Cistanche Deserticola 다당류는 장내 식물에 영향을 미치고 톨-유사 수용체 4/핵 인자 -κB 신호 전달 경로를 억제함으로써 마우스에서 당뇨병 성 신장 병증을 약화시킨다.
Nov 05, 2024
초록 :이 연구의 목표는 개선 효과를 조사하고Cistanche Deserticola 다당류의 잠재적 메커니즘 (CDP)~에당뇨병 성 신장 병증 (DN)생쥐에서. DN 마우스 모델은 스트렙토 조 토신 (STZ)의 복강 내 주사와 결합 된 고지방식이 (HFD) 수유에 의해 확립되었다. 36 개의 C57BL/6N 수컷 마우스는 무작위로 6 개의 그룹으로 나뉘었다 (각각 n=6). 모든 그룹을 증류수 (대조 및 모델), 다 파글 리플로 진 또는 CDP로 4 주 동안 경구 투여 하였다. 생리 지수의 변화, 신장 기능,염증 인자장내 미생물 총을 평가 하였다. 결과는 CDP가 일반적인 상태를 상당히 개선하고신장 조직 병리학 적 변화, 그리고혈당 수준을 줄였습니다, 요로 단백질그리고염증 인자DN 마우스에서. 또한, CDP는 장내 미생물 총의 균형에 영향을 미치고, 유익한 박테리아의 풍부함을 증가시키고 잠재적 병원성 박테리아를 감소시켜 장벽 기능을 개선시켰다. CDP는 또한 톨-유사 수용체 4/핵 인자 -κB (TLR4/NF-κB) 신호 전달 경로의 활성화를 억제하였고, 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)의 방출을 감소시켰다. 결론적으로, CDP는 장 미생물 총에 영향을 미치고 염증 신호 전달 경로를 억제함으로써 마우스에서 DN에 대한 개선 효과를 나타낸다. 이 발견은 DN의 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
키워드 : Cistanche Deserticola 다당류;당뇨병 성 신장 병증; 장 장벽; 장내 식물; 톨-유사 수용체 4; 핵 인자 -κB
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당뇨병 신장 병증 (DN)말기 신장 질환의 주요 원인이며 환자의 생명과 건강을 심각하게 위협합니다 [1]. 연구에 따르면 장내 식물의 불균형은 DN으로 발전하는 당뇨병 과정에서 중요한 병원성 역할을한다는 것을 확인했습니다 [2-3]. "Gut-Kidney Axis"이론은 장 미세 환경의 변화가 장내 식물 군의 대사 산물을 직접 조절함으로써 만성 신장 질환의 진행에 영향을 줄 수 있다고 생각합니다 [2-3]. 장내 식물상은 DN 마우스 모델에서 신장 기능을 조절하는 데 중요한 역할을합니다 [4-5]. "Gut-Kidney Axis"에 대한 심층적 인 연구는 DN의 발병 기전을 명확하게하고 예방 및 치료를위한 새로운 목표를 발견하는 데 도움이 될 것입니다.
Cistanche Deserticola는 Cistanche Deserticola, Dijing, Jinsun 등으로 알려진 전통적인 약용 및 식용 식물로, 일반적으로 Dayun으로 알려져 있으며 "Desert Ginseng"으로 명성을 얻었습니다 [6]. 중화 인민 공화국의 약물증에 따르면, Cistanche Deserticola는 Cistanche Deserticola yc ma 또는 C. tubulosa (Schenk) Wight의 비늘이있는 잎이있는 말린 다육질 줄기입니다.
그 중에서도 Cistanche Deserticola는 약과 음식으로 오랫동안 사용해 온 역사를 가지고 있습니다. Cistanche Deserticola는 달콤하고 짠맛, 자연이 따뜻하며 신장과 대장 자오선으로 들어갑니다. 그것은 신장 양조, 에센스와 혈액에 도움이되고, 내장에 촉촉하고 변비를 완화시키는 영향을 미칩니다 [7-8]. 다당류는 Cistanche Deserticola의 주요 활성 성분 중 하나입니다. Cistanche Deserticola Water Extract에서 다당류의 함량은 상대적으로 높다. 주로 포도당, 갈락토스, 람 노스, 아라비 노스 및 과당과 같은 단당류로 구성됩니다. 면역 활동 조절, 노화 방지, 학습 및 기억 개선, 신경 보호, 간 손상, 바이러스 백신 및 항 종양에 저항하는 것과 같은 많은 약리학 적 효과가 있습니다 [9-12]. 연구 그룹의 이전 연구에 따르면 Cistanche Deserticola Water Extract는 DN에 잠재적 인 치료 효과가있는 것으로 나타났습니다 [13]. 이를 기반으로,이 실험은 DN을 처리하는 데있어 CDP의 역할에 대한 과학적 기초를 제공하기 위해 마우스에서 DN을 개선하고 신장 기능을 회복시키는 데 시티 치스 데스 세르 콜라 다당류 (CDP)의 효과를 연구하기위한 출발점으로 장내 식물과 염증 반응을 취했다.
1 재료 및 방법
1.1 동물, 재료 및 시약
36 6- 주간 C57BL/6J 수컷 생쥐는 Xinjiang Medical University의 동물 실험 센터에서 구입했습니다. 윤리 해결 번호 : IACUC -20210331-04.
사막 CDP (다당류 질량 분획 ＞ 80%, 배치 수 : 2306019) Shaanxi Xintianyu Company; Dapagliflozin (Dapa; 배치 번호 : 2108119) Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.; 소변 총 단백질 (소변 총 단백질, UTP; 배치 수 : C 035-2-1), 우레아 질소 (혈액 요소 질소, Bun; 배치 번호 : C 013-2-1), 크레아티닌, 크레아 인; 배치 번호 : C 011-2-1), uric acid, ua; batch NUT. Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; LIPOPOLYSACCHARIDE (LPS; 배치 번호 : YX -121619 M), Interleukin -6 (IL -6; 배치 번호 : YX-E20012), IL -1 (배치 번호 : YX-E20533), 변환 성장 인자- (TGF-; BATCH : YX-E20217), 종양 괴사 인자- (TNF-; 배치 번호 : YX-E20220) 키트 상하이 YouXuan Biological Co., Ltd.; 강화 된 화학 미 닌스 신센 (ECL) 키트 베이징 Pulilai Gene Technology Co., Ltd.; Streptozotocin (STZ; 배치 번호 : 20230503), 고지 방식식이 (60% 지방 비율 고지방식이 정제 유형, 재료 번호 : Boaigang12492m) Beijing Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
기본 사료 (22% 옥수수 밀가루, 12% 밀기, 18% 오일 잔류 물, 8% 어류 식사, 12% 대두 식사, 0. 17% 소금, 0. 25% 비타민, 0. 신장 의과 대학.
1.2 기기 및 장비
AE240 분석 균형, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Switzerland; DHG -9053 전기 가열 블라스트 건조 오븐, 상하이 Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; DK-S22 일정한 온도 수조, 상하이 징선 실험 기기 Co., Ltd.; 3-18 KS 고속 저온 원심 분리기, Sigmaaldrich, USA; BS -380 완전 자동 생화학 분석기, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; EM KMR3 슬라이서, HI1220 슬라이서, Leitz Optilux 디지털 현미경, Leica, 독일; 불소 E 화학 발광 영상화 시스템, 단백질 심플, 미국.
1.3 방법
1.3.1 동물 실험
36 C57BL/6J 수컷 마우스를 Xinjiang Medical University의 SPF 실험실에서 공급하고 자유롭게 먹였다. 실험은 7 일의 적응 형 공급 후에 수행되었다. 6 마리의 마우스를 정상 (대조군) 그룹으로 무작위로 선택하고 기본식이를 제공 하였다. 나머지 실험 그룹은 고지방식이를 먹이고 별도의 케이지에 보관했습니다. 체중은 일주일에 한 번 테스트되었습니다. 생쥐는 무료로 먹고 마실 수있었습니다. 6 주간의 고지 방식이식이 급식 후, 실험 그룹 마우스에 매일 무료 고지 방식이 외에도 5 일 연속으로 STZ 4 0 mg/kg를 복강 내 주사 하였다. 모델링 후 공복 혈당은 11.1 mmol/L이었으며, 이는 당뇨병의 성공적인 모델로 간주되었습니다. 성공적인 모델링을 갖는 30 마리의 마우스는 각 그룹의 6 개의 마우스, 즉 모델 (증류수 + 고지 방식이, 모델) 그룹, DAPA (DAPA 4 mg/kg + 고지방식이, DAPA) 그룹, CDP 저용량 (50 mg/kg + 고지방식이, CDPS-L) 그룹, CDPS 중간식이 (100 mg/kg + high-fut-mos-dos-mos-dos and and and and and grous-in, cd + kg-m). CDPS 고용량 (200 mg/kg + 고지방식이, CDPS-H) 그룹. 대조군 (증류수 + 정상식이)에게 동일한 양의 증류수를 제공 하였다. 각 마우스를 총 4 주 동안 0.1 mL/10 g, 동시에 동시에 한 번, 총 4 주 동안 동시에 장착 하였다. 마우스의 체중 및 혈당 변화는 매주 기록되었다.
1.3.2 지수 결정
4 주간의 위장 투여 후, 소변 샘플 (24 시간) 및 신선한 대변을 4 주 말에 대사 케이지를 통해 수집하고 각각 -20 학위 및 -80 학위에 저장 하였다. 마우스를 금식했지만 12 시간 동안 급수하지 않았다. 다음날, 마우스의 공복 체중을 측정 하였다. 마우스를 3 mL/kg의 10% 염소 수화물 용액의 복강 내 주사에 의해 마취시켰다. 궤도에서 혈액을 수집하고 원심 분리기 (4도, 3 500 r/min)에 15 분 동안 원심 분리 하였다. 상청액을 흡인, 포장 및 나중에 사용하기 위해 -80 정도 냉장고에 저장 하였다. 혈청은 키트에 따라 BUN, CRE, UA, IL -6, IL -1, TGF-, TNF- 및 LPS에 대해 측정되었습니다. 키트에 따라 24 시간 UTP에 대해 소변을 측정 하였다.
1.3.3 신장 및 장의 형태 학적 및 병리학 적 관찰
1.3.3.1 신장 계수 결정
혈액 수집 후, 마우스를 과다 복용에 의해 마취시키고, 신장과 콜로를 완전히 제거하고 즉시 미리 냉각 된 식염수로 헹구고, 여과지에 배수하고 무게를 측정 하였다. 신장 계수는 다음 공식에 따라 계산되었다 : 신장 계수/%= × 100 m1m, 여기서 M1은 신장/g의 습한 중량; M은 마우스/g의 체중이다.
1.3.3.2 신장의 병리적 관찰
마우스 신장은 4% 파라 포름 알데히드 고정 장치에 고정시키고, 에탄올 용액 구배에 의해 탈수되고, 자일렌에 의해 투명하고, 파라핀에 매립되고, 얇게 썬 (두께 2 μm), 자일렌에 의해 탈 웬트, 그리고 에탄올 용액 구배에 의해 수화 된 후, 헤마 톡실 & 유신 (H & E), 대상자), 대상자, 및 대상으로 스테이 팅된다. 밀봉되고 이미지를 현미경으로 수집하고 관찰 하였다.
1.3.3.3 장 병리학 적 관찰
마우스 장을 4% 파라 포름 알데히드 고정 장치로 고정시키고, 에탄올 용액 구배로 탈수시키고, 자일렌으로 투명하고, 파라핀에 매립하고, 슬라이스 (두께 2 μm), 자일 렌으로 탈 웬트를 뿌린 다음 에탄올 구배로 수화 된 후 H & E 및 Alcian Blue (AB)로 수분을 냈다. 관찰.
1.3.4 장내 식물 조성의 분석
대조군, 모델 그룹 및 CDPS-H 그룹에서 마우스의 결장 함량은 16S rRNA 유전자 고 처리량 시퀀싱에 의해 검출되었다. 결장 내용물에서 미생물의 DNA 추출 및 라이브러리 구성 및 시퀀싱은 Lianchuan Biotechnology Co., Ltd.에 의해 완료되었으며, 얻은 데이터는 Lianchuan Cloud 플랫폼에서 분석되었다.
1.3.5 신장 및 결장 관련 단백질 발현의 검출
마우스 신장 및 결장 조직 단백질을 추출하고, 단백질을 비신 코닌산 단백질 정량화 방법에 의해 정량화 하였다. 단백질 변성 후, 단백질은 -20 정도 냉장고에 저장되었다. 10% 소듐 도데 실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동, 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 막 전이, 막을 트리스 완충 식염수에 위치시켰다. 발각
톨-유사 수용체 (TLR) 4, 핵 전사 인자 (NF) -κB P65, P-NF-κBP65 및-액틴에서 신장 조직 (항체 희석 1 : 2 000 (V/V) (TBST 용액) 및 ZONULA CCCLUDENS -1에 대한 1 차 항체. 결장 조직에서 (Zo -1) (Zo -1) (TBST 용액으로 1 : 1 000 (V/V)를 4도에서 인큐베이션 하였다. TBST 희석, 2 차 항체 (항체
TBST 용액 1 2 000 (v/v))로 희석 된, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, TBST로 3 회 세척 한 다음, ECL 발광 시약을 첨가하여 검출 한 다음 겔 영상화를 사용하여 단백질 발현을 검출 하였다. -액틴은 내부 기준으로 사용되었고 단백질 그레이 값은 ImageJ 소프트웨어로 분석되었습니다. 각 그룹의 단백질 발현은 대조군의 회색 값의 상대 값으로 표현되었다.
1.4 데이터 통계
모든 데이터 결과는 ± S로 표현되었고, SPSS 21. 0은 통계 분석에 사용되었다. 연속 데이터의 경우, 정규 분포를 따르는 경우, 그룹 간 비교에 일원 분산 분석이 사용되었습니다. 그룹 간의 차이가 통계적으로 유의 한 경우, 칠면조 방법은 쌍별 비교에 추가로 사용되었다; 데이터가 정규 분포에 따른 경우, Kruskal-Wallis H 테스트는 그룹 간 비교에 사용되었습니다. 그룹간에 통계적 차이가 있었을 때, Durbin의 가장 유의 한 차이 방법이 다중 비교에 추가로 사용되었습니다. p <0. 05는 차이가 통계적으로 유의하다는 것을 나타냅니다.
2 결과 및 분석
2.1 CDP의 혈당, 체중 및 신장 계수 C57BL/6J
대조군과 비교하여 표 1 내지 3에서 볼 수 있듯이, 모델 그룹에서 마우스의 공복 혈당이 상당히 증가했다 (P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.
표 1 마우스의 혈당에 대한 CDP의 효과 (n=6)
| 그룹 | 시간/주 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 제어 | 7.98±0.55 | 7.32±0.40 | 7.58±0.50 | 7.38±0.87 | 7.28±0.34 |
| 모델 | 10.62±2.79# | 20.32±2.69# | 24.47±4.18# | 24.92±3.98# | 20.33±2.96# |
| CDPS-L | 16.03±2.97 | 21.83±4.81 | 20.13±6.97 | 23.30±3.77 | 21.25±1.65 |
| CDPS-M | 13.17±3.59 | 22.6±5.88 | 19.35±4.45 | 22.6±4.87 | 18.38±1.20 |
| CDPS-H | 11.07±1.74 | 21.53±3.71 | 21.57±6.19 | 17.43±2.05** | 15.87±0.90** |
| DAPA | 10.28±4.75 | 21.12±4.96 | 17.72±2.00** | 17.35±2.00** | 14.55±1.06** |
단위 : mmol/l
표 2 마우스 신장 지수에 대한 CDP의 효과 (n=6)
| 그룹 | 제어 | 모델 | CDPS-L | CDPS-M | CDPS-H | DAPA |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 신장/체중 % | 0.98±0.04 | 1.69±0.17## | 1.42±0.12 | 1.37±0.10* | 1.28±0.10** | 1.18±0.10** |
표 3 마우스의 체질량에 대한 CDP의 효과 (n=6)
| 그룹 | 시간/주 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 제어 | 28.57±0.82 | 28.75±0.97 | 28.70±0.79 | 29.10±1.24 | 29.32±1.35 |
| 모델 | 24.53±1.25## | 24.92±1.20## | 24.35±1.39## | 24.82±1.22## | 24.73±1.56## |
| CDPS-L | 25.75±0.69 | 24.77±0.91 | 24.83±0.99 | 25.10±0.83 | 25.42±0.97 |
| CDPS-M | 25.10±0.56 | 25.00±0.54 | 24.68±0.48 | 25.13±0.62 | 25.25±0.58 |
| CDPS-H | 25.38±0.28 | 25.43±0.49 | 25.52±0.62 | 25.73±0.50 | 26.08±0.34* |
| DAPA | 25.13±1.02 | 25.52±0.98 | 25.97±1.00* | 26.25±0.63* | 26.63±0.78* |
2.2 C57BL/6J 마우스의 신장 기능에 대한 CDP의 영향
표 4에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, 혈청의 BUN, CRE 및 UA 농도 및 모델 그룹에서 마우스의 소변에서 24 시간 UTP 질량 농도를 유의하게 증가시켰다 (P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).
DN 마우스에서 BUN, CRE, UA 및 24 H UTP에 대한 CDP의 영향 (n=6)
| 그룹 | 롤빵 농도 (MMOL/L) | CRE 농도 (μmol/L) | 24H UTP 함량 농도 (mg/ml) | UA 농도 (μmmol/L) |
|---|---|---|---|---|
| 제어 | 47.51±7.32 | 12.80±1.36 | 1.32±0.12 | 103.9±18.59 |
| 모델 | 157.97±30.57## | 44.85±4.36## | 2.38±0.37## | 500.43±81.06## |
| CDPS-L | 112.70±16.76* | 40.72±3.62 | 1.37±0.12** | 264.07±14.85** |
| CDPS-M | 82.31±14.68** | 35.37±6.21* | 1.06±0.17** | 247.62±11.22** |
| CDPS-H | 64.58±8.64** | 30.00±2.87** | 0.65±0.17** | 222.71±37.52** |
| DAPA | 76.98±10.47** | 28.82±3.72** | 0.37±0.10** | 129.87±17.69** |
2.3 C57BL/6J 마우스의 혈청에서 염증 인자 및 LPS 질량 농도에 대한 CDP의 영향
표 5에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, 모델 그룹의 마우스에서 TNF-, IL -1, IL -6, TGF- 및 LPS의 혈청 수준은 유의하게 증가 하였다 (P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
CDPS-H 그룹의 효과는 유의미 하였다 (p ＜ 0. 0 5 또는 p ＜ 0. 01), CDPS-H 그룹의 효과는 유의했다 (p ＜ 0.01).
표 5 마우스의 염증 인자 및 LP에 대한 CDP의 효과 (n=6)
| 그룹 | 질량 농도 (Pg/ml) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Tnf- | il -1 | il -6 | TGF- | LPS | |
| 제어 | 111.23±5.47 | 125.85±11.41 | 112.27±10.28 | 152.25±7.28 | 116.17±15.07 |
| 모델 | 167.90±16.91## | 184.53±21.03## | 195.57±31.88## | 209.36±16.17## | 173.51±15.72## |
| CDPS-L | 144.57±10.15* | 160.46±11.84* | 169.10±20.32 | 189.03±8.02* | 151.41±9.40* |
| CDPS-M | 133.62±13.24** | 154.30±17.39* | 150.47±19.28* | 171.25±14.35** | 135.33±23.92** |
| CDPS-H | 119.30±7.31** | 140.54±16.11** | 127.12±10.94** | 169.47±10.57** | 124.98±16.38** |
| DAPA | 114.79±10.48** | 135.17±14.37** | 120.90±9.32** | 159.11±10.92** |
113.34±13.14**
|
2.4 C57BL/6J 마우스의 신장 병리에 대한 CDP의 효과
도 1에 도시 된 바와 같이, H & E 염색 후, 대조군에서 마우스의 사구체 구조 및 형태는 정상적이고 깨끗하고, 기저막은 매끄럽고, 사구체 형태는 규칙적이었고, 신장 간극은 정상이었고, 신장 세뇨관은 깔끔하게 배열되었으며, 인플 루머 세포 요약이 없었다. 대조군과 비교하여, 모델 그룹에서 마우스의 사구체 부피가 확대되었고, 지하실 막을 두껍게하고, 염증성 세포에 침투하고, 신장 세관이 무질서하고 확장되었다; 모델 그룹과 비교하여, CDPS 투여 그룹은 마우스 신장에 대해 상이한 수준의 개선을 가졌다. CDPS-M 및 CDPS-H 그룹에서 마우스의 사구체 부피가 상당히 감소되었고, 기저막 두께가 감소되었고, 소량의 염증성 세포만이 침윤되었고, 신장 세관이 상당히 회복되어 밀접하게 배열되었다. 4 주간의 CDP 중재 후, 상기 병리학 적 조건은 모두 다양한 정도로 회복되었다.
MASSON 염색은 대조군에서 마우스의 신장 세관이 정상적으로 배열되었고, 사구체는 정상적인 형태이며, 콜라겐 섬유 증식이 관찰되지 않았으며, 관형 지하실 막을 볼 수 있음을 보여 주었다. 모델 그룹에서 마우스의 신장 간질 조직에서 다량의 염색 된 콜라겐이 관찰되었고, 간질 섬유 조직은 번들로서 탈선시켰다; CDPS-M 그룹에서 마우스의 사구체 부피가 감소되었고, 섬유 조직 증식의 증상이 완화되었다; CDPS-H 그룹에서 마우스의 신장 세관을보다 정기적으로 배열하고 소량의 콜라겐 섬유 증식이 관찰되었다.
PAS 염색 결과는 대조군에서 마우스의 사구체가 부피가 정상이고 구조가 손상되지 않았다는 것을 보여 주었다; 모델 그룹의 마우스는 신장 손상을 가졌고, 사구체 부피는 정상보다 크고 모양이 불규칙했으며, 중간 매트릭스가 증착되었다; 모델 그룹과 비교하여, 각 약물 처리 된 그룹에서 마우스의 신장 손상이 완화되었고, 용량의 증가에 따라 사구체 형태와 크기는 정상인 경향이 있었고, 중간 매트릭스 증착의 정도가 감소되었다. 결과는 CDP가 DN 마우스에서 신장 조직 손상을 완화시킬 수 있음을 시사한다.
그림 1 H & E, Masson 및 PAS 염색 (× 400)에 의해 조사 된 DN 마우스의 신장 조직 병리학 적 변화에 대한 CDP의 효과
