추상적인

소개: 프로폴리스는 꿀벌이 각종 나무와 식물의 새싹과 분비물에서 채집한 수지성 천연물질입니다. 프로폴리스의 조성은 수집 장소의 식물지리학적 특성에 따라 달라진다는 것이 널리 받아들여지고 있습니다.

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA의 함량을 감소시키며 정자 막 기능에 대한 특정 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력을 가지고 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼로 인한 콜라겐 분해를 방지하며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.

Cistanche Tubulosa 보충제를 클릭하십시오.

【자세한 정보: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

목표: 본 연구는 아프리카 베닌(북부, 중부, 남부)과 콩고의 서로 다른 지역에서 수집된 8개의 프로폴리스 배치에서 에탄올 추출물의 식물 화학적 조성을 결정하는 것을 목적으로 합니다.

재료 및 방법:MixONat 소프트웨어로 탄소-13 핵 자기 공명(13C NMR) 복제와 결합된 다양한 하이픈으로 연결된 크로마토그래피 방법을 사용하여 프로폴리스 샘플의 특성화를 수행했습니다. 이들의 항산화제 또는 항진화 당화 최종 생성물(anti-AGE) 활성은 각각 diphenylpicrylhydrazyl 및 소 혈청 알부민 분석을 사용하여 평가되었습니다.

결과: 13C NMR 중복 제거와 결합된 크로마토그래피 분석은 베냉 중심부의 두 샘플이 막대한 양의 펜타사이클릭 트리테르펜, 메톡실화된 스틸베노이드 또는 페난트렌과 함께 첫 번째 추출물의 항산화 활성을 담당하는 것으로 나타났습니다. 그 중 콤브레타스타틴은 세포독성이 있을 수 있습니다. 두 번째로, 마카랑가 유형의 프로폴리스에서 알려진 프레닐화 플라바논은 중요한 항-AGE 활성을 담당했습니다. 콩고의 샘플은 Mangifera indica 종에 속하는 많은 트리테르펜 유도체로 구성되었습니다.

결론: 따라서 베냉 중심부의 프로폴리스는 항산화 및 항-AGE 특성으로 인해 특히 관심을 받는 것으로 보입니다. 그럼에도 불구하고 열대 지역에서는 프로폴리스의 화학적 다양성이 커서 표준화가 어려우므로 아프리카에서 프로폴리스의 식품 및 건강 제품 사용을 촉진하기 전에 체계적인 식물 화학 분석이 필요합니다.

키워드

13C NMR 복제, 메톡실화 스틸베노이드 또는 페난트렌, 펜타사이클릭 트리테르펜, 프레닐화 플라바논, 프로폴리스

1. 소개

프로폴리스는 꿀벌이 다양한 나무와 식물의 새싹과 삼출물에서 수집한 천연 수지 물질로 밀랍과 타액 효소가 혼합되어 있습니다. (작은 곤충)은 벌집 내부에서 극심한 습도 또는 가뭄 조건의 균형을 유지합니다.2,3 프로폴리스는 광범위한 치료 특성으로 인해 고대부터 민간 요법에 널리 사용되었습니다.4 프로폴리스는 일반적으로 수지(50%)로 구성되어 있습니다. , 왁스(30%), 오일(10%), 꽃가루(5%), 플라보노이드와 같은 추가 페놀 화합물5,6 , 꿀벌이 삼출물을 수집합니다.7 해당 지역의 식물 구성, 수집 장소 및 시간, 계절, 수집 유형, 가용성 및 고도, 동안 개발된 음식 활동과 같은 여러 요인이 인정됩니다. 프로폴리스의 착취는 프로폴리스의 화학 성분에 영향을 미칩니다.8,9 생산 지역, 식물원 및 화학 성분에 따라 다양한 유형의 프로폴리스가 있습니다. 프로폴리스의 가장 일반적인 유형은 온대, 자작나무, 열대, 지중해 및 태평양입니다.10 유럽, 북미 또는 아시아의 비열대 지역과 같은 온대 기후대의 프로폴리스는 주로 Populus 종의 새싹 삼출물에서 나옵니다. Salicaceae) 따라서 플라보노이드와 페놀산 및 그 에스테르가 풍부합니다. 그러나 포플러나 자작나무가 자라지 않는 지역에서 생산되는 열대 프로폴리스에는 p-쿠마르산, 벤조페논 또는 테르페노이드의 프레닐화 유도체가 풍부합니다. 일반적으로 프레닐화 플라바논이 풍부한 태평양 프로폴리스는 대만에서 발견되는 또 다른 중요한 유형의 프로폴리스입니다. , 일본, 솔로몬 제도, 그리고 자작나무 프로폴리스는 특히 러시아에서 발견됩니다.12 열대 아시아의 프로폴리스에 대한 연구는 인도네시아 프로폴리스의 식물 공급원으로 Macaranga denarius L. 및 Mangifera indica L.을 발견하게 되었습니다.13 한편, 측백나무과의 침엽수 종은 지중해 지역에서 프로폴리스의 주요 식물 공급원입니다.14 화학 분석 결과 프로폴리스에는 페놀산 유도체, 쿠마린, 플라보노이드, 세스퀴테르펜, 디테르펜, 트리테르펜, 스테로이드, 리그난 또는 프레닐화 벤조페논.15 프로폴리스의 생물학적 효과는 주로 항산화제,16-18 항-AGE(즉, 진행된 당화 최종 생성물[AGE] 형성 억제),19 항 - 염증,20 및 항종양 효과,21–23 뿐만 아니라 항균,24–26 항진균,15 항바이러스,27 및 항기생충28 활동. 프로폴리스는 또한 항체 생성을 자극하는 것으로 알려져 있어 백신의 보조제로 잠재적으로 사용할 수 있음을 시사합니다.29 다양한 구성의 이 천연 물질의 사용 증가와 그에 따른 제약, 화장품 및 식품 산업에서의 다양한 생물학적 활동은 특별한 관심을 불러일으키고 있습니다. 과학 연구에서, 특히 화학 성분을 정의할 때 그렇습니다. 대부분의 연구는 유럽19,30-33 및 라틴 아메리카, 보다 구체적으로 브라질,20,23,34-36 샘플에 대해 수행되었으며 아프리카에서는 거의 수행되지 않았습니다.

따라서 본 연구는 MixONat 소프트웨어로 13C 핵자기공명(NMR) 복제를 사용하여 아프리카 베닌과 콩고의 다양한 식물지리학적 지역에서 수집된 프로폴리스 샘플의 주요 화합물을 특성화하는 것을 목표로 합니다.43,44 다음을 포함하는 데이터베이스(DB)를 사용한 예비 연구 이전에 프로폴리스에서 보고된 NP와 13C 예측 화학적 이동(δC)은 일반적으로 식물 추출물에서 얻은 만족스러운 결과와 비교할 때 유용한 데이터를 생성하지 못했습니다. 지역 식물상에서 화학 분류 DB를 구축하는 것이 불가능합니다. 따라서 Beninese 및 Congolese 프로폴리스의 주요 화합물을 해독하기 위해 본 연구에서는 자외선 및 증발 광산란 검출 질량분석법(HPLC-UV-ELSD-MS)과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피와 질량분석법이 결합된 가스 크로마토그래피를 수행했습니다. GC-MS) 조 프로폴리스 추출물을 분석하여 주요 구조적 특징을 확인하고 MixONat 소프트웨어에 적합한 NP의 해당 DB를 구축합니다.46 추가 정제 없이 주요 NP 식별. 항산화 및 항-AGE 분석도 수행되었습니다.

2. 실험 절차

2.1 화학물질

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), Folin-Ciocalteu 시약, 포름산 및 갈산, 모두 분석 등급은 Sigma-Aldrich(St Quentin Fallavier, 프랑스)에서 구입했습니다. 6-Hydroxy-2,- 5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(Trolox®) 및 50 - caffeoylquinic acid(chlorogenic acid)는 Acros Organics(Geel, Belgium)로부터 입수하였다.

2.2 프로폴리스 샘플

8개의 Beninese 프로폴리스 샘플은 3개의 식물지리학적 구역(표 1 및 그림 SI-1)의 벌집에서 긁어 모아 수집되었습니다. 콩고 공화국 중부 바테케 고원의 아카시아 나무 인공림에서 콩고산 프로폴리스 샘플을 채취하였다(표 1).

2.3 프로폴리스 추출

프로폴리스의 에탄올 추출물(EEP)은 처음에 다음 추출 프로토콜을 사용하여 준비되었습니다.19 생 프로폴리스는 먼저 액체 질소가 있는 상태에서 균질하게 분쇄되었습니다. 모든 샘플에 대해 프로폴리스 분말 1g을 95% EtOH 20ml에 담가 두었습니다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 혼합물을 소결된 유리 디스크 깔대기 필터(기공 크기 16-40μm)를 사용하여 여과했습니다. 잔류물을 동일한 단계를 사용하여 2회 재추출하였다. 그 후, 수집된 3개의 여액을 18℃에서 밤새 유지하고, 여과하여 왁스를 제거하고, 감압(40℃, 10bar) 하에서 증발시켜 EEP를 얻었다.

BC1(1) 및 BC2(2) 프로폴리스 분말 8.0g 또는 CG(3) 10.3g을 EtOH 95%(UAE, 4.80ml, 15분)로 다시 추출하여 추가 추출하였다. 플래시 크로마토그래피.

2.4 총 페놀 함량 결정

총 페놀 함량은 이전에 설명한 Folin-Ciocalteu 비색 방법을 통해 결정되었으며 최근에는 마이크로플레이트에서 직접 사용하도록 조정되었습니다. 간략하게, MeOH(BC1의 경우 3.5mg/ml, BN2, BC2 및 CG의 경우 5mg/ml, BN1, BS1a, BS1b 및 BS2의 경우 7.5mg/ml 및 BS3의 경우 10 mg/ml)을 96-웰 마이크로플레이트에서 증류수 20 ul 및 Folin-Ciocalteu 시약 10 ul와 혼합했습니다. 3분 후, 120ul의 증류수와 40ul의 20% 탄산나트륨 수용액을 첨가하였다. 실온의 어두운 곳에서 30분 후 760nm에서 TECAN® 마이크로플레이트 분광광도계(V6.5)에서 흡광도를 측정했습니다. 추출용액 대신 MeOH를 사용하여 같은 방법으로 블랭크를 준비하고 갈산을 사용하여 검량선을 계산하였다(0.04–0.328 mg/ml; y=2.7241x 0.0039; r2=0 .9982). 각 샘플은 3중으로 분석되었습니다. 총 페놀 함량은 추출물 그램당 갈산 당량(mg)(mg GAE/g)으로 표현되었습니다.

2.5 예비 크로마토그래피 분석

2.5.1 분석 TLC

TLC Alugram Xtra SIL G/UV254(Macherey-Nagel, Düren, Germany)에서 분석용 박층 크로마토그래피(TLC)를 용리액으로 시클로헥산:AcOEt의 혼합물을 사용하여 수행했습니다. 크로마토그램의 스폿은 먼저 UV 광(254nm)에서 시각화한 다음 바닐린-황산 시약(1:99 w/v 바닐린:95% 에탄올 용액 98ml에 진한 황산 2ml)을 분무하여 시각화했습니다. 크로마토그램을 110℃에서 5분 동안 가열합니다.

2.5.2 GC-MS 절차

GC-MS 분석은 이온화 전압이 70 eV(Electronic 영향). 샘플은 추출물의 경우 2mg/ml, 분획의 경우 1mg/ml의 디클로로메탄(DCM)에서 준비되었습니다. 분리는 Phenomenex ZB5 컬럼(30m * 0.250mm 내부 직경과 0.25mm 필름 두께, Phenomenex, Le Pecq, France)을 사용하여 수행되었습니다. 온도는 다음과 같이 프로그래밍되었습니다: 180°C(3분), 180-280°C(10°C/분), 280°C(27분). 헬륨은 2.0 ml/min의 유속으로 캐리어 가스로 사용되었습니다. 주입기 및 검출기 온도는 각각 250℃ 및 280℃로 설정하였다. 대사산물은 머무름 시간(Rt), 공칭 질량 및/또는 조각화 패턴을 실제 샘플 및/또는 장비의 조각화 패턴 라이브러리(NIST11, NIST11s 및 FFNSC2)에 포함된 것과 비교하여 식별되었습니다.

2.5.3 HPLC-DAD-ELSD 절차

크로마토그래피 분석은 다이오드 어레이가 장착된 Shimadzu 2030C 3D 액체 크로마토그래프(Noisiel, France)를 사용하여 수행하였다.Lichrospher® 컬럼 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Germany)가 있는 검출기(DAD) 및 ELSD(Sedere®) ) Lichrocart® 4–4 가드 카트리지(4mm*4mm id)로 보호하고 1ml/min의 유속을 사용합니다. 이동상은 물(용매 A)과 메탄올(용매 B) 중 0.1% 포름산으로 구성되었으며 다음과 같은 선형 구배로 분리를 수행했습니다. 분). UV-vis 스펙트럼은 190-600 nm 범위에서 기록되었고 크로마토그램은 254 및 280 nm에서 획득되었습니다. ELSD는 30에서 가열되었습니다.도C, 그리고 4의 이득이 신호에 적용되었습니다. 샘플은 MeOH에서 10 mg/ml의 농도로 준비되었고 현탁 물질의 흔적을 제거하기 위해 주입 전(10 ul) 10분 동안 13,{3}} g에서 원심분리되었습니다.

2.5.4 HPLC-UV-MS 절차

HPLC-UV-MS 분석은 Dual λ 2487 Waters 검출기가 장착된 2795 Waters 분리 모듈(Guyancourt, France)을 사용하여 수행되었습니다. 컬럼, 이동상 및 기울기는 HPLC-DAD-ELSD에 대해 위에서 설명한 것과 동일합니다. 크로마토그램은 254 및 280 nm에서 획득했습니다. 질량 분석은 Bruker(Bremen, Germany) 전자분무 이온화/대기압 화학 이온화(ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plus에서 양성 모드와 음성 모드 모두에서 다음과 같이 수행되었습니다: 충돌 가스, He; 충돌 에너지 진폭, 1.3V; 분무기 및 건조 가스, N2, 7L/min; 분무기 가스의 압력, 30 psi; 건조 온도, 340℃; 유속, 1.0ml/분; 용매 분할 비율, 1:9; 스캔 범위, m/z 100–1,000. 샘플은 MeOH에서 10mg/ml의 농도로 준비되었고, 13,000g에서 10분 동안 원심분리되었으며, 미량을 제거하기 위해 주입 전(20ul) 0.45-μm 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 주사기 필터를 통해 여과되었습니다. 중단 된 재료.

2.6 플래쉬 크로마토그래피에 의한 EEP 분류

먼저, 3.8g의 BC1(1), 3.5g의 BC2(2) 또는 4.{9}}g의 CG(3) EEP를 최소 부피의 DCM 및 아세톤에 용해하고 실리카겔(실리카 젤: 추출물 비율, 2:1). 이들 모두에 대해 미세한 건조 분말이 얻어질 때까지 용매를 증발시켰다. 각 EEP에 대해 실리카 겔 컬럼(Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, France) 25ml/분의 유속으로 사이클로헥산(용매 A) 및 에틸 아세테이트(EtOAc)(용매 B)를 사용하여 다음 구배 용리를 사용: (1) BC1 EEP의 경우, 5 퍼센트 B(0~10분), 5~20퍼센트 B(10~30분), 20~30퍼센트 B(30~60분), 30~50퍼센트 B(60~85분), 50~100퍼센트 B(85~110분); 20ml 튜브 160개를 수집하고 TLC 크로마토그래피 프로필(시클로헥산:EtOAc 비율, 90:10 ~ 50:50)에 따라 14개의 분획(BC1_F1 ~ BC{43}}F14)으로 합쳤습니다. ); (2) BC2 EEP의 경우, 5% B(0–10분), 5–10% B(10–20분), 10–30% B(20–40분), 30–40% B(40–55분) 최소) 및 40–100% B(55–70분); 20ml 튜브 100개를 수집하고 TLC 크로마토그래피 프로필(사이클로헥산:EtOAc 비율, 90:10 ~ 60:40)에 따라 8개 분획(BC2_F1 ~ BC2_F8)으로 합쳤습니다. ); (3) CG EEP의 경우, 5퍼센트 B(0~10분), 5~10퍼센트 B(10~30분), 10~20퍼센트 B(30~50분), 20~40퍼센트 B(50~70분) 최소), 40–60% B(70–80분) 및 60–100% B(80–90분); 20ml 튜브 135개를 수집하고 TLC 크로마토그래피 프로필(시클로헥산:EtOAc 비율, 80:20~60:40)을 기준으로 23개 분획(CG_F1에서 CG_F23)으로 결합했습니다. ).

BC{0}}F7 분획에 대해 추가 분획 단계를 수행했습니다. 200mg을 최소 부피의 MeOH에 용해하고 C18-실리카 겔(C18-실리카 젤: 추출물 비율, 2:1). C18 컬럼(Interchim® PF-C18HP, 4g, Montluçon, France)에서 물(용매 A) 및 MeOH(용매 B)와 함께 15ml/분의 유속으로 다음 구배 용출을 사용하여 분리를 실현했습니다. 70퍼센트 B(0–30분) 및 70–100퍼센트 B(30–40분); 8ml 튜브 80개를 수집하고 HPLC-UV(280nm) 프로파일을 기준으로 5개의 분획(BC2_F7-1에서 BC2_F7-5)으로 합쳤습니다. .

2.7 1 H 및 13C NMR 분석

프로폴리스 분획(7–58 mg) 또는 때때로 NP의 NMR 스펙트럼(1D 및 2D)은 중수소화 클로로포름(CDCl3) 또는 중수소화 메탄올(CD3OD)(500 ul)에서 JEOL NMR 분광계에서 400 MHz에서 1 H 및 100 13C의 경우 MHz. 분수 및 순수한 NP에 대한 NMR 실험(1H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 및 2D NMR)은 JEOL 400MHz H 분광기(JEOL Europe, Croissy)에서 298K에서 수행되었습니다. -sur-Seine, France)에 역 5-mm 탐침(ROYAL RO5) 장착. 화학적 이동(δH 및 δC)은 ppm으로, J 값은 Hz로 표시됩니다.

13C NMR(100MHz) 스펙트럼의 경우 획득 시간이 1.04초(32,768복합 데이터 포인트)이고 완화 지연이 2초인 WALTZ-16 디커플링 시퀀스가 ​​사용되었습니다. 만족스러운 S/N 비율을 얻기 위해 1,500~11000 스캔을 수집했습니다. 푸리에 변환 전에 각각의 자유 유도 감쇠(FID)에 1Hz 지수 라인 확장 필터를 적용했습니다. MestReNova 소프트웨어(Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Spain)를 사용하여 스펙트럼을 수동으로 위상 조정하고 기준선을 보정했으며 δC 77.16ppm(CDCl3) 및 δC 49.00ppm(CD3OD)에서 중수소화 용매의 중심 공명을 참조했습니다. DEPT(polarization transfer) 실험에 의한 왜곡 없는 향상을 위해 512~5,500 스캔이 필요했고 주어진 δC를 사용하여 13C 스펙트럼과의 정렬이 이루어졌습니다. 그런 다음 잠재적인 노이즈 아티팩트를 피하면서 양의 13C NMR 및 DEPT-90 신호와 양 및 음의 DEPT-135 신호를 수동으로 수집하기 위해 최소 강도 임계값을 사용했습니다.

프로폴리스 DB1은 처음에 SciFindern에서 프로폴리스에 설명된 화합물을 검색하여 구축되었으며, 47 1,471 NP의 DB가 생성되었습니다. Advanced Chemistry Development(ACD) NMR 예측자(C, H)를 사용하여 δC 값을 예측했습니다. NP와 δC-SDF 값을 포함하는 DB에서 MixONat에 포함된 CTypeGen 루틴은 적절한 DB를 생성했습니다. 공간 데이터 파일(SDF)을 읽고 탄소 유형별로 화학적 이동을 정렬했습니다. 필요한 c-type SDF가 생성되었습니다. 즉, c-type Propolis DB1.43,44

Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2가 생성되었습니다. 276,518개의 NP가 포함된 LOTUS DB(LOTUS, 2022)에서 stilbenoids 및 phenanthrenes라는 키워드를 사용하여 물질을 검색한 결과 SDF로 2,681개의 NP의 Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2를 얻을 수 있었습니다. 그런 다음 Flavanones DB3가 생성되었습니다. 2-phenylchroman-4-one 하위 구조를 사용하여 SciFindern47을 검색하면 56,679개의 분자를 선택할 수 있습니다. SciFindern에서 제안한 "참조 역할" 필터를 사용하여 물질 분석을 사용하여 "천연물 발생"을 참조하여 2,893개로 더 축소되었습니다. 예상 분자량(MW)(즉, 340~424Da)을 기준으로 필터링 단계를 통해 추가로 정제한 후 모든 관련 플라바논을 SDF로 내보내 Flavanones DB3(684NP)에서 NP를 얻었습니다. DB2 및 DB3의 각 NP에 대해 ACD NMR 예측기(C, H) 소프트웨어와 이전에 Nuzillard46이 설명한 방법론을 사용하여 δC-SDF 값을 예측하여 MixONat에서 사용할 준비가 된 c-유형 SDF를 직접 얻었습니다. 후자는 DB의 각 화합물에 대해 메틸, 메틸렌, 메틴 또는 4차 탄소로 구성된 예측된 δC 값을 포함합니다.

트리테르펜 DB4는 MW가 100~500Da인 트리테르펜을 검색하여 ACD NMR 예측기(C, H) 소프트웨어에서 SDF로 가져온 PNMRNP3 DB49,50에서 구축되었습니다(즉, 검색 데이터: 트리테르펜; 검색 MW: 100~500). 필요한 c-type 파일 형식으로 6,623 트리테르펜의 DB를 직접 얻습니다.

Alk(en)yl resorcinol 및 페놀 유도체 DB5는 m-alk(en)yl 페놀 스캐폴드로 NP를 검색하여 ACD NMR 예측자(C, H) 소프트웨어에서 SDF로 가져온 PNMRNP3 DB49,50에서 구축되었으며 페놀로 분류되었습니다. (즉, 3-(hexadec-8-en-1-yl)phenol Substructure search; Search Classyfire class: phenol)을 사용하여 필요한 c-type 파일 형식으로 44개 NP의 DB를 직접 얻습니다.

2.8 13MixONat 소프트웨어를 사용한 C NMR 기반 복제 제거

각 실험 스펙트럼(13C NMR, DEPT-135 및 DEPT-90)에서 얻은 피크 목록 및 강도 데이터를 . csv 파일은 Microsoft Excel(Microsoft 16.45) 소프트웨어를 사용하며 MixONat 소프트웨어에서 입력 파일로 사용됩니다. 이러한 파일은 쉼표로 구분된 동일한 줄의 강도와 관련된 내림차순으로 정렬된 δC 값 목록으로 구성됩니다.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. 그 후, 최고의 점수를 가진 NP의 실험 데이터를 문헌과 비교했습니다.

2.9 정화

2.9.1 분취용 HPLC

분획 BC{{0}}F6 및 BC{2}}F8(MeOH 2ml 중 40mg)의 정제는 Shimadzu LC-20AP 분취제를 사용하여 수행되었습니다. 분취 컬럼 C18(25{{39 }} mm 21.2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, France) 유속 21.24 ml/min. 이동상은 물(용매 A) 및 메탄올(용매 B) 중 0.1% 포름산으로 구성되었으며 다음 구배를 사용하여 분리를 수행했습니다. (1) BC1_F6의 경우, 40% B(0–5 분), 40–70퍼센트 B(5–20분) 및 70–90퍼센트(20–30분); (2) BC1_F8의 경우, 40–70% B(0–15분) 및 70–90%(15-25분). 크로마토그램은 254 및 280 nm에서 수집되었습니다.

2.9.2 고체상 추출(SPE)

BC2-EPP의 최대 극성 분획(증발 후 350mg의 C18-실리카 겔과 혼합된 5ml의 MeOH 중 200mg)을 얻기 위해 C18 고체상 추출 컬럼을 사용하여 정제를 수행했습니다. (2g/15ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, France), 물: MeOH 7:3(10ml) 및 물: MeOH 6:4(10ml). 튜브 4-10을 결합하여 HPLC-UV(330nm) 프로파일을 기반으로 BC2(BC{19}}SPE)의 극성 부분을 형성했습니다.

2.10 항산화 및 항-AGE 분석

2.10.1 DPPH 라디칼 소거

Beninese EEP의 DPPH 라디칼 소거 평가는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다.51 간단히 말해서, 테스트 샘플은 0에서 절대 EtOH로 희석되었습니다.0디메틸설폭사이드에서 1 mg/ml의 저장 용액에서 2 mg/ml (DMSO). 이러한 희석 용액의 분취량(100ul)을 96-웰 플레이트에 3중으로 배치했습니다. 마이크로플레이트 판독기의 인젝터(Infinite® 200, Tecan, France)를 사용하여 약 25ul의 새로 제조된 DPPH 용액(1mM)을 75ul의 절대 EtOH에 첨가하여 웰당 200ul의 최종 부피를 얻었다. 상온에서 암실에서 30분 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. EtOH를 블랭크로 사용한 반면 Trolox(친수성 α-토코페롤 유사체)의 10, 25, 50 및 75μM 용액을 검량선에 사용했습니다. 클로로겐산 에탄올 용액(0.02 mg/ml) 샘플을 품질 관리 표준으로 사용했습니다. 결과는 Trolox 등가물(추출물 g당 TE의 마이크로몰)로 표현되었습니다.

2.10.2 항-AGE 분석

AGE 형성에 대한 프로폴리스 추출물 및 5가지 주요 분리 나린제닌 유도체의 효과는 이전에 설명한 대로 결정되었습니다. 13}}.5M) pH 7.4(NaN3, 0.02%)의 50mM 인산염 완충액에서 시험 화합물(3μM 내지 3mM) 또는 추출물(1ug 내지 1mg)과 함께. 용액은 AGE 형광 측정 전에 폐쇄 시스템에서 24시간 동안 37℃에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 배양되었습니다. D-리보스가 없는 동일한 조건에서 배양된 샘플의 형광을 각 측정에서 뺍니다. 펜토시딘 유사(335 nm에서 여기, 385 nm에서 방출) AGE 형광은 형광측정법으로 측정했습니다.52 IC50 값은 AGE 형성을 50% 감소시키는 데 필요한 추출물(ug/ml) 또는 양성 대조군(μM)의 양으로 정의되었습니다. 음성 대조군에 비해. 통계 검증 분석법53에 따르면 정확한 IC50 결정에는 단일 분석으로 충분합니다.

3. 결과 및 논의

3.1 크로마토그래피 프로파일링

준범용 ELSD 검출기를 사용한 8개의 Beninese 및 Congolese EPP의 일반적인 LC 프로파일링은 모든 샘플이 크로마토그램의 끝에서 용출된 비극성 화합물을 포함하고 있음을 보여주었습니다(그림 1). BC1은 또한 많은 양의 더 극성인 화합물을 나타내고 BC2는 소량의 중간 극성 화합물을 나타냅니다. CG EEP의 비극성 화합물은 Beninese 화합물과 상당히 다른 것으로 나타났습니다.

따라서 ELSD 프로파일링은 조성이 추가로 조사된 3개의 서로 다른 원래 샘플인 BC1, BC2 및 CG로 이어졌습니다.

먼저 GC-MS 분석을 수행하여 MS 단편화를 NIST DB와 비교하여 화학 등급을 특성화하고 가능한 경우 구성 요소를 식별했습니다. 추정 식별(NIST DB와의 일치 비율을 기준으로 함) 및 화합물의 화학적 등급이 표 2에 제시되어 있습니다(GC-총 이온 전류[TIC] 프로파일링 데이터는 그림 SI-2에 표시됨).

모든 Beninese EEP는 문자 A에서 F로 레이블이 지정된 비극성 화합물의 동일한 프로파일을 나타내지만 그 양은 다를 수 있습니다. - 또는 -암리논(A), -아미린(B), 루페논(C), -아미린(D), - 또는 -아미린 아세테이트(E) 및 루페올 아세테이트(F)로 추정되는 것으로 확인되었습니다(그림 SI 참조). -3), 이미 멕시코 프로폴리스의 주요 NP로 설명되어 있습니다.54 Zhang et al. (2014) 및 Tamfu et al. (2020)은 또한 트리테르페노이드를 다양한 아프리카 프로폴리스 샘플에서 아미린/루페올 및 아미린/루페올 아세테이트로 기술했습니다.41,55 BC1만이 단편화 패턴에 따라 메톡실화된 스틸베노이드 또는 페난트렌으로 제안된 Rt 10~15분 사이에 용출된 추가 NP를 제시했습니다. Congolese EEP는 Beninese EEP와 다른 프로파일을 나타냈는데, C16 및 C18 산성 에틸 에스테르가 더 휘발성인 화합물로서 94%의 양호한 일치 점수, Rt 13.1분의 페놀 유도체, 14– 17분, Rt 21분 후 다른 유형의 트리테르펜 유도체.

또한 EPP를 HPLC-DAD-MS로 분석하여 비휘발성 NP를 시각화했습니다(그림 SI-4 참조). 상이한 프로파일링은 BC1 EEP가 280nm에서 흡수하는 발색단을 갖는 다량의 중간 극성 화합물을 나타내었고 BC2는 더 작은 비율로 나타냈고 CG는 280nm에서 매우 열악한 UV 프로파일을 가짐을 보여주었다.

3.2 BC1 및 BC2의 화학적 조성

MixONat 및 적합한 DB를 기반으로 한 13C NMR 복제를 사용하여 주요 NP를 식별하기 위해 플래시 크로마토그래피로 BC1 및 BC2 EEP의 대략적인 분류를 수행했습니다. 실제로 BC1의 경우 GC-MS 분석에서 메톡실화된 스틸베노이드 또는 페난트렌의 존재가 밝혀졌으며, 이를 통해 특정 스틸베노이드_페난트레노이드 DB2를 구축할 수 있었습니다. BC2의 경우, Rt 3.8분에서 더 극성인 화합물을 제외하고 모든 화합물은 플라바논-디하이드로 플라보놀의 UV 스펙트럼을 보여 플라바논 DB3 생성을 제안했습니다.

표 3에 묘사된 바와 같이, dihydrophenanthrenes 1 및 3-5, phenanthrenes 2 및 6, dihydro stilbene 7(그림 2)은 MixONat의 BC1 EEP에서 제안되었으며 문헌 데이터(지원 정보 참조)와 비교하여 검증되었습니다. 필요한 경우 HPLC-MS 데이터를 기반으로 MW 필터를 사용했습니다.

보다 정확하게는 DB2의 2,681개 NP 중10-dihydrophenanthrene 유도체 9개 중에서 MixONat은 6-methoxycoelonin(2,7-dihydroxy-3,5-dimethoxy{ {10}},10-dihydrophenanthrene; 3, 순위 1, 점수 0.75, 그림 SI-13 및 SI-14) BC{{ 18}}F5 및 그 존재는 공개된 NMR 데이터와 비교하여 확인되었습니다. Combretaceae 종56과 난초 Bulbophyllum vaginatum에서 아직 확인되지 않았습니다. 57 및 2,7-dihydroxy-3,4,6-trimethoxy- 9,10-dihydrophenanthrene(4, 순위 1, 점수 0.88, 그림 SI{{33 }} 및 SI-16)는 BC1_F2에서 가정되었습니다. 화합물 4는 세네갈의 프로폴리스58에 이미 기술되어 있으며 Pettit et al. 아프리카 나무 Combretum caffrum59 및 Lu et al. Dioscorea nipponica Makino.60에서

13C NMR 기반 복제 제거 프로세스는 또한 2,6-dihydroxy-3,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene(5, 순위 8, 점수 0.76, 그림 SI-15 및 SI-16) BC1_F2 및 2,6,7-트리하이드록시{{20 }},4-dimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene(1, 순위 2, 점수 0.5, 그림 SI-5 및 SI-6 ) BC{{30}}F6-1에서 MW 288 Da의 분자 필터를 사용했을 때. 1의 경우 점수가 상당히 낮았습니다(0.5). 따라서 추가 2D NMR 실험(이핵 다중 양자 상관[HMQC], 이핵 다중 결합 연결[HMBC], 핵 Overhauser 효과 분광법[NOESY], 참조 그림 SI-7–SI-10)은 구조를 확인하기 위해 수행; 5의 경우 점수는 0.76, 즉 0.70보다 높았다. 이 두 NP(1 및 5)는 Letcher et al.에 의해 처음 언급되었습니다. Combretum 종61,62 및 1에서 이미 세네갈 프로폴리스에서 발견되었습니다.58

페난트렌 유도체 중에서 MixONat는 2,6,7-trihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene(2, rank 1, score 0.88, Figures SI-11 및 SI{{10}}) BC1_F8-1, 이는 Letcher 등이 기술한 스펙트럼 데이터와 비교하여 확인되었습니다. Combretum apiculatum에서. 61 2,7-Dihydroxy-3,4,6-trimethoxyphenanthrene(6, 순위 5, 점수 0.94, 그림 SI-17 및 SI-18) 이전에 Photolida Chinensis63에서 분리된 것이 BC1_F4에서 제안되었습니다.

Dihydro stilbene인 Combretastatin B{0}}(7)는 BC1 EPP에서 1순위(점수 1.0, 그림 SI-17 및 SI-19)에서 MixONat에 의해 제안되었습니다. MW 필터(MW 304 Da) 및 Pettit et al. Combretum caffrum에서. 59

화합물 2, 6, 7은 세네갈의 프로폴리스에서 이미 확인되었습니다.58

1–7의 1H 및 13C NMR 데이터는 지원 정보에서 사용할 수 있습니다.

BC2의 경우, 폴리페놀의 두 가지 구조적 부류인 크로몬-C-글루코시드 및 프레닐플라바논 유도체(8-14)에 속하는 7개의 화합물이 확인되었으며, 그 중 일부는 프로폴리스에서 처음으로 설명되었습니다(그림 3).

MixONat 및 DB1에서 DB5를 사용하는 13C NMR 기반 프로세스는 원래 NP를 제안하는 관련 결과를 제공하지 않았습니다. 두 가지 주요 제품(8–9)은 질량 스펙트럼과 1D 및 2D NMR 데이터(1H, 13C, HMQC, HMBC, cf. 그림 SI-20–SI-23 참조)를 사용하여 혼합물로 완전히 특성화되었습니다. 이전에 Pancratium biflorum64과 Eugenia caryophyllata의 정향에 각각 기술된 프로폴리스에 새로 기술된 두 개의 크로마논-C글루코사이드인 플로린(8)과 이소비플로린(9)으로 확인되었습니다.65

플라바논 유도체와 관련하여, DB3의 688개 NP 중 MixONat은 6-prenylnaringenin(10, 순위 1, 점수 0.95, 그림 SI- 24 및 SI{{8 }}) 이미 BC{{10}}F7-1의 나이지리아 레드 프로폴리스66에 설명되어 있습니다. 6,8-Diprenylaromadendrin(12, 순위 1, 점수 1.0, 그림 SI-28 및 SI-29) 및 6,8-diprenylnaringenin(lonchocarpol A ) (13, 순위 10, 점수 0.84, 그림 SI-30 및 SI-31), 이전에 카메룬 프로폴리스 샘플에서 발견된42는 BC2_F{ {30}} 및 BC2_F5. 6-Geranylnaringenin(14, 랭크 1, 점수 0.84, 그림 SI-32 및 SI-33)은 이전에 솔로몬 제도의 프로폴리스에서 기술된 것으로,67 BC에서 가설을 세우고 확인했습니다{{41 }}F7-5. 마지막으로 6-dimethylallyl naringenin(11)은 BC2_F6에서 MixONat에 의해 2위로 제안되었습니다(순위 2, 점수 0.65, 그림 SI-26 및 SI- 27). 위치 8의 이성질체가 첫 번째 위치에 제안되었지만 문헌 데이터 68,69와 비교한 결과 위치 6의 이성질체임을 보여주었습니다. 화합물 11은 프로폴리스에서 새로운 것이지만 Monotes africanus의 유기 추출물에 이미 기술되어 있습니다. 70 1 8–14의 H 및 13C NMR 데이터는 지원 정보에서 사용할 수 있습니다.

【자세한 정보: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】