa(Schenk) 와이트비늘잎이 있는 것은 [5] "신농의 약초"에 처음으로 기록되었으며 최고 등급으로 기록되었습니다. 그들은 "사막 인삼"으로 알려져 있습니다 [6]. 달콤하고 짠맛이 있고 따뜻합니다. , 신장과 대장 경락으로 돌아가 신장양을 보하고 정혈을 보하며 장을 촉촉하게 하고 하제의 효능이 있다. 연구에 따르면 페닐에타노이드 배당체(CPhG)는 주요 활성 성분 중 하나이며 개발을 담당하는 것으로 나타났습니다.

약리학적 효과를 발휘하기 위한 물질적 기초 시스탄체 추출물은 항당뇨병 [7-8], 항간암 [9], 신장 보호 [10-11], 신경 보호 [12-13] 및 기타 약리 효과가 있지만 현재 CPhGs는 DKD 치료에는 효과적이지 않습니다. 그 효과와 메커니즘은 불분명합니다.

본 연구에서는 네트워크 약리학 및 분자 도킹 방법[14]을 사용하여 CPhG를 연구 대상으로 삼아 CPhG의 주요 활성 성분과 DKD 치료를 위한 잠재적 표적을 예측 및 분석한 후 STZ(스트렙토조신) 유발 고농도 복합제를 확립했습니다. 지질 사료를 먹인 DKD 쥐 모델을 생체 내 연구의 대상으로 사용하여 관련 치료법의 임상 확장 및 적용과 작용 메커니즘에 대한 추가 연구에 대한 참고 자료를 제공했습니다.

재료 1개

1.1 동물

70-SPF 수준, 체중(240±20)g의 생후 수컷 SD 쥐를 신장 의과대학 동물 실험 센터에서 구입했습니다. [실험 동물 사용 허가 번호 SYXK(신규) {{4} }], 에서 동물을 온도 (22±2)도, 상대습도 50% 내지 70%, 12시간/12시간 교대로 명암 주기에서 1주 동안 적응적으로 사육하였다. 이 실험은 신장 의과대학 의료 실험 동물 센터의 동물 윤리 위원회(윤리 번호 IACUC-20220127-19)의 승인을 받았습니다.

1.2 시약 및 약물

CPhGs (batch number 201610, purity >80%)는 Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd.에서 제공했습니다. Dapagliflozin(배치 번호 NB2248)은 영국 AstraZeneca에서 구입했습니다. 고당 및 고지방 사료(카탈로그 번호 Boaigang-B1135DM) 및 STZ(배치 번호 2021110307)는 Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다. 소변 미세알부민(배치 번호 20220611), 요소질소(배치 번호 20220626), 요산(배치 번호 20220613), 총 콜레스테롤(배치 번호 20220615), 중성지방(배치 번호 20220616), 고밀도 지단백질(배치 번호 20220614) ) 및 저밀도 지질단백질(배치 번호 20220615)은 Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute에서 구입했습니다. 인터루킨-6(IL-6, 로트 번호 JL20896), 인터루킨-1(IL-1, 로트 번호 JL20884) 및 종양 괴사 인자-(TNF-, 로트 번호 13202 )는 Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다. JAK2 토끼 다클론 항체(로트 번호 22v9316), p-JAK2 토끼 다클론 항체(로트 번호 78g9360), STAT3 토끼 다클론 항체(로트 번호 15x8824), p-STAT3 토끼 다클론 항체(로트 번호 74m1478), SOCS3 토끼 다클론 항체(로트 번호 78g9360) 번호 31d4841)은 모두 Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.에서 구입했습니다. HRP 표지 염소 항토끼 IgG 다클론 항체(배치 번호 20000758)는 우한 미타카 바이오테크놀로지 주식회사(Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.)에서 구입했습니다. -액틴 토끼 단일클론 항체(배치 번호 AC230205001), RIPA 용해 완충액(배치 번호 20220416), BCA 단백질 농도 측정 키트(배치 번호 20230401)는 Beijing Solebao Technology Co., Ltd.에서 구입했습니다.

1. 3가지 악기

Vanquish 초고성능 액체 크로마토그래피, Q Exactive Focus 고분해능 질량 분석기, Heraeus Fresco17 원심분리기, FC 자동 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher Scientific, USA); JXFSTPRP-24 분쇄기(Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV 순수 수량계(독일 Merck Millipore Company); ACQUITY UPLC BEH C18 컬럼(1.7μm, 2.1mm x 100mm)(American Waters Company); Accu Chek Performa 혈당 측정기(Swiss Roche Company); CM1850UV 저온 유지 장치, DM300 정립형광현미경(Leica Company, Germany); GL-88B 와류 측정기(Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); 전자 분석 저울(Bio-Rad Company, 미국).

2가지 방법

2. 1 UHPLC-QE-MS 분석

2.1.1 시험용액의 조제

100mg CPhG의 무게를 측정하고 500μL의 80% 메탄올을 추가하고 30초 동안 와동시킨 다음 얼음물 욕조에서 1시간 동안 초음파 처리하고 -40도에서 1시간 동안 방치하고 4도에서 원심분리합니다. , 12 000 r/min 동안 15분, 상층액을 흡인합니다. 0. 22μm 미세다공성 막을 통해 여과하고 -80도 냉장고에 보관합니다.

2.1.2 크로마토그래피 조건

ACQUITY UPLC BEH C18 컬럼(1. 7 μm, 2. 1 mm × 100 mm); 이동상 아세토니트릴(A) -1% 포름산(B), 구배 용리(0 ~ 11분, 15% ~ 75% A; 11 ~ 12분, 75% ~ 98% A; 12 ~ 14분, 98% A; 14~14.1분, 98%~15% A); 체적유량 0 . 5mL/분; 컬럼 온도 35도; 주입량 5μL.

2.1.3 질량 분석 조건

전체 스캔 ddMS2 전체 스캔 모드; 외장 가스 체적 유량 45arb; 보조 가스 체적 유량 15arb; 모세관 온도 400도 ; NCE 모드의 충돌 에너지 15% ~ 30% ~ 45% 주기; 분무 전압 ± 4.0 kV.

2.2 네트워크 약리학 연구

2. 2. 1 CPhG

성분 표적 스크리닝: UHPLC-QE-MS로 분석한 화학 성분을 상대 함량에 따라 분류하고, 아직 화학 구조가 밝혀지지 않은 성분은 삭제합니다. 선별된 성분의 InChIKey 일련번호를 TCMSP 데이터베이스에 입력하여 각 성분의 약동학적 매개변수를 얻습니다. 경구 생체이용률(OB) > 30%, 약물 유사성(DL) > 0.18이라는 조건을 바탕으로 해당 요건을 충족하는 후보자를 심사하게 된다. 스위스 표적 예측 데이터베이스에 각 구성 요소의 SMILES 번호를 입력하여 표적을 예측하고 CPhGs 화학 성분 표적을 얻습니다.

2. 2. 2DKD

질병 표적 스크리닝 OMIM, GeneCards 및 NCBI 데이터베이스에서 질병 표적을 검색하려면 검색어로 "당뇨병성 신장병"을 사용하십시오.

2. 2. 3 구성요소-표적-질병 네트워크 구축

R 소프트웨어 매핑을 통해 CPhGs 구성 요소 및 질병의 교차 목표를 얻었으며 Cytoscape 3.7.2 소프트웨어를 사용하여 분석 플러그인이 핵심 목표를 감지하는 구성 요소-표적 네트워크 시스템을 구축했습니다.

2. 2. 4 단백질-단백질 상호작용 네트워크(PPI) 구축

구성 요소와 질병의 교차 대상 단백질을 STRING 데이터베이스로 가져오고, 단백질-단백질 상호 작용 네트워크(PPI)를 구축하고, 네트워크에서 연결된 노드가 없는 단백질을 삭제하고, 가장 낮은 단백질 상호 작용 점수의 신뢰 수준을 {{1}로 설정합니다. }.700. PPI 네트워크를 구축하고, TSV 형식 결과를 다운로드하고, 이를 Cytoscape 3.7.2 소프트웨어로 가져오고, 분석 플러그인을 사용하여 추가 스크린 코어 타겟을 사용합니다.

2. 2. 5 GO, KEGG 분석

DAVID 데이터베이스의 Functional Annotation 섹션을 사용하여 구성 질병의 교차 대상에 대한 농축 분석을 수행합니다. 먼저 분석 매개변수를 설정하고 Gene List 상자에 교차 대상을 입력하고 대상 식별자로official-gene-symbol을 선택하고 데이터 유형(List Type)으로 Gene List를 선택한 다음 "Homo Sapiens(Species)"를 선택합니다. 대상 소스(종). Race)", 분석 매개변수를 확인한 후 분석을 시작하고 GO 및 KEGG 분석 결과를 얻은 다음 ImageGP 온라인 그리기 플랫폼을 사용하여 KEGG 및 GO 분석 결과의 버블 다이어그램을 그립니다. Cytoscape 3.7.2 소프트웨어는 구성 요소를 구성합니다. -목표 경로 네트워크 사진.

2. 2. 6 분자 도킹

먼저 PubChem 데이터베이스에서 활성 성분의 3D 구조도를 PubChem 데이터베이스에서 다운로드한 후, 교차 대상의 3D 구조도를 미국 글로벌 단백질 데이터베이스(PDB)에서 PDB 형식으로 다운로드한 후 최종적으로 CB-Dock에 업로드합니다. 분자 도킹을 위한 웹사이트. 지배적인 도킹 형태를 선별하고 Pymol을 사용하여 시각화합니다.

2.3 동물 실험

2.3.1 모델링, 그룹화 및 약물 투여

10마리의 쥐를 무작위로 정상군으로 선정하여 일반사료를 급여하였고, 나머지 쥐들에게는 고당, 고지방 사료를 급여하였다. 6주 후에 30mg/kg STZ(pH 4.5 구연산나트륨 완충액에 용해된 0.1mmol/L STZ)를 1회 복강내 주사하였고, 72시간 후에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취했습니다. 공복혈당(FBG)을 검출하기 위해. FBG가 16.7mmol/L 이상이면 당뇨병 모델이 성공적으로 확립된 것입니다[15]. 계속 2주간 고당, 고지방 사료를 먹였습니다. DKD 모델링은 소변 포도당 양성 및 24-시간 총 소변 단백질(24-UTP)이 20mg 이상인 것을 기준으로 성공적인 것으로 결정되었습니다. 그 중 모델링 과정에서 3명이 사망했고, 7명이 실패했습니다. , 총 50개가 성공했습니다. 성공적으로 모델링된 쥐를 무작위로 모델군, dapagliflozin군(1 mg/kg), CPhGs 고, 중, 저용량(500, 250, 125 mg/kg)군으로 나누었습니다. 각 투여군은 위내 투여하였다. 정상군과 모델군의 쥐에게는 해당 약물을 투여하였고, 정상군과 모델군의 쥐에게는 총 6주 동안 1일 1회 동량의 생리식염수를 위관 영양법으로 투여하였다. 투여기간 동안 정상군을 제외한 각 군의 쥐에게는 고지방 사료를 계속 공급하였다.

2.3.2 생화학적 지표 검출

CPhG 개입 6주 후, 쥐로부터 24-시간의 소변을 수집하고 24-시간의 총 소변 단백질(24-UTP)을 측정했습니다. FBG 수준을 검출하기 위해 공복 꼬리 정맥에서 혈액을 수집했습니다. 복부 대동맥으로부터 혈액을 4도, 1500r/분으로 수집했습니다. 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 혈청 요소질소를 검출합니다.

BUN), 요산(UA), 총 콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 고밀도 지질단백질(HDL), 저밀도 지질단백질(저밀도 지질단백질 LDL) 수치.

2.3.3 신장 조직의 병리학적 형태 관찰

쥐를 펜토바르비탈나트륨으로 마취시킨 후 희생시켰다. 신장을 벗겨내고 무게를 측정한 후 4% 파라포름알데히드로 고정하고 탈수하고 투명하게 하고 왁스에 담근 다음 헤마톡실린-에오신(HE) 염색을 위해 절개했습니다.

Masson 염색 후 조직 형태를 현미경으로 관찰하고 Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어를 사용하여 적분 광학 밀도를 분석하고 상대적인 콜라겐 섬유 면적을 정량화했습니다.

2. 3. 4 엘리사

이 방법은 쥐의 혈청 염증 인자 수준을 검출하는 데 사용되었습니다. IL-6, IL-1 및 TNF- 수준은 키트 지침에 따라 검출되었습니다.

2. 3. 5 관련 단백질 발현을 검출하기 위한 Western blot 방법

쥐의 신장조직을 채취하고 RIPA 용해물을 첨가하여 전체 단백질을 추출한 후 BCA법으로 농도를 측정하였다.

도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 PVDF 멤브레인으로 옮기고, 블로킹 후 JAK2(1:2000), p-JAK2(1:1000), STAT3(1:2000), p-STAT3(1:2000), SOCS3(1:2000), -액틴(1:2000) 항체, 4도에서 밤새 배양하고 HRP 표지 IgG 2차 항체(1:5000)를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양하고 전자발광 키트로 현상하고 노출 Image J 소프트웨어를 사용하여 단백질 젤 이미저로

조각의 정량적 분석. -actin을 내부 기준으로 사용하여 대상 밴드의 회색 값과 내부 기준 밴드의 비율이 상대적인 단백질 발현입니다.

2.4 통계분석

데이터는 SPSS 25.0 소프트웨어로 처리되었으며, 데이터는 (x±s)로 표현되었다. 그룹 간 비교에는 일원 분산 분석이 사용되었습니다. 피<0.05 indicates that the difference is statistically significant.