Herba Cistanches의 유전적 다양성을 연구하는 방법?
Mar 14, 2022
RAPD의 Herba Cistanches의 유전적 다양성에 관한 연구
연락하다:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da
(중국중의약학회 중국중약재연구소, Beijing 100700)
추상적인
목적:인구를 연구하려면유전 적 다양성의시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 튜불로사.
행동 양식:2개의 야생 개체군시스탄체 데저티콜라그리고 4개의 야생 개체군시스탄체 튜불로사RAPD에 의해 분석되었으며,유전 적 다양성인구의 POPGENE의 소프트웨어 버전 1.31에 의해 분석되었습니다.
결과:다형성 유전자좌의 평균 백분율시스탄체 데저티콜라47.37%, 두 집단의 다형성 유전자좌는 39.47%와 35.53%, 평균 Nei의 유전자 다양성은 0였습니다.135 8 Shannon의 s는 더 많았다. 상태 정보 인덱스는 0.207 2이고 유전자 분화 계수 Gst는 {{1{{20}}}}입니다.{11}}. Cistanche에서 다형성 유전자좌의 평균 백분율은 27.59%였고, 각 개체군에서 다형성 유전자좌의 백분율은 19.54%에서 25.29%의 범위였으며, 그 중 Andier 개체군은 25.29%가 가장 높았고 Nei의 유전자 다양성은 평균 0이었습니다. { {21}}, Shannon의 다형성 정보 지수는 0.1258, 유전자 분화 계수 Gst =0.{25}}.
결론:시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 튜불로사집단 간에 일정한 차이가 있다. 그만큼유전 적 다양성Desert Cistanche의 종은 Cistanche tubulosa의 종보다 훨씬 높으며 두 가지 생태형으로 구분됩니다.
키워드: Cistanche Deserticola; 세뇨관(Cistanche tubulosa); RAPD; 유전 적 다양성
[중국 도서관 분류 번호] S 567 [문서 식별 코드] A [문서 번호] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Cistanche는 Lidanaceae 계통의 Cistanche 속에 속하는 기생 식물로, 귀한 한약재인 Dayun으로도 알려져 있습니다. 우리 나라에서 Cistanche Deserticola의 주요 근원 식물은시스탄체 데저티콜라YCMa 및 C.tubulosa(Schenk) R.Wight[1]. Cistanche Deserticola의 기주식물은 Haloxylon ammodendron과 Haloxylon ammodendron이며 주로 내몽골의 Alashan 리그, 신장 북부, 칭하이, 간쑤 및 기타 지역에 분포합니다. Cistanche Deserticola의 분포는 기주식물의 분포와 동일하다. 우리 나라에서 Cistanche cistanche는 Xinjiang의 Tianshan Mountains 남쪽 Taklimakan 사막 주변의 현에만 분포하며 그 분포는 호스트 Tamarix와 완전히 동기화되지 않습니다. 신장 북부, 간쑤, 칭하이, 닝샤, 내몽골, 산시 및 기타 타마릭스 식물의 다른 지역과 같은 다른 지역은 기생 Cistanche Tubula[2]가 아닙니다. 최근 몇 년 동안 Cistanche에 대한 수요가 급격히 증가하여 자원이 고갈됨에 따라 야생 Cistanche 자원은 소수의 주요 생산 지역으로 축소되었습니다. 둘 다 우리 나라에서 멸종 위기에 처한 보호 식물 종으로 나열되어 있습니다 [3], 그 중시스탄체 데저티콜라CITES 부록 II[4]에 포함되어 있습니다.
수년간의 연구 끝에 Cistanche의 인공 육종에 대한 연구는 성공적이었고 대규모 홍보 및 식재 단계에 있습니다. 그러나 산업 생산 중 Cistanche 종의 감소를 방지하는 방법, 제한된 야생 개체수를 가능한 한 빨리 복원하고 귀중한 야생 생식질 자원을 보존하는 방법이 지속 가능한 사용을 달성하는 열쇠입니다. Cistanche의 보호유산 [접수일], 2004-03-11 [기금과제] 과학기술부 사회복지사업(2001.109); 과학기술부 "10차 5개년 계획" 프로젝트(2001BA701A09a) [교신저자] * Huang Luqi, Tel:(010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net 아직까지 전파 연구 공백. 이 연구는 2개의 야생 개체군을 연구하기 위해 RAPD 기술을 사용합니다.시스탄체 데저티콜라4개의 야생 개체군시스탄체 튜불로사, 그리고 둘 다의 차이점을 분석합니다.유전 적 다양성귀한 한약재인 시스탄체의 보호를 위한 중요한 실험적 유전적 기반을 제공할 것으로 기대된다.
1. 재료 및 방법
1.1 재료
시스탄체 데저티콜라신장(Xinjiang)의 짐사르(Jimsar) 현과 내몽골(內蒙古)의 고대 알크사 동맹(Ancient Alxa League)의 질란타이(Jilantai) 지역에서 채집되었다. Cistanche 개체군은 Xinjiang의 Minfeng 카운티와 Yutian 카운티에서 수집되었습니다. 민펑현은 현재 Cistanche cistanche 생산량이 가장 많은 지역으로 밀도가 가장 높고 비교적 완전한 자연림 군집이 있습니다. 샘플링 포인트 Yutian County의 Andil, Sawuzek, Yatongguz 및 Daheyan은 Andir 강, Yeyike 강, Yatongguzi 강 및 Kelaniya에 위치한 주요 생산 지역입니다. 50km. 각 모집단은 무작위로 19-30명의 개인을 샘플링했습니다. 샘플을 실리카겔에서 빠르게 건조시키고 DNA 추출에 사용했습니다(표 1).
표 1 Cistanche Deserticola 및 Cistanche tubulosa의 표본 개체군 및 생산 지역
1.2 DNA 추출
total DNA 추출 방법은 high salt, low pH 방법을 사용한다[5]. DNA 샘플을 분광광도계로 처리하여 DNA 주형의 농도를 검출한 다음, 1% 아가로스 겔 전기영동, EB 염색, 자외선 관찰 및 사진, 투명한 밴드를 갖는 전기영동 DNA 및 덜 테일링을 RAPD 분석에 사용하였다.
1.3 RAPD 프라이머의 스크리닝
실험에서 동일한 프라이머가 두 가지의 동시 증폭에 만족스럽지 못한 영향을 미친다는 것을 발견했기 때문에시스탄체 데저티콜라및 Cistanche tubulosa, 프라이머는 독립적으로 스크리닝되었습니다. 150개의 무작위 프라이머(10bp), Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd.의 25μL 반응 시스템을 증폭 및 스크리닝에 사용했습니다. 각 프라이머는 2개의 모집단 템플릿과 1개의 멸균된 이중 증류수를 블랭크 대조군으로 사용하고 명확한 밴드, 강한 다형성 및 우수한 반복성을 갖는 Cistanche Deserticola의 증폭을 위한 10개의 프라이머를 얻었다: S490, S{7}}, S{{ 8}}, S1 137, S{10}}, S{11}}, S{12}}, S{13}}, S{14}}, S{15 }}; 10개의 프라이머시스탄체 튜불로사: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 PCR 증폭 및 생성물 검출
선택한 프라이머를 사용하여 의 템플릿 DNA를 증폭했습니다.시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 튜불로사PCR에 의해. Genomic DNA를 주형으로 측정된 농도에 따라 5{11}} ng·μL-1로 희석했습니다. 총 반응 부피는 25μL이며, 그 중 1{37}} × PCR Buffer 2.5μL, Mg2 + 1.5μL, Taq(5U·μL -1) 0.2μL, dNTP 혼합물(각 2.5mM) 1 μL, 5μM Primer 1μL, template DNA 1μL, 멸균 이중 증류수 18.8μL, 상기 PCR 증폭 용액은 Shanghai Sangon의 제품입니다. 증폭은 PTC{22}} 열 순환기에서 수행되었습니다. 증폭 프로그램은 5분 동안 94도 사전 변성 후 40주기였습니다. 각 주기는 94도 45초, 34도 1분, 72도 1분 30초를 포함하고 마지막으로 72도에서 5분간 연장합니다. 증폭된 산물은 1xTAE 완충액 내 2.0% 아가로스 겔(EB 함유)에서 전기영동하고 SYNGENE 겔 이미징 시스템에서 관찰 및 사진 촬영하였다.
1.5 데이터의 통계 및 분석
전기 영동 스펙트럼에서 겔 상의 반응 생성물의 해당 위치를 분자량 표준에 따라 비교하고 증폭된 생성물의 분자량을 추정합니다. 밴드가 있는 밴드는 1로 기록되고 밴드가 없는 밴드는 0로 기록되어 0/1 행렬 그래프를 형성하고 컴퓨터에 입력하고 POPGENE32를 사용하여 다형성 사이트의 백분율을 계산합니다. 각 모집단의 (PPL), Nei의 유전자 다양성 지수(H), Shannon의 다형성 정보 지수(I), 유전자 분화 계수(Gst), 유전자 다양성(Ht),유전 적 다양성(Hs), Nei(1978)의 유전적 동일성(I)과 모집단 내 유전적 거리(D), 클러스터 분석은 UPGMA 방법을 사용하여 수행되었습니다.
2. 결과 및 분석
2.1 Cistanche의 유전적 다양성
모든 샘플은 200에서 2 200 bp 범위의 분자량을 가진 밴드를 얻었습니다(그림 1, 2). 2개 집단의 60개 샘플에서 총 76개의 유전자좌가 검출되었습니다.시스탄체 데저티콜라, 그 중 36개는 다형성 유전자좌로 47.37%를 차지했으며, H=0.135 8, I=0.207 2. 이 중 Jimsar의 PPL은 39.47%, Gilanty의 PPL은 35.53%입니다. H는 0입니다. 0 95 3 및 0.{14}}, I는 각각 0.{16}} 및 0.{18}}입니다. 총 87개의 유전자좌가 Cistanche의 4개 집단의 {{20}}개 개체에서 감지되었으며, 그 중 24개는 다형성 유전자좌로 27.59%, H=0를 차지했습니다.{26}}, 나는=0.1278. 가장 높은 PPL은 Andil(25.29%)이었고 PPL은 Savuzek과 Yatungusi(둘 다 19.54%)에서 낮았습니다. H는 0.062 1 -0.{35}}, 나는 0.095 0 -0.116입니다. H와 I의 크기는 각 모집단의 PPL 크기 추이와 일치하며 계수는 Andier가 가장 크고 Dayan이 그 뒤를 잇는다. 동일한 PPL의 경우 Savuzek의 H=0.{{40}} 합계 I=0.097 0이 0보다 약간 높습니다.{{44 }} 및 0.{46}} Yatunguska(표 2).
그림 1 일부 사막 샘플의 RAPD 증폭 밴드시스탄체 데저티콜라, 입문서 S490 1-10. 보증 샘플; 11-20. Jimpster 샘플 M-DNA 마커(200 - 2 000 bp)
그림 2 Cistanche Tubulosa, primer S2 042 1-20의 일부 샘플의 RAPD 증폭 밴드. Xinjiang Andier 샘플 M-DNA 마커(200 - 2 000 bp)
표 2유전 적 다양성의시스탄체 데저티콜라그리고시스탄체 튜불로사인구
2.2 Cistanche의 유전적 변이 분석
의 수준에 따라유전 적 다양성개체군(Hs), 개체군 간 분화(Dst), 전체 유전적 차이(Gst)에서 개체군 간의 유전적 차이 비율에서 Cistanche Deserticola Ht=0의 전체 유전적 다양성을 알 수 있습니다.{{ 1}}, 여기서 Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, 그 중 Hs=0.067 8, Gst{10}}.{11}}(표 3). 위의 결과는 개체군 사이에 어느 정도의 유전적 변이가 있음을 나타냅니다. Cistanche Deserticola의 사막 개체군 간의 변동은 전체 변동의 25.46%를 설명했으며 Cistanche tubulosa 개체군의 변동은 전체 변동의 17.55%를 설명했습니다.
표 3의 유전적 변이 분석시스탄체 데저티콜라그리고Cistanche tubulosa.
2.3 Cistanche Deserticola 개체군 간의 유전적 거리 및 군집 분석
두 집단의 유전적 거리는시스탄체 데저티콜라{{0}}.080 0이고 유전적 정체성은 0.9231입니다. Cistanche의 4개 집단의 유전적 거리는 0.012 0-0.031 5이었고, 유전적 동일성은 0.9690-0.988 1이었다(표 4). . Cistanche Deserticola와 cistanche tubulosa 개체의 클러스터링은 Cistanche Deserticola가 개체군에 따라 두 개의 별개의 그룹으로 클러스터링될 수 있음을 보여 주는 반면, cistanche tubulosa의 다른 개체는 개체군별로 클러스터링될 수 없음을 보여줍니다. 인구가 상대적으로 많다. 크지만 Cistanche tubulosa 개체군 간의 유전적 분화는 작습니다.
표 4 의 유전적 동일성(좌측 하단) 및 유전적 거리(우측 상단)세뇨관.
3. 토론
3.1 Cistanche의 유전적 다양성
수준유전 적 다양성식물의 생물학적 특성, 서식지, 기원 및 진화와 불가분의 관계입니다. 그 중 육종 체계, 분포 범위, 생물 형태, 꽃가루 및 종자 분산 방법이 가장 큰 영향을 미친다[6]. Ge Song et al.의 165속 499종 식물의 알로자임 데이터의 통계적 결과에 따르면. [7], 종 수준에서 Cistanche의 다형성은 약 5{6}}%, 개체군 수준에서 다형성은 약 40%여야 합니다. 약 0.17. 이 실험에서 얻은 다형성 수준은 모두 이러한 평균값보다 낮습니다. 동시에, 멸종 위기에 처한 은빛 전나무[18]의 32%, 왜소한 작약의 22.5%, 보라색 작약의 27.6%와 같은 여러 일반적인 멸종 위기 식물에 대해 RAPD 방법으로 얻은 다형성 유전자좌의 수준과 비교합니다. [9] ] 유전적 다양성이시스탄체 데저티콜라 Cistanche tubulosa의 유전적 다양성은 이미 극히 낮은 반면, 평균 수준보다 약간 낮습니다.
3.2 Cistanche의 유전적 다양성이 낮은 이유
Cistanche는 좁은 사막 지역에 동시에 분포하는 특정 기생 식물입니다. 따라서 독특한 생활 방식과 상대적으로 좁은 생활 공간이 내재적 이유라고 할 수 있습니다.유전 적 다양성Cistanche는 일반적으로 일반 식물보다 낮습니다.
의 차이유전 적 다양성Cistanche Deserticola와 Cistanche tubulosa의 차이는 둘의 분포 범위의 차이와 호스트 분포와 동기화되는지 여부와 관련이 있을 수 있습니다. Cistanche tubulosa의 분포 지역은 Cistanche Deserticola의 분포 지역보다 훨씬 작으며 그 분포는 기주 식물과 매우 일치하지 않습니다. 연구에 따르면 Tamarix 종에는 다양성이 풍부합니다. 예를 들어, Zhang Juan et al. Tamarix sibiricus의 유전적 다양성은 98.7%에 달한다고 보고했다[10]. 반면 Cistanche의 유전적 다양성은 매우 열악하여 장기적 진화를 시사한다. Cistanche tubulosa는 역사상 심각한 병목 현상을 경험하여 많은 양의 손실을 초래할 수 있습니다.유전 적 다양성.
동시에 조사에 따르면시스탄체 데저티콜라인간 정착지에서 20km 이내에서 발굴되어 정상적으로 개화할 수 있었습니다. Cistanche의 크고 작은 구덩이는 특히 Cistanche 관 꽃의 주요 생산 지역에서 발굴되었습니다. 따라서 많은 양의 굴착으로 인해 발생했습니다. 서식지의 출처 부족과 파괴가 인간이 만든 주요 원인일 수 있습니다.유전 적 다양성시탕슈.
3.3 Cistanche의 유전적 분화
신장과 내몽골 사이의 지리적 거리로 인해 지리적 고립으로 인해시스탄체 데저티콜라개체군과 두 개체군은 지역 서식지 조건에 적응하기 때문에 유전적으로 다른 생태형을 형성했습니다. 분포 범위가 좁고 개체군 간의 유전자 교환이 빈번하기 때문에 개체군 간의 유전적 분화가 Cistanche Deserticola보다 적습니다.
3.4 Cistanche 보호를 위한 권장 사항
유전 적 다양성멸종을 피하기 위해 종의 장기 생존을위한 전제 조건입니다. 의 감소유전 적 다양성단기 및 장기적으로 환경 변화에 적응하는 인구의 능력을 감소시킬 것입니다[11]. 따라서 이 희귀하고 귀중한 한약재를 보호하기 위해서는 씨스탄체의 유전적 다양성을 보호하는 것이 매우 중요합니다. Cistanche는 특수한 생태형을 가진 종이기 때문에 주로 현지에서 보호되어야 하며, Cistanche의 유전적 다양성에 따라 자연보호기반이 구축되어야 한다. 예를 들어,시스탄체 튜불로사, 유전적 다양성은 주로 개체군 내에서 발생하기 때문에 Minfeng's Angier 및 Yutian's Daheyan과 같이 유전적 다양성이 큰 개체군이 우선 보호 대상이 될 수 있다[12]. Cistanche의 자연 보호 기지로 등재된다. 에 관해서는시스탄체 데저티콜라, 내몽고와 신장의 인구는 상당한 변화를 겪었으므로 보호 대상 인구를 결정하기 위한 실험적 연구를 더욱 강화해야 합니다. 동시에 Cistanche의 생식 생물학 및 수분 생태에 대한 기초 연구를 수행하여 추가 보호 정보를 제공합니다.
참고문헌
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[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. 희귀하고 멸종 위기에 처한 식물의 보호에 인구 유전학의 원리와 적용. 생물다양성, 1999, 7(4): 340.
출처: 중국 물질 의학 저널; 권. 29, 8호 2004년 8월
