Cistanche Deserticola 다당류는 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 유도하고 산화 스트레스를 줄이며 미백을 촉진합니다
Mar 24, 2022
연락하다:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
이보 Hu1|진화 황1|이샤오 Li2|링 장1|유지 Ouyang1|룬양1|Xiaojiao Zhao1|리화 황3|홍시앙3|Jing Chen1 Qinghai Zeng1
추상적인
색소침착질환의 주범으로 백반증, 무색모반 등의 피부탈색질환이 매우 흔하게 발생하여 더욱 주목받고 있습니다. 탈색의 발병기전은 유전, 자가면역,산화 스트레스s. 그 중 산화 스트레스가 중요한 역할을 합니다. 그러나 산화 스트레스를 다룰 수 있는 임상 치료법은 거의 없습니다. 보고된 바와 같이,시스탄체 데저스티콜라 다당류(CDP)는 효과적인 항산화제입니다. 이를 기반으로 우리는 멜라닌 세포에서의 역할을 평가하고 메커니즘을 추가로 공개했습니다. 이 연구에서 우리는 CDP가멜라닌 생성인간 표피 멜라닌 세포(HEM)와 마우스 흑색종 B16F10 세포에서 제브라피쉬에서도 색소 침착을 유도했습니다. 뿐만 아니라,CDP미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 신호 경로를 활성화한 다음 소안구증 관련 전사 인자(MITF) 및 다운스트림 유전자 TYR, TRP1, TRP2 및 RAB27A의 발현을 상향 조절할 수 있습니다. 그렇지 않으면 CDP가 멜라닌 세포에서 H2O{7}}유도된 세포독성과 세포자멸사를 약화시킬 수 있음을 발견했습니다. CDP가 NRF2/HO{9}} 항산화 경로를 강화하고 세포 내 ROS를 소거할 수 있다는 추가 증거가 있습니다. 요약하면 CDP는멜라닌 생성멜라닌 세포를 예방하고산화스트레스CDP가 멜라닌 세포의 정상적인 상태를 유지하는 데 도움이 됨을 시사합니다. 따라서,CDP탈색소 질환의 치료를 위한 새로운 약물이 될 수 있습니다.
키워드
Cistanche Deserticola 다당류, 색소침착 질환, 멜라닌 세포, 멜라닌 생성, NRF2, 산화 스트레스
신선한시스탄체
1|소개
백반증 및 무색모반과 같은 피부 탈색 질환은 반점 또는 광범위한 피부 탈색이 특징입니다.1 피부 병변이 심각한 신체적 손상을 일으키는 경우는 거의 없지만 환자의 외모에 영향을 미치고 정신 건강 장애까지 심각한 심리적 부담을 줍니다.2 탈색의 주요 병리학적 변화는 멜라닌 합성 및 수송에 큰 영향을 미치는 멜라닌 세포 기능 장애 및 소실을 포함하여 피부에 멜라닌 축적이 불충분하게 됩니다.
탈색과 관련된 메커니즘은 현재 알려져 있지 않지만 연구에 따르면 몇 가지 관련 요인이 확인되었습니다. 한편, 멜라닌 세포 기능은 부분적으로 소안구증 관련 전사 인자(MITF)에 의존하며, 이는 MITF의 발현을 촉진하는 것으로 잘 알려져 있습니다.멜라닌 생성티로시나제(TYR), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2), ras 관련 단백질 Rab{8}}a(RAB27A) 및 파신 액틴 번들링 단백질 1(FSCN1)을 포함한 관련 유전자 ).4 이러한 유전자 중에서 TYR은 l-dopa를 도파퀴논으로 산화시켜 멜라닌 합성에 중요한 역할을 합니다.5 반면에 연구에서는 유전, 환경, 자가면역을 포함하여 멜라닌 세포 손실의 원인이 될 수 있는 여러 요인의 조합을 제시합니다. , 그리고산화 스트레스.6-9 이러한 요인 중 산화 스트레스가 가장 중요한 것으로 간주됩니다.
의 메커니즘산화 스트레스탈색의 원인이 부분적으로 드러났습니다. 활성산소종(ROS) 과부하가 하나의 핵심 요소입니다.10 탈색소의 ROS 과부하는 프로와 항산화 시스템 간의 불균형을 포함합니다.11 이러한 불균형에 참여하는 요소 중 하나는 핵인자 적혈구계 2-관련입니다. 인자 2/항산화 반응 요소(NRF2/ARE) 항산화 경로 손상.12 경로는 NRF2와 헴 옥시게나제(HMOX{11}}, HO{12}})와 같은 항산화 효소로 구성됩니다. , 카탈라제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다제 1(GPX1) 및 NAD(P)H 퀴논 탈수소효소 1(NQO1).13 멜라닌 세포가 과도한 ROS에 노출되면 NRF2가 핵으로 이동하여 보존된 ARE에 결합한 다음 항산화 효소의 발현. 그러나 백반증과 같은 일부 탈색소 질환에서는 손상된 NRF2/ARE 항산화 경로가 ROS를 효과적으로 제거할 수 없습니다.14
탈색에 일반적으로 사용되는 임상 요법에는 국소 또는 전신 코르티코스테로이드, 칼시뉴린 억제제, 협대역 자외선 B(NBUVB, 311nm), 308-nm 엑시머 광, 자가 표피 이식 및 중국 전통 의학(TCM) 요법이 있습니다. 코르티코스테로이드와 칼시뉴린 억제제는 비정상적인 면역 활성화를 감소시킬 수 있으며15 광선 요법이 1차 치료제로 사용됩니다. 특히, NBUVB는 멜라닌 세포 증식과 T 세포 파괴를 자극하고,16 308-nm 엑시머 광은 T 세포 세포 사멸을 유도합니다.17 게다가, TCM 요법의 효과는멜라닌 생성.18 이러한 방법은 어느 정도 탈색을 개선하는 데 도움이 되지만 질병 진행을 통제하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 특히 다음과 같은 새로운 치료법을 개발할 필요가 있습니다.산화 스트레스, 이전에는 무시되었습니다.
Cistanche Deserticola는 '사막 인삼'으로 알려져 있습니다. 19 그 성분은 에탄올로 인한 간 손상 및 장 염증 증식에 유용합니다. 또한 항피로, 항염, 항종양 시약으로도 사용할 수 있습니다.{5}} 최근 Guo et al은 다음과 같이 보고했습니다.시스탄체 데저스티콜라 다당류(CDP)의 주요 성분 중 하나는 항산화 및 간 보호 활성을 가지고 있습니다. 또 다른 두 연구에서 세포를 보호하는 역할을 확인했습니다.산화 스트레스산소-포도당 결핍/재관류 및 골다공증 상태에서의 손상.23,24 그러나 탈색성 질환에서 CDP의 역할은 설명되지 않았습니다. 여기에서 우리는 여부를 확인하는 것을 목표로 삼았습니다.CDP영향을 미칠 수 있다멜라닌 생성산화 스트레스로부터 멜라닌 세포를 보호합니다.
2|재료 및 방법
2.1|화학물질 및 항체
시스탄체 데저스티콜라 다당류(CDP) 및 l-dopa는 Yuanye Biotec(순도 98% 이상, 중국 상하이)에서 구입했습니다. 과산화수소(H2O2), 디메틸 설폭사이드(DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-디메틸티아졸-2-일{8}},5-디페닐테트라졸륨 브로마이드( MTT) 및 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 4% 중성 파라포름알데히드는 Biosharp(중국 허페이)에서 구입했습니다. 및 면역형광 염색 키트(Alexa Fluor 488) 및 2,{15}}디클로로플루오레세인-디아세테이트(DCFH-DA)는 Beyotime Biotec(중국 상하이)에서 구매했습니다. Fontana-Masson Stain Kit 및 Nucleoplasmic Protein Extraction Kit는 Sloarbio(Beijing, China)에서 구입했습니다. 인간 멜라닌 세포 성장 보충제(HMGS), 둘베코 변형 독수리 배지(DMEM) 및 배지 254는 Gibco에서 구입했습니다. 태아 소 혈청(FBS)은 BI(Kibbutz Beit-Haemek, Israel)에서 구입했습니다. -actin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NRF2 및 HO{31}}에 대한 1차 항체는 1차 항체인 Cell Signaling Technology에서 구입했습니다. MITF에 대한 항체는 St John's Laboratory에서, p-MITF에 대한 1차 항체는 Affinity Biosciences에서, GAPDH에 대한 1차 항체는 Bioworld에서, TRP1에 대한 1차 항체는 EMD Millipore에서 구입했습니다.
2.2|세포 배양 및 치료
마우스 흑색종 B16F1{14}} 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제 혼합물이 보충된 배지 DMEM에서 배양했습니다. 인간 표피 멜라닌 세포(HEM)를 인간 포피에서 분리하고(이전 연구25 참조) HMGS, 5% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제 혼합물이 보충된 배지 254에서 배양했습니다. 모든 세포는 5% CO2와 함께 37도의 습식 인큐베이터에서 배양되었습니다. CDP를 DMSO에 녹이고 배지로 희석하여 사용하였으며, DMSO의 최종 농도는 0.1% 미만이었다. H2O2는 사용 전에 배지로 희석하였다.
2.3|Zebrafish 배양 및 치료
제브라피쉬 배아 및 배지는 EzeRinka Biotech에서 구입했습니다. 실험 프로토콜은 Central South University의 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. zebrafish를 12-웰 플레이트에서 빛으로부터 37도 떨어진 곳에서 배양하고 다양한 농도의 CDP로 처리했습니다. 도립 현미경을 사용하여 제브라피쉬의 머리와 꼬리에 있는 멜라닌을 매일 관찰하고 기록했습니다. 관찰 후, 우리는 매체를 변경하고 다시 추가CDP. zebrafish 꼬리의 멜라닌 밀도는 Image J로 측정되었으며 값은 통합 광학 밀도(IOD)로 표시됩니다.
2.4|세포 생존력
세포 생존율은 MTT 분석을 사용하여 측정되었습니다. 의 세포독성을 조사하기 위해CDP, HEM 및 B16F10 세포를 2 × 103 cells/well의 밀도로 96-well plate에 이식하고 세포가 플레이트에 부착될 때까지 배양했습니다. 그런 다음 세포를 다른 농도(0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 및 320ug/mL)로 처리했습니다.CDP24, 48 또는 72시간 동안. 측정 전, 각 웰에 MTT 20㎕를 첨가하고 플레이트를 37도에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상층액을 버리고 각 웰에 DMSO 160 μL를 첨가하여 formazan 결정을 용해시켰다. 490 nm에서의 흡광도 값은 멀티모드 플레이트 리더(PerkinElmer)로 측정하였다. H2O{9}} 유도된 세포독성 조건에서 CDP의 효과를 조사하기 위해 HEM 및 B16F10 세포를 4 × 103 cells/well의 밀도로 {{12}well plate에 도말했습니다. 세포를 다양한 농도로 처리CDP({{0}}, 20, 40 또는 80ug/mL) 24시간 동안 H2O2(최종 농도: HEM의 경우 500μm, B16F10 세포의 경우 1.0mm)를 각 웰에 추가하고 다시 24시간 동안 세포를 배양했습니다. 우리는 CDP 처리 및 음성 대조군(NC) 그룹을 설정했습니다. 탐지 단계는 이전에 설명한 것과 동일합니다.
2.5|멜라닌 함량의 NaOH 분석
세포를 100-mm 페트리 접시에서 배양하고CDP다른 농도(0, 20, 40 및 80 ug/mL)에서 48시간 동안 처리한 다음 트립신으로 소화하고 1.{6}}mL 튜브에 수집합니다. 우리는 이중 증류수로 세포를 두 번 세척하고 1mL 에탄올에 재현탁하고 와동시켜 멜라닌을 방출했습니다. 그런 다음 혼합물을 원심분리(200g, 5분)하고 상층액을 버리고 1mL의 10% DMSO(1mm NaOH 용액으로 희석)를 각 튜브에 첨가하고 침전물을 현탁했습니다. 현탁액을 80도 수조에서 1시간 동안 배양하여 멜라닌을 용해시켰다. 마지막으로 200μL의 액체를 96-웰 플레이트에 옮기고 다중 모드 플레이트 리더를 사용하여 470nm에서 흡광도 값을 측정했습니다.
시스탄체리뷰: 억제멜라닌생산.
2.6|티로시나제 활성 측정
세포를 100-mm 페트리 접시에서 배양하고CDP측정하기 전에 트립신으로 소화하고 1.{1}}mL 튜브에 수집하고 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척합니다. 각 시료에서 106개의 세포를 새 튜브로 옮기고 원심분리 후 상층액을 버리고 0.5% Triton X-100 1ml를 세포 펠렛에 첨가하고 보관했습니다. 15분 동안 0도에서 혼합물. 그 후, 기질로 l-dopa(1mm, 0.1M 인산염 완충액으로 희석) 1mL를 첨가하고 용액을 혼합하고, 혼합물 2{22}}0μL를 00μL로 옮겼습니다. {16}}웰 플레이트를 즉시 웰 플레이트로 옮기고 멀티모드 플레이트 리더기를 사용하여 475 nm에서 흡광도 값(A0)을 측정하고 10분에서 측정을 반복합니다(A10). 티로시나제 활성은 (A{21}}A0)/105로 계산되었으며 결과는 음성 대조군에 대한 백분율(퍼센트)로 표시됩니다.
2.7|폰타나-마손 멜라닌 염색
세포는 50% 밀도에 도달할 때까지 12-웰 플레이트에서 배양되었습니다. 처리 후 세포를 4% 중성 파라포름알데히드로 30분간 고정하고 증류수로 세척하였다. 그런 다음 각 웰에 500μL Fontana 암모니아-은 용액을 추가하고 플레이트를 16시간 동안 어둠 속에서 보관하여 멜라닌을 염색했습니다. 다음으로, 우리는 세포를 증류수로 5회(매회 1분) 세척하고 500μL 차아황산염에 5분 동안 담그었습니다. 마지막으로 차아황산염을 제거하고 다시 증류수로 1분 동안 세포를 헹구었습니다. 그런 다음 도립 현미경을 사용하여 멜라닌을 관찰하고 기록했습니다.
2.8|RNA 추출 및 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응
세포를 6-웰 플레이트에서 배양했습니다. 처리 후, 세포를 트립신으로 분해하고 1.{2}}mL 튜브에 수집했습니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 1mL의 용해 완충액을 첨가하고 혼합물을 vortex하고 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓아 세포를 완전히 용해시켰다. Total RNA Kit(Omega Bio-Tek)를 사용하여 RNA를 추출하고 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO)를 사용하여 역전사(RT)했습니다. 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 KODSYBR qPCR Mix(TOYOBO)를 사용하여 수행되었습니다. RT 혼합물의 반응 부피는 20 μL인 반면 PCR 혼합물의 반응 부피는 20 μL(cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, 프라이머 F 1 μL, 프라이머 R 1 μL, DEPC H2O 20 μL 추가 ). 실험은 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 프라이머의 서열은 표 S1에 나열되어 있습니다.
2.9|단백질 추출 및 웨스턴 블로팅/면역형광
세포를 100-mm 페트리 접시에서 배양했습니다. 처리 후, 세포를 트립신으로 분해하고 1.{2}}mL 튜브에 수집했습니다. 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음 1mm 페닐메틸설포닐 플루오라이드(Thermo Fisher) 및 1:100 희석된 포스파타제 억제제 칵테일(Roche)이 보충된 500μL의 RIPA 용해 완충액(Thermo Fisher)에 추가했습니다. 핵 및 세포질 단백질은 제조업체의 프로토콜에 따라 Nucleoplasmic Protein Extraction Kit를 사용하여 추출되었습니다. 우리는 튜브를 30분 동안 얼음 위에 놓고 5분마다 볼텍싱하여 세포를 완전히 용해했습니다. 세포를 원심분리(200g, 4도, 15분)하고 상층액을 새 튜브로 옮기고 BCA 단백질 분석 키트(KeyGEN Biotec)를 사용하여 총 단백질 농도를 측정했습니다. 단백질을 5x loading buffer(Beyotime Biotec, China)로 100도에서 10분간 끓인 후 -80도에서 보관했습니다. Western blotting은 PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis) 방법을 사용하였고, 각 그룹의 단백질 20ug을 분리하여 polyvinylidene fluoride 막으로 옮겼다. 항원 차단 후 1:1000 희석된 1차 항체에 4도에서 16시간 동안 막을 배양한 후 PBST로 세척하고 1:{24}} 희석된 형광성 2차 항체에 37도에서 1시간 동안 배양하였다. . 형광 강도는 Odyssey CLx 이미징 시스템(LI-COR)을 사용하여 감지되었습니다. 면역형광은 면역형광 염색 키트(Alexa Fluor 488)를 사용하여 1차 항체를 1:100으로 희석하여 수행했습니다.
시스탄체 레딧
2.10|세포 사멸 측정
세포를 {{0}}mm 페트리 접시에서 배양하고 다양한 농도(0, 20, 40 및 80 ug/mL)로 처리했습니다.CDP24시간 동안 H2O2를 첨가하고(최종 농도: HEM의 경우 5{5}}0 μm, B16F10 세포의 경우 1.0 mm) 각 웰에 추가하고 24시간 동안 배양했습니다. 우리는 또한 CDP 처리 그룹과 NC 그룹을 설정했습니다. 처리 후, 우리는 EDTA가 없는 트립신으로 세포를 소화하고 튜브에 수집한 다음 PBS로 세포를 두 번 세척하고 100μL의 PBS에 재현탁했습니다. 프로토콜에 따라 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit로 세포를 염색하고 유세포 분석 (FCM)으로 감지했습니다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 세포자멸사 비율을 분석했습니다.
2.11|세포내 ROS 측정
세포를 {{0}웰 플레이트에서 배양하고 다양한 농도(0, 20, 40 및 80 ug/mL)로 처리했습니다.CDP24시간 동안 H2O2(최종 농도: HEM의 경우 5{5}}0 μm, B16F10 세포의 경우 1.0 mm)를 각 웰에 추가하고 24시간 더 배양하고 CDP 처리 및 NC 그룹을 설정했습니다. 처리 후 PBS로 세포를 두 번 세척하여 모든 배지와 FBS를 제거한 다음 DCFH-DA 프로브를 배지로 1:1000으로 희석하고 각 웰에 첨가했습니다. 37도에서 30분 동안 세포를 배양하고 무혈청 배지로 3번 세척했습니다. 우리는 사용도립 형광 현미경으로 형광을 관찰하고 기록한 다음 ImageJ를 사용하여 형광 강도를 측정했습니다.
2.12|통계 및 분석
본 연구의 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시하였으며, 통계분석은 GraphPad Prism(버전 7.0) 또는 SPSS(버전 22.0)와 Student's 다중 그룹 비교를 위해 t-검정 또는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용했습니다. WB 단백질 밴드의 회색 값은 GAPDH 또는 -액틴으로 표준화되었습니다. P < .05의="" 값은="" 유의미한="" 것으로="" 간주되었습니다.="" 모든="" 실험은="" 적어도="" 세="" 번="">
3|결과
3.1|HEM 및 B16F10 세포에서 CDP 유도 멜라닌 생성
시작하기 전에 MTT 분석을 사용하여 HEM 및 마우스 흑색종 B16F10 세포에 대한 CDP의 잠재적 세포독성을 조사했습니다. 세포는 다음과 같이 처리되었습니다.CDP24, 48 또는 72시간 동안 다른 농도에서. HEM 생존력 테스트는 농도가 320ug/mL보다 낮을 때 CDP가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나 24, 48 및 72시간에 농도가 320ug/mL에 도달함에 따라 생존력이 크게 감소했습니다(P < .05,="" 그림="" 1a).="" b16f10="" 세포의="" 생존력도="" 48시간과="" 72시간에="">CDP320ug/mL(P <.01)에 도달했지만="" 더="" 낮은="" 농도에서는="" 변화가="" 보이지="" 않았습니다(그림="" 1b).="" 그런="" 다음="" 우리는="" 사전에="" cdp의="" 역할을="">멜라닌 생성HEM에서 멜라닌 세포 자극 호르몬( -MSH, 농도: 20, 1{9}}0 및 400 nm) 및 DMSO(0.1%)의 효과와 그 효과를 비교했습니다. 멜라닌 염색, 티로시나제 활성 및 멜라닌 함량 분석의 결과는 CDP가 멜라닌 생성 촉진에 대해 -MSH와 비슷하지만 0.1% DMSO 처리는 차이가 없음을 시사했습니다(그림 S1).
이에 따라 탐색을 더욱 구체화했습니다. HEM은 다음으로 처리되었습니다.CDP48시간 동안 다른 농도(20, 40 및 80ug/mL)에서; 멜라닌 염색, 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성 분석이 수행되었으며, 모두 80 ug/mL 그룹에서 정점을 이루는 농도 의존적 방식으로 CDP 처리 후 상당한 증가를 보였다(P < .05,="" 그림="" 2a-c).="" 그런="" 다음="" 우리는="" 의="" mrna와="" 단백질="" 수준을="">멜라닌 생성관련 유전자(MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A 및 FSCN1). CDP는 HEM에서 해당 유전자의 mRNA 수준을 유의하게 증가시켰습니다(P < .05,="" 그림="" s2a).="" 게다가,="" mitf,="" tyr,="" trp1="" 및="" rab27a="" 단백질의="" 수준은="" 총="" mitf에="" 대한="" 인산화된="" mitf의="" 비율(p=""><.05)과 마찬가지로="" 증가했지만="" trp2와="" fscn1은="" 차이가="" 없었습니다(그림="" 2d,e).="" 결과는="" cdp가="" 인간="" 멜라닌="" 세포에서="" 멜라닌="" 생성을="" 촉진하고="" 멜라닌="" 생성="" 관련="" 유전자의="" 발현을="" 상향="" 조절할="" 수="" 있음을="">
또한, 우리는CDP다시 B16F10 세포로 분석한 결과 B16F10 세포의 멜라닌 함량이 크게 증가했음을 발견했습니다(P < .01,="" 그림="" s2b).="" 게다가,="" cdp는="" 단백질의="" mrna="" 수준을="" 유의하게="">멜라닌 생성관련 유전자(P < .05; 그림 S2C)와 MITF, TYR, TRP1, TRP2 및 RAB27A의 단백질 수준도 CDP 처리 후 증가했습니다(P < .05, 그림 S2D-E).
그림 1 HEM 및 B16F10 세포에서 CDP의 세포독성.
3.2|CDP는 zebrafish에서 멜라닌 생성을 촉진했습니다.
여부를 조사하기 위해CDP촉진할 수 있다멜라닌 생성생체 내에서 우리는 zebrafish 배아를 사용했습니다. 제브라피쉬 배아를 4개의 그룹으로 나누고 다양한 농도(20, 40 및 80 ug/mL)의 배지 단독(NC) 또는 CDP로 연속적으로 처리했습니다. 멜라닌 과립의 밀도와 분포를 매일 관찰하고 기록하였다. 제브라피쉬 배아가 성장함에 따라 머리와 꼬리에서 멜라닌 밀도가 점차 증가하는 것을 발견했습니다. 3일째에는 그룹간 차이가 뚜렷하게 나타났고, 6일째에 실험을 종료할 때까지 그 차이는 계속해서 증가했습니다(그림 3A). Image J를 사용하여 zebrafish 꼬리의 멜라닌 밀도를 측정했습니다. CDP 처리군의 멜라닌 밀도는 대조군보다 유의하게 높았다(P < .05,="" 그림="">
3.3|HEM 및 B16F10 세포에서 CDP 활성화 MAPK 신호 경로
하는 메커니즘을 밝히기 위해CDP승진멜라닌 생성, 우리는 48시간 동안 다른 농도(20, 40, 80 ug/mL)의 CDP로 HEM을 처리한 다음 MAPK 신호 전달 경로에서 ERK, JNK 및 p38 단백질의 인산화 및 총 수준을 조사했습니다. Western blotting으로 측정한 바와 같이, p-ERK, p-JNK 및 p-p38 수준은 CDP 처리 후 증가했지만(P <.05), 이들의="" 총="" 수준은="" 변경되지="" 않았습니다(그림="" 4a,="" b).="" 실험은="" b16f10="" 세포로="" 반복되었고="" erk,="" jnk="" 및="" p38="" 단백질의="" 인산화된="" 수준은="" 증가했지만(p="">< .05),="" 총="" mapk="" 수준은="" 변경되지="" 않았으며(그림="" 4c,="" d),="" 결과와="" 일치합니다.="">
3.4|CDP 약독화 H2O{3}} HEM 및 B16F10 세포에서 세포독성 및 세포자멸사 유도
우리는 산화 스트레스 환경을 시뮬레이션하기 위해 H2O2를 사용했으며 산화 스트레스 하에서 멜라닌 세포에서 CDP의 역할을 추가로 탐구했습니다. HEM에 사용된 H2O2의 최종 농도는 5{8}}0 μm인 반면 B16F10 세포의 최종 농도는 1.0 mm였습니다. H2O 유도 세포독성에 대한 CDP의 효과를 조사하기 위해{10} HEM과 B16F10 세포를 다음으로 전처리했습니다.CDP다른 농도(20, 40 및 80 ug/mL)에서 24시간 동안 처리한 다음 H2O2를 첨가하고 관찰 및 MTT 분석을 수행하기 전에 24시간 동안 계속 처리했습니다.
H2O2는 HEM에서 명백한 막 수포와 세포 수축을 일으켰고 CDP 전처리 그룹에서는 상황이 완화되었습니다. CDP 단독 치료는 효과가 없었습니다(그림 5A). MTT 분석은 H2O2 처리가 HEM 생존력을 감소시킨 반면 CDP는 이러한 유해한 영향을 유의하게 개선했다는 유사한 결과를 보여주었습니다(P < .01).="">CDP단독으로는 차이가 없었습니다(그림 5C). 그런 다음 B16F10 세포에서 보호 효과를 다시 확인했습니다. H2O2 처리는 B16F10 세포에서 CDP에 의해 개선된 반면, 명백한 막 수포와 세포 수축을 유도했습니다(그림 5B). 한편, MTT 분석은 B16F10 세포 생존율이 H2O2 처리 후 감소했지만 CDP 전처리군에서 상황이 유의하게 개선되었음을 보여주었다(P < .05;="" 그림="">
또한 FCM을 사용하여 HEM 및 B16F10 세포의 H2O{1}유도 세포자멸사를 측정했습니다. 결과는 H2O2가 HEM과 B16F10 세포에서 유의한 세포자멸사를 유발했지만,CDP다른 농도에서 apoptosis를 상당히 감소시킬 수 있습니다. 그렇지 않으면 CDP 처리만으로는 차이가 없었습니다(그림 5E, F). 세포 사멸 속도는 H2O2 처리 후 증가했지만 CDP 전처리 그룹에서 감소했으며 변화는 HEM과 B16F10 세포 모두에서 유의했습니다(P < .05,="" 그림="" 5g,="">
그림 2 CDP는 HEM에서 멜라닌 생성을 촉진합니다.
3.5|HEM 및 B16F10 세포에서 CDP 소거 H2O2- 유도 세포 내 ROS
의 메커니즘을 조사하기 위해CDPH2O{1}}유도 세포독성 및 세포자멸사를 감소시키기 위해 DCFH-DA 형광 프로브를 사용하여 HEM 및 B16F10 세포에서 세포내 ROS를 추가로 검출했습니다. 처리는 위에서 설명한 것과 동일하며, 형광 강도는 ROS 수준을 나타내기 위해 측정되었습니다. HEM에서 관찰한 바와 같이, H2O2 처리는 ROS를 높이는 데 효과적이었지만 CDP는 H2O{8}} 처리된 그룹에서 세포내 ROS를 유의하게 소거했습니다(P < .01;="" 그림="" 6a,="" c).="" 게다가="" cdp만="" 사용해도="" 별="" 차이가="" 없었다.="" 우리는="" b16f10="" 세포에서="" 결과를="" 재확인했습니다.="" b16f10="" 세포에서="" cdp="" 단독="" 처리는="" ros="" 수준에="" 영향을="" 미치지="" 않은="" 반면="" h2o2="" 처리는="" ros="" 수준을="" 분명히="" 증가시켰지만="" 이="" 변화는="" cdp="" 전처리에="" 의해서도="" 유의하게="" 감소했습니다(p="">< .05;="" 그림="" 6b,="">
3.6|멜라닌 세포에서 CDP 상향 조절된 NRF2/HO-1 항산화 경로
CDP가 ROS를 소거하는 메커니즘을 추가로 밝히기 위해 먼저 B16F10 세포에서 NRF2/HO{1}} 항산화 경로의 단백질 수준을 측정했습니다. CDP 단독 처리는 NRF2 및 HO{6}} 단백질에 유의한 영향을 미치지 않았지만 H2O2-처리 그룹에서는 이 두 단백질의 수준이 유의하게 증가했으며CDP전처리는 고도를 더욱 향상시켰습니다(p<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDP핵의 형광이 세포질의 형광보다 강하고 분포가 세 가지 CDP 농도에서 가까웠음을 알 수 있듯이 몇 가지 차이점을 보여주었습니다(그림 7C).
그림 3 CDP는 제브라피쉬에서 멜라닌 생성을 촉진합니다.
4|토론 및 결론
이 연구에서 우리는 의 역할을 조사했습니다.CDPHEM 및 B16F10 세포에서. 처음으로 우리는 CDP가 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 촉진하고 제브라피쉬에서 색소 침착을 촉진할 수 있음을 발견했습니다. 후속 실험은 MAPK 신호 전달 경로가 CDP 처리 하에서 활성화되었음을 보여주었다. 우리는 추가로 그 역할을 조사했습니다.산화 스트레스CDP가 멜라닌 세포에서 H2O{1}} 유도된 세포독성 및 세포자멸사를 약화시킬 수 있음을 발견했습니다. 한편, CDP는 산화 스트레스 조건에서 NRF2/HO{3}} 항산화 경로를 활성화하고 세포 내 ROS를 소거할 수 있습니다.
Mitogen-activated protein kinase는 MITF의 발현을 촉진하는 주요 전사 인자인 MITF의 조절에 관여하는 중요한 경로입니다.멜라닌 생성관련 유전자 및 결과적으로 멜라닌 합성 및 수송에 영향을 미칩니다.26,27 우리 연구에서 멜라닌 세포에서 ERK, JNK 및 p38의 활성화가 CDP 처리 후 유의하게 증가했습니다. 한편, MITF/p-MITF 및 MITF 구동 TYR, TRP1, TRP2 및 RAB27A의 발현은 그에 따라 상향 조절되었습니다. 따라서 우리는 CDP가멜라닌 생성MAPK 경로 활성화를 통해CDPMAPK 활성화는 알 수 없습니다. 최근 연구에 따르면 톨 유사 수용체 4(TLR4)는 멜라닌 세포에서 고도로 발현되며멜라닌 생성.28,29 TLR4는 지질다당류(LPS)30에 특이적으로 결합할 수 있는 중요한 막횡단 단백질입니다. 연구에서는 LPS가 멜라닌 생성을 유도할 수 있다고 보고했습니다.29 흥미롭게도 식물이나 버섯에서 추출한 여러 다당류는 TLR과 MAPK 및 핵 인자 카파 베타(NF-κB)와 같은 다운스트림 신호 전달 경로를 활성화한 것으로 보고되었습니다.31,32 따라서 우리는CDPTLR에 의해 인식되고 결합될 수 있으며, 그런 다음 다운스트림 MAPK 신호 전달 경로를 활성화하고멜라닌 생성. 또한, 뉴클레오티드 결합 올리고머화 도메인 유사 수용체(NLR)는 세포 내 리간드를 인식하고 MAPK 및 NF-κB 신호 전달 경로의 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있습니다. NLR에 영향을 미칩니다.35,36 따라서 CDP가 멜라닌 세포에 들어가 NLR을 통해 MAPK 신호 전달 경로를 조절할 수 있습니다. 그러나 이 가설을 검증하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.
현재까지 일부 연구에서는 멜라닌 생성을 억제하기 위해 멜라닌 생성에 허브 다당류를 적용했다고 보고했습니다.37,38 그러나 이 연구에서는CDP승진멜라닌 생성멜라닌 세포에서, 이 효과는 -MSH와 비교한 후에 더 확인되었습니다. CDP도 허브에서 추출한 다당류의 일종으로, CDP의 반대 효과는 CDP와 다른 다당류의 구조적 차이와 관련이 있을 것으로 생각됩니다. 다당류는 단당류의 중합에 의해 형성되지만 단당류 유형, 단당류 조성, 글리코시드 결합, 측쇄 구조 및 분자량이 다양합니다39,40; 이러한 요소는 생물학적 기능을 결정하는 것으로 생각됩니다.41 기존 연구에서는 다음의 구조를 제안했습니다.CDP그리고 CDP 구조가 그 기능에 연속적으로 영향을 미친다고 제안했습니다.42 따라서 CDP를 완전히 이해하고 우리의 가설을 확인하려면 더 많은 증거가 필요합니다.
멜라닌 생성자외선 손상에 저항하고 신체 항상성을 유지하는 중요한 보호 메커니즘입니다. 동시에 멜라닌 세포는 ROS 과부하와 같은 불리한 환경에 쉽게 노출됩니다.11 ROS가 멜라닌 생성 촉진에 참여하는 것으로 알려져 있으며, 그 중 하나가 MAPK를 활성화하는 것입니다. ROS 과부하가 손상되는 동안멜라닌 생성상당히.45ROS, MAPK 및 멜라닌 생성 사이의 관계는 조건에 따라 다양하므로 pro-oxidant 시스템과 항산화 시스템 사이의 균형이 분명히 중요합니다. 백반증과 같은 탈색소 질환에서 불균형한 항산화 시스템과 제어할 수 없는 ROS 과부하는 멜라닌 세포를 손상시키고 세포 생존력을 감소시킵니다.11,46 이 연구에서 우리는 세포의 ROS 과부하를 시뮬레이션하기 위해 다양한 농도의 H2O2를 사용했으며 HEM은 B16F10 세포보다 H2O2. 멜라닌 세포에 H2O2 처리를 하면 생존력과 세포 사멸률이 악화되지만 CDP 전처리는 이러한 경향을 부분적으로 역전시킬 수 있습니다. 동시에 ROS가 청소되었습니다. 보고된 바와 같이 NRF2/ARE 항산화 경로 활성화는 피부 세포에서 ROS 소거의 주요 방법입니다.14 우리의 실험에서 멜라닌 세포에서 NRF2와 H2O{16}}의 단백질 수준은 CDP 없이 H2O2 처리 후에 상향 조절되었습니다. 이는 H2O가{21}유도산화 스트레스NRF2/HO-1 경로를 활성화할 수 있지만 산화 환원 균형을 유지하고 세포를 손상으로부터 보호하기에는 충분하지 않습니다. 그러나 CDP 전처리는 NRF2/HO{3}} 항산화 경로를 강화하고 균형을 회복했습니다. 따라서 우리는 CDP가 NRF2/HO{5}} 항산화 경로를 활성화하고 ROS를 소거함으로써 산화 스트레스 손상으로부터 멜라닌 세포를 보호할 수 있다고 제안합니다.
우리는 그것을 발견했다CDP치료만으로는 멜라닌 세포의 ROS 또는 NRF2/HO{1}}에 영향을 미치지 않습니다. 이 결과는 CDP가 아래의 산화환원 균형에 영향을 줄 수 있음을 시사합니다.산화 스트레스, 그러나 정상적인 조건은 아닙니다. 또한 NRF2/HO{1}} 항산화 경로는 PI3K, NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로에 의해 조절되는 것으로 보고되었습니다.47,48 우리 연구에서 CDP는 MAPK 신호 경로를 활성화할 수 있었습니다. CDP는 상향 조절 MAPK를 통해 NRF2/HO{7}} 경로를 활성화할 수 있습니다. Slominski가 보고한 바와 같이 멜라닌 세포는 조절 네트워크에 관여하는 스트레스 센서이며 그 기능은 환경에 따라 빠르게 변할 수 있습니다.49 우리는 CDP의 역할이 멜라닌 세포 상태에 영향을 받으며멜라닌 생성정상적인 조건에서는 항산화 시스템에 영향을 미치지 않고 산화 스트레스 조건에서는 산화 환원 균형을 회복합니다. 따라서 멜라닌 세포의 기능과 생존은 CDP에 의해 두 가지 다른 방식으로 유지될 수 있습니다. CDP는 멜라닌 세포가 항상성을 유지하는 데 도움이 되며 이는 멜라닌 세포의 중요한 기능이기도 합니다.멜라닌 생성.50,51
결론적으로,CDPMAPK 신호 전달 경로를 활성화하여 멜라닌 세포의 멜라닌 생성을 촉진할 수 있습니다. CDP는 NRF2/HO{1}} 항산화 경로를 활성화하고 세포 내 ROS를 소거하여 멜라닌 세포 생존을 향상시킬 수 있습니다.산화 스트레스정황. 우리의 발견은 CDP가 둘 다 촉진할 수 있음을 보여주기 때문에 의미가 있습니다.멜라닌 생성멜라닌 세포 기능 장애 및 손실의 원인이 될 수 있는 산화 스트레스 손상으로부터 멜라닌 세포를 보호합니다. 이 연구의 결과는 CDP가 색소 침착 질환의 치료에 새로운 약물이 될 수 있음을 나타냅니다.