태국 실크 고치의 아미노산 프로필 및 생리 활성 화합물의 물 추출의 영향 2부 변화
Mar 19, 2022
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2.8. 상관관계
상관 분석(Pearson 테스트)을 사용하여 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH라디칼 소거 활성, ABTS 플러스, FRAP 분석, 항아밀라아제에 대한 값 간에(상관 계수,r로) 비교했습니다. Nangsew 및 Eri 균주에서 SPE의 , 항- -글루코시다제 및 항당화(표 5 및 6). 연구에서 얻은 각 매개변수는 TPC, TFC, DPPH, ABTS, FRAP 항{6}}아밀라아제, 항{7}}글루코시다아제 및 항당화 사이에 강한 양의 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 이는 실크 추출물에 존재하는 생리활성 화합물이 다양한 자유 라디칼과 항아밀라아제, 항글루코시다아제 및 항당화효소를 제거할 수 있기 때문일 수 있습니다. 우리의 연구 결과는 또한 두 균주에 대한 결과 사이에 매우 중요한 선형 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 총 페놀 함량과 FRAP 분석 사이에 강한 양의 상관관계를 발견한 Benzie와 Stezo[29]의 결과와 일치했습니다. Kubola[30]가 보고한 바와 같이 고야에서 각각 TPC와 DPPH(R{13}}.711) 및 FRAP(R{15}}.948) 간에 유사한 결과가 발견되었습니다. Kumar et al.[31] 다양한 종류의 Lantana Camara 잎에서 항산화 활성과 총 페놀에 대한 평가를 수행했습니다. 추출물은 페놀 함량과 DPPH, FRAP 및 ABTS 소거 활성 사이에 강한 상관 관계를 보였다. 총 페놀 함량과 ABTS 소거 분석 사이에 가장 높은 상관관계(r=0.998, R{21}}.997)가 발견되었습니다. 또한 ABTS와 TPC(R{23}}.885) 및 DPPH(R2=0.999) 사이의 양의 상관관계는 각각 Gynura procumbens 잎에서 Kaewseejan et al. [32].
생물학적 특성과 억제 활성 사이의 상관 관계는 Quan et al.[33]의 연구에서 발견되었습니다. C.tramdenum 나무 껍질 추출물의 항산화 및 잠재적인 당뇨병 억제 특성을 조사했습니다. 그들의 결과는 또한항산화제분석(DPPH, ABTS, 환원력 및 산화질소 포함)은 p에서 -amylase 및 -glucosidase 억제 분석과 강한 상관관계가 있었습니다.<>
3. 재료 및 방법 3.1.실크 코크00ns
태국 실크 누에고치의 Nangsew 및 Eri 계통이 수집되었습니다. 그만큼낭소 균주(노란 고치)는 태국 부리람 주 푸타이송 지구 Baan Hua Saban에서 입수했습니다. Eri 계통(흰색 고치)은 태국 콘캔 주 만차 키리의 농야 플롱 커뮤니티에서 왔습니다.
3.2. 화학물질 및 시약
필수 아미노산인 페닐알라닌, 발린,트립토판, 쓰레오닌, 이소류신, 메티오닌, 히스티딘, 아르기닌, 라이신 및 류신. 연구된 비필수 아미노산은 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 세린, 티로신, 알라닌 및 아스파라긴이었습니다. 항산화 활성 측정 시약은 Sigma-Aldrich Co:Folin-Ciocalteu 시약,2,{4}}diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH),2,4,{8}}tripiridyl-s-triazine에서 얻었습니다. (TPTZ),2,2'-and-bis({15}}thylbenzthiazoline{16}}sulphonic acid)(ABTS). HPLC 분석에 사용된 용매와 시약은 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. -아밀라아제(Aspergillus oryzae), -글루코시다아제(Bacillus stearothermophilus), p-니트로페닐{20}}D-글루코피라노사이드(PNP-G), 소 혈청 알부민(BSA) 및 아지드화 나트륨은 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 주식회사
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3.3. 증류수로 추출
추출은 Sangwong et al. [34]. 실크 고치는 작은 조각으로 잘렸습니다. 이 조각 2g을 지정된 추출 시간 동안 100도에서 200mL의 증류수로 추출했습니다. 추출물을 원심분리기(Universal 320/320R, Hettich, Boucherville, QC, Canada)에 의해 5000×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 추출액을 Whatman No.1 종이로 진공여과하여 불용성 물질을 제거하여 실크단백질추출물(SPE)을 제조하였다.
3.4. 단백질 측정
단백질 결정은 Bradford 분석에 의해 결정되었습니다[35]. SPE(0.5 mL)를 1.0mL의 Bradford 용액에 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션했습니다. 소 혈청 알부민(BSA)을 표준 참조 단백질로 사용했습니다. 샘플의 흡광도는 가시 분광 광도계(DR 2700rM Portable Spectrophotometer, Hach, Loveland, CO, USA)를 사용하여 595 nm에서 측정되었습니다.
3.5.Amin0-LCMS/MS에 의한 산 함량
아미노산 분석은 LC-MS-MS(Shimadzu LCMS-8030) 삼중 사중극자 질량 분석기, 전자분무 이온화(ESI) 모드를 사용한 후 Shimadzu HPLC 시스템(Shimadzu, Kyoto, Japan)에서 분석했습니다. (Chumroenphat et al. [36). HPLC 분석은 0.2mL/min의 유속을 포함했습니다. 컬럼 오븐의 온도는 38도이고 오토샘플러는 4도였습니다. 이동상은 (A)수성 포름산{{1{15}}}.1%(o/o) 및 (B) 메탄올-물(50:50)을 준비했습니다. 그런 다음 믹서는 포름산 0.1 퍼센트(o/v). 샘플 흡인 전후에 자동샘플러 바늘을 메탄올로 퍼징했습니다. 분석은 삼중으로 수행하였다.
3.6. 총 페놀 함량(TPC)
실크 단백질 추출물의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법[30]에 따라 분석되었습니다. 간단히 말해서, SPE 0.3mL를 증류수에 용해된 10% Folin-Ciocalteu 시약 2.25mL와 혼합했습니다. 5분 인큐베이션 후, 6% 탄산나트륨(NazCO) 용액 2.25mL를 첨가하고 혼합물을 실온에서 90분 동안 방치하였다. 용액 샘플의 흡광도는 분광광도계를 사용하여 725 nm에서 측정하였다. 콩의 TPC는 g 건조 중량(mg GAE/g DW)당 mg 갈산 당량(GAE)으로 표시되었습니다. 분석은 삼중으로 수행하였다.
3.7. 총 플라보노이드 함량(TFC)
SPE의 총 플라보노이드 함량은 Kubota 및 [30]에 따라 결정되었으며 수정되었습니다. 간단히 말해서,00.5mL의 각 샘플 용액을 2.25ml의 증류수 및 00.15ml의 5% NaNO 용액(w/v)과 혼합했습니다. 용액을 6분 동안 방치한 다음 010% AlCl3(w/v) 0.3mL를 용액에 첨가했습니다. 5분 후 1M NaOH(w/ø) 용액 0.1mL를 첨가한 다음 분광광도계를 사용하여 510nm에서 흡광도를 측정했습니다. 결과는 g 건조 중량(mg RE/g DW)당 mg 루틴 당량(RE)으로 표시되었습니다.
3.8. DPPH 라디칼 소거 활성
SPE의 항산화 활성은 Brand-Williams et al.[37]에 따라 안정한 1,{1}}diphenyl{2}}picrylhydrazyl(DPPH) 자유 라디칼의 소거 활성으로 결정되었습니다. 실크 단백질 추출물 0.1 mL를0.001M DPPHin 메탄올 3ml에 첨가했습니다. 혼합물을 실온의 암실에서 30분 동안 유지하였다. 분광광도계를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정했습니다. DPPH 억제를 계산하기 위한 방정식은 다음과 같았다:
(1) 억제(%)=[(Abs. control- Abs.sample)/Abs. 컨트롤]×100)
어디 Abs. 샘플은 샘플 및 Ab의 흡광도입니다. 컨트롤은 컨트롤의 흡광도입니다.
3.9.ABTS Assay에 의한 항산화 활성
Re et al.의 ABTS 라디칼 양이온 방법. (1999) [22]는 자유 라디칼 소거 효과를 평가하기 위해 수정되었습니다. ATBS working solution은 7.4mM ABTS와 2.6mM Potassium persulfate를 1:1(v/v)로 혼합하여 실온에서 12시간 동안 암실에서 반응시킨 후 탈이온수로 희석하여 제조하였다. . 흡광도는 1.1 ±{13}}.02에 도달할 때까지 분광 광도계를 사용하여 734 nm에서 측정되었습니다. 그런 다음 150 μL의 SPE와 2850 μL의 ATBS 작업 용액을 혼합하면서 어두운 곳에서 2시간 동안 반응시켰고, 분광 광도계를 사용하여 734 nm에서의 흡광도; 100% 메탄올을 대조군으로 사용했습니다. 저해를 계산하는 식은 식(1)과 같다.
3.10. 제2철 환원/항산화력 분석(FRAP)
추출물의 환원력은 FRAP assay[23]에 근거하였다. 새로운 FRAP 시약은 1{2}}0mL의 아세테이트 완충액(0.3mol LI, pH 3.6), 10mL의 40mmol L{10}HC 및 10mL의 20mmolL에 용해된 10mL의 TPTZ 용액을 혼합하여 제조되었습니다. -1FeCl; 10∶1∶1의 비율로 37도의 증류수 120ml를 가합니다. 간단히 말해서, 60μL의 SPE 및 180uL의 탈이온수를 1.8mL의 FRAP 시약에 첨가했습니다. 용액을 와류 혼합에 의해 진탕시켰다. 용액을 37도 수조에서 4분간 배양한 후 대조군에 대해 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP 값은 g 건조 기준(mg FeSO4/g DW)당 mg FeSO4로 표시되었습니다.
3.11.효소-아밀라아제에 대한 억제 활성
-아밀라아제 효소 억제 활성은 Xiao et al.의 방법을 사용하여 측정되었습니다. (2006)[38] 약간의 수정이 있습니다. 기질은 100mg 감자 전분을 5mL 인산 완충액(pH 7.0)에 5분 동안 끓인 다음 실온으로 냉각하여 준비했습니다. SPE(50μL), 기질(300μL) 및 5ug/mL -아밀라아제 용액(20μL)을 혼합하고 용액을 37도에서 15분 동안 인큐베이션했습니다. 50μL 1M HCl을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 50μL 요오드 용액을 첨가하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더에 의해 650nm에서 측정되었다. Acarbose는 양성 대조군으로 사용되었습니다. x-amylase의 저해율은 식 (1)과 같이 평가하였다.
3.12.효소-글루코시다아제에 대한 억제 활성
α-글루코시다아제 효소 억제 분석은 Wang and Zhao[39].SPE(디메틸설폭사이드에 용해된 2mL; DMSO) 및 0.5 U/mL α-글루코시다아제(40 mL)을 0.1M 인산 완충액(pH 7.0) 12{11}}mL에 혼합했습니다. 5분 사전 인큐베이션 후, 5mM p-니트로페닐{16}D-글루코피라노사이드 용액(40mL)을 첨가하고, 용액을 37도에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 UV/Vis 흡광도 분광 광도계 마이크로플레이트 판독기에 의해 405 nm에서 측정되었다. α-글루코시다아제의 억제율은 식 (1)과 같이 평가하였다.
3.13.항-AGEs 형성 활성의 평가
실크 단백질과 그 분획의 AGE 형성 억제능은 Vinson and Howard[4{7}}]의 방법을 사용하여 측정되었습니다. 당화 반응 용액의 총 부피(2.5mL)는 5{1{14}}}0μL의 SPE, 500μL의 20mg/mL BSA를 인산 완충액에, 500μL의 0.5M 포도당을 혼합하여 준비했습니다. 인산염 완충액 및 0.02%(w/v) 아지드화나트륨을 함유하는 pH 7.4의 0.1M 인산염 완충액 1mL. 이 혼합물을 암실에서 37도에서 5일 동안 인큐베이션한 다음, 여기 파장 330 nm 및 방출 파장 410 nm를 갖는 형광 분광계를 사용하여 형성된 형광 AGE의 수를 측정하였다. 항-AGE 형성의 백분율은 다음 방정식을 사용하여 생성된 형광 강도(FI)를 기반으로 계산되었습니다:(2) n =[1-(FIsample - FIsample blank)/(control-control blank )]×100 여기서 Flsample은 샘플의 형광 강도, 샘플 블랭크는 샘플 블랭크의 형광 강도, 컨트롤은 컨트롤의 형광 강도, FIcontrol 블랭크는 샘플 컨트롤 블랭크의 형광 강도입니다.
3.14. 통계 분석
모든 데이터는 SPSS 소프트웨어(IBM SPSS, Chicago, IL, USA)로 분석되었습니다. 결과는 3회 반복실험의 평균 ± 표준편차(SD)로 보고되며 데이터는 대조군과 Pearson의 상관관계에 대한 유의성을 결정하기 위해 LSD(최소유의차) 검정을 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석되었습니다. 평균 간의 상관관계를 평가하기 위한 검정. 모든 경우에, p<0.05 was="" considered="">
4. 결론
실크 단백질 추출 효과에 대한 우리의 연구는 100도에서 6시간 동안 증류수로 추출하는 것과 관련이 있습니다. 이 절차는 단백질 함량, 아미노산, 총 페놀 함량(TPC), 총 플라보노이드 함량(TFC), DPPH 라디칼 소거 활성, ABTS 라디칼 소거능 분석, FRAP 분석, 항{2}}아밀라아제, 다른 추출 시간과 비교할 때 항-α-글루코시다아제 및 항당화. 또한 Nangsew 균주의 SPE는 Eri 균주의 추출물과 비교할 때 이러한 모든 영양학적으로 유익한 물질의 함량이 더 높았다. 결과는 Nangsew가 기능성 음료 생산에서 대안의 기회를 제공하는 누에고치 치료 동안 추출된 세리신을 기반으로 하는 기능성 식품용 천연 첨가제를 개발하려는 우리의 지속적인 계획에서 선호되는 균주가 될 것임을 시사합니다.
저자 기여:개념화, CBand SS; 방법론, CBand SS; 검증, CBand SS; 형식 분석, CBand SS; 조사, CBand SS; 작문—원본 초안 준비, CBand SS; 작문—검토 및 편집, CBand SS; 시각화, CbandS.S. 모든 저자는 출판된 원고 버전을 읽고 동의했습니다.
자금:이 연구는 TSRI(Thailand Science Research and Innovation)와 Siam Natural Products Co., Ltd.의 지원을 받았습니다.
기관 검토 위원회 성명서:해당되지 않습니다.
사전 동의 진술:해당되지 않습니다. 데이터 가용성 선언문: 해당 없음.
감사의 말:협력 및 과학 지원을 위해 Mahasarakham 대학의 실험실 장비 센터 제공. 영어 교정에 대해 호주 퀸즐랜드 대학교의 Colin Wrigley에게도 감사드립니다.
이해 상충:저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
이 기사는 Molecules 2021, 26, 2033에서 발췌했습니다. https://doi.org/10.3390/molecules26072033 https://www.mdpi.com/journal/molecules
