신장 및 당뇨병을 위한 Cistanche 기능
Mar 11, 2022
신장 세뇨관의 24시간 주기 시계의 기능 장애는 신장의 포도당 신생합성을 향상시키고 당뇨병에서 고혈당증을 악화시킵니다.
자세한 정보:ali.ma@wecistanche.com
Camille Ansermet1,6, Gabriel Centeno1,6, Yohan Bignon1,6, Daniel Ortiz2,6, Sylvain Pradervand3, Andy Garcia1, Laure Menin2, Fre'de´ric Gachon1,4, Hikari AI. Yoshihara5 및 Dmitri Firsov1
1스위스 로잔 소재 로잔대학교 의생명과학부;2Mass Spectrometry Service, Institute of Chemical Sciences and Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Switzerland, Lausanne;3스위스 로잔에 있는 로잔 대학교의 게놈 기술 시설;4분자 생명 과학 연구소, 호주 퀸즐랜드 퀸즐랜드 대학교; 그리고 5물리학 연구소, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 스위스 로잔
그만큼일주기 시계세포, 조직 및 전신 생물학적 기능을 24-시간 환경 주기와 동기화하는 유비쿼터스 분자 시간 측정 메커니즘입니다. 국부적 24시간 시계는 세포 유형 및 조직 특이적 리듬을 구동하고 이들의 조절 장애는 광범위한 질병의 발병 및/또는 진행에 연루되어 있습니다. 그러나 내인성의 병태생리학적 역할은일주기 시계당뇨병 환자의 신장에 남아 있습니다. 이 질문을 해결하기 위해 I형을 유도했습니다.당뇨병족세포(cKOp 마우스) 또는신장세뇨관(cKOt 마우스). cKOp 및 cKOt 당뇨병 마우스에서 24시간 주기 시계의 기능장애와 당뇨병성 신병증의 발병 사이에는 연관성이 없었습니다. 그러나 cKOt 마우스는당뇨병스트렙토조토신 처리된 대조군 마우스에 비해 고혈당증이 악화되고, 소변에서 포도당의 분획 배설이 증가하고, 다뇨가 증가하고, 신장 비대가 더 뚜렷하게 나타났습니다. mRNA 및 단백질 발현 분석은신장당뇨병 대조군 마우스와 비교하여 당뇨병이 있는 cKOt 마우스.당뇨병직접 또는 간접적으로 gluconeogenic 경로에 영향을 미치는 다중 기전의 변화를 확인했습니다. 따라서 우리는 본질적인 기능 장애를 보여줍니다.신장세뇨관일주기 시계포도당 신생합성의 향상을 통해 당뇨병성 고혈당증을 악화시킨다.신장근위 세뇨관 및 환자에서 일주기 행동의 중요성을 강조합니다.당뇨병.
키워드:일주기 시계; 당뇨병; 포도당신생합성; 근위세뇨관
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과도기적 문장
~ 안에당뇨병,신장1차 소변에서 포도당 재흡수를 증가시키고 근위 세뇨관에서 포도당 신생합성을 상향 조절하여 당뇨병성 고혈당증의 발병에 기여합니다. 그러나 이러한 2가지 프로세스는일주기 시계, 다양한 특정 신장 기능을 매일의 명암 주기와 동기화하는 메커니즘. 여기에서, 우리는 신장 세뇨관의 내재적 24시간 주기 시계의 기능 장애가 신장 gluconeogenesis의 향상을 통해 당뇨병성 고혈당증을 악화시킬 수 있음을 보여줍니다.
당뇨병신장이 특정 역할을 하는 전신 질환입니다. 당뇨병에서는신장1차 소변에서 포도당 재흡수를 증가시키고 포도당 신생합성을 통해 포도당 생성을 증가시켜 당뇨병성 고혈당증의 발병에 기여합니다. 신장의 사구체, 세뇨관 및 혈관 손상을 특징으로 하는 당뇨병. 대사 스트레스가 DN의 발병 및 진행에 관여하는 주요 요인이지만, 고혈당만으로는 대부분의 당뇨병 환자에서 신장 기능 부전을 유발하지 않습니다. 및/또는 DN의 가속화된 진행신장.5 조건부일주기 시계동물 모델의 다른 신장 세포 유형에서 일주기 리듬의 붕괴, 사구체 여과율(GFR)6, 혈압 조절의 부분적 손실,7,8 신장 대사 경로의 실질적인 변경,9,10 만성 질환의 진행 가속화신장병.11 인간의 경우, 생체 시계와 섭식 및 활동 리듬 사이의 교대 근무 관련 일주기 오정렬은 GFR 감소,12 소변 알부민 배설 증가,13 야간 빈뇨, 신장 소변 생성 증가,14 만성 신장 질환의 위험 증가와 관련이 있습니다.15
흥미롭게도,일주기 시계에서신장의 병인에 관여하는 많은 세포 경로를 조절하거나 상호 연결되어 있습니다.당뇨병및/또는 DN. 예를 들어, 일주기 시계 기계의 중심 요소인 전사 활성인자 BMAL1(ARNTL이라고도 함)의 신장세관 특이적 녹아웃은 글루타민 수송체SNAT3(SLC38A3)을 포함하여 신장글루타민 글루코스 신생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 mRNA의 발현 수준을 현저하게 증가시킵니다. 글루타미나제(GLS) 및 글루타메이트 탈수소효소 1(GLUD1).9 더 중요한 것은 이러한 발현 변화가 정상 혈당 녹아웃 동물에서 발생한다는 것입니다. Slominskiet al. 일주기 시계 단백질 PER1이 근위 세뇨관 세포에서 포도당 수송체 Sglt1(Slc5a1)의 전사 조절에 관여한다는 것을 입증했습니다. 족세포의 24시간 주기 시계가 1형 및 2형 당뇨병 모두에서 DN에 대한 소인과 관련된 Arhgap24 유전자의 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. ), 당뇨병성 신장에서 세포노화를 유발하는 중요한 요소입니다.9,17 DN에서 족세포 손상의 주요 조절자 중 하나인 SIRT1(nicotinamideadenine dinucleotide-dependent deacetylase sirtuin 1)18은 에너지 피드백 루프의 마스터 조절자로 확인되었습니다. 코어 클록 네트워크 내에서.19 DN과 DN을 연결하는 또 다른 셀룰러 메커니즘일주기 시계20 일주기 시간 유지와 함께 세포 대사를 조정하는 키나제인 rapamycin의 포유류 표적입니다. 20 rapamycin 신호 전달의 변경된 포유류 표적은 또한 당뇨병으로 인한 신세뇨관 세포,21 족세포,22 및 사구체 내피23 및 간간막24 세포의 손상에서 중요한 병원성 인자로 인식되었습니다. . 종합적으로, 이러한 관찰은 24시간 주기 시계의 섭동이신장신세뇨관 포도당신생합성 및/또는 포도당 재흡수를 자극하거나 DN의 발병에 기여하는 "두 번째 타격"으로 작용하여 당뇨병성 고혈당증의 발병에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 가설을 해결하기 위해 우리는 스트렙토조토신(STZ)에 의해 유도된 I형 마우스를 생성하고 특성화했습니다.당뇨병및 특정 삭제일주기 시계사구체 족세포 또는 신세관에서 조정자 Bmal1.
행동 양식
동물은 표준 실험식 식단(KLIBA NAFAG 식단 3800)에서 임의로 유지되었습니다. 모든 실험은 수컷 마우스에서 수행되었습니다.
마우스 모델
Bmal1(Arntl) 유전자의 비활성화는 {{1}주된 Bmal1lox/lox/Nphs2-rtTA의 독시사이클린(DOX; 식수 중 2mg/ml)으로{3}주간 처리하여 유도되었습니다. /LC1 마우스(cKOp 마우스) 또는 8-주령 Bmal1lox/lox/Pax{11}}rtTA/LC1 마우스(cKOt 마우스). 그들의 한자어 대조군(Bmal1lox/lox 마우스)은 동일한 DOX 처리를 받았습니다. 두 모델 모두 이전에 설명 및 검증되었습니다.6,9 DOX 치료 종료 1주일 후, 유형 I당뇨병STZ(50 mg/kg 체중[BW], 5일 동안 매일)의 복강내 주사로 유도되었습니다. 비히클 처리된 마우스는 인산완충식염수의 비히클 주사를 받았다. 모든 실험은 마지막 STZ 또는 비히클 주입 후 8주에 수행되었습니다. 모든 실험에서 조직 및 혈액 수집은 ZT9에서 희생된 마우스에서 수행되었습니다(Z는 Zeitgeber 시간 단위를 나타냅니다. ZT0은 조명이 켜진 시간이고 ZT12는 조명이 꺼진 시간입니다).
대사 케이지
마우스를 개별 대사 케이지(Tecniplast)에 수용했습니다. 소변 수집은 4-일 적응 기간 후 24시간 동안 수행되었습니다.
혈장 및 소변 화학
소변 및 혈장 Naþ, Kþ, Ca2þ, Mg2þ, 인산염, 크레아티닌, 포도당, 요산염, 요소 농도 및 삼투압 농도는 보두아 센터 병원의 Chimie Clinique 연구소에서 측정했습니다. pH 측정기(Metrohm)로 소변 pH를 평가했습니다. 혈액 pH 및 혈액 가스는 에픽 혈액 분석기(Siemens Healthcare)를 사용하여 혼합 동맥-정맥 혈액에서 측정되었습니다. Berthelot 방법을 사용하여 소변 암모늄을 측정했습니다. Chan의 방법을 사용하여 요중 적정산을 측정하였다. 혈장 알도스테론 수치는 방사성면역측정법(radioimmunoassay, DPC)으로 측정하였다. 혈장 인슐린은 Mercodia의 키트를 사용하여 결정되었습니다.
GFR
GFR은 이전에 설명한 대로 인슐린-플루오레세인 이소티오시아네이트로 마취된 동물에서 측정되었습니다.26
IP 포도당 내성 검사
15시간의 금식 후, 비히클 또는 STZ 처리된 대조군 및 cKotmice에 포도당(1g/kg의 BW)을 복강내 주사하였다. 혈당은 포도당 주입 전(time=0)과 포도당 주입 후 15, 30, 60, 90, 120, 180분에 꼬리 혈액 한 방울(Contour NextOne; Bayer)에서 혈당 판독기로 측정되었습니다.
인슐린 내성 검사
음식 제한 4시간 후, 비히클 또는 STZ 처리된 대조군 및 cKot 마우스에 BW kg당 0.5U의 인슐린(인간 재조합 인슐린; Sigma)을 복강내 주사했습니다. 혈당은 인슐린 주사 전(time=0)과 인슐린 주사 후 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180분에 측정되었습니다. 혈당이 2mM 미만으로 감소하면, 마우스는 30mg의 포도당을 복강내 주사하여 구조되었고 분석에서 제외되었습니다.
RNA 시퀀싱
RNA 시퀀싱은 Ansermet et al.6 Musmusculus GRCm38.92 유전자 주석에 설명된 대로 수행되었습니다. 유전자 수는 TMM 정규화를 사용하여 스케일링되었고 limma Rpackage의 "CPM" 기능을 사용하여 백만 당 수(CPM)로 로그 변환되었습니다. 녹아웃과 대조 동물 간의 차등 발현은 처리되지 않은(인산염 완충 식염수) 및 처리된( STZ) 조건과 2 사이의 상호 작용 3가지 비교 각각에 대해 "클러스터 프로파일"이 있는 유전자 온톨로지 "생물학적 과정" 농축 분석을 위해 거짓 발견률(FDR)이 5% 미만인 유전자가 선택되었습니다. Q-값< 0.01="" were="" considered="" as="" significant="" and="" further="" processed="" with="" the="" function="" "simplify"="" with="" default="" parameters="" to="" remove="">
통계 분석
모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 통계 테스트는 그림 범례와 보충 표 S10에 설명되어 있습니다. P < 0.05는="" 유의미한="" 것으로="" 간주되었습니다.="" 통계="" 분석은="" graphpad="" prism="" 소프트웨어(버전="" 8.2.1)를="" 사용하여="">
모세관 웨스턴 블롯
모세관 웨스턴 블롯은 로잔 대학 단백질 분석 시설(https://www.unil.ch/paf/home/menuinst/technologies/western-in-capillaries.html)에서 수행되었습니다. 그들의 정량은 이 시설의 기술자에 의해 블라인드 방식으로 수행되었습니다.
Cistanche는 신장 기능을 향상시킬 수 있습니다
결과
족세포에서 Bmal1의 비활성화는 STZ 처리된 마우스에서 DN의 유도로 이어지지 않습니다
Bmal1(Arntl)의 족세포 특이적 비활성화는 8-주된 Bmal1lox/lox/Nphs2-rtTA/의 DOX(음용수 중 2mg/ml)로 2-주 처리하여 유도되었습니다. LC1 마우스(이하 cKOp 마우스).6 이들의 한배새끼 대조군(Bmal1lox/lox 마우스, 이하 대조군 마우스)은 동일한 DOX 처리를 받았다. 그림 1a에서 볼 수 있듯이, STZ 처리(방법 참조)는 고혈당을 유발했으며, 이는 대조군과 cKOp 마우스 간에 다르지 않았습니다. BW는 STZ로 처리된 동물에서 더 낮았지만 이 효과는 두 유전자형의 유사한 inmice였습니다(그림 1b). 인슐린-플루오레세인 이소티오시아네이트 청소율을 사용하여 측정한 GFR은 STZ 처리된 대조군과 cKOp 마우스 간에 차이가 없었습니다(그림 1c). 당뇨병 동물은 당뇨증(그림 1d), 다뇨증(그림 1e), 저분자량 단백뇨(그림 1f) 및 약간의 알부민뇨(그림 1f)를 보였습니다. 그러나 STZ 처리된 대조군과 cKOp 마우스 간에 이러한 매개변수에는 차이가 없었습니다.
신세뇨관에 BMAL1이 없는 마우스는 당뇨병과 함께 악화된 고혈당증을 나타냅니다.
도 2a에 나타난 바와 같이, BW는 당뇨병 대조군 마우스와 신세뇨관에서 BMAL1이 결여된 마우스(DOX 처리된 Bmal1lox/lox/Pax8-rtTA/LC1 마우스9, 이하 cKot 마우스라고 함)에서 차이가 없었다. 혈장 분석은 STZ 유도 고혈당증이 섭식 및 금식 조건 모두에서 cKOt 마우스에서 악화되는 것으로 나타났습니다(각각 그림 2b 및 c). 삼투압 및 나트륨, 칼륨, 인산염, 칼슘, 마그네슘, 크레아티닌, 요산염 및 알도스테론 농도는 cKOt 마우스의 혈장 요소 수준 증가를 제외하고는 STZ 처리 대조군과 c Kotmice 사이에 달랐습니다(보충 표 S1). 혈장 인슐린 수준은 STZ 처리 대조군과 cKot 금식 마우스 사이에 차이가 없었습니다(그림 2d). 감소하는 포도당 농도의 기울기로 평가된 포도당 및 인슐린 내성 테스트는 두 처리 조건(각각 그림 2e 및 f)에서 유전자형 마우스 간에 유의미한 차이를 나타내지 않았습니다.당뇨병-유도신장비대는 당뇨병 대조군보다 당뇨병 cKOt 마우스에서 더 두드러졌습니다(그림 2g). GFR은 두 유전자형의 STZ 처리 마우스 간에 다르지 않았습니다(그림 2h). STZ에 의해 유발된 수분 섭취량과 소변량의 증가는 c Kot 마우스(각각 그림 3a 및 b)에서 더 두드러진 반면, 소변 삼투압 농도는 두 유전자형의 당뇨병 마우스 간에 다르지 않았습니다(그림 3c). 포도당의 분수 배설은 더 높았고 나트륨의 배설은 STZ 처리된 대조군과 비교하여 STZ 처리된 cKOtmice에서 더 낮았습니다(각각 그림 3d 및 e). 반면 인산염(그림 3f), 마그네슘(그림 3g)의 분수 배설 값 및 칼슘 (그림 3h)은 두 유전자형의 당뇨병 마우스간에 차이가 없었습니다. STZ로 처리 된 대조군과 cKot 마우스 모두 유사한 저분자량 단백뇨가 있었지만 알부민뇨는 없었습니다 (보충 그림 S1). 비히클 또는 STZ 처리 대조군과 cKot 마우스의 신장 사이에는 주요 조직학적 차이가 발견되지 않았습니다(보충 그림 S2).
그림 1|비히클 또는 스트렙토조토신(STZ) 처리된 대조군 및 cKOp 마우스의 일반적인 특성. (a) 금식하지 않은 혈당. (b) 체중(BW). (c) 사구체 여과율(GFR)(인슐린 제거율). (d) 소변 포도당. (e) 소변량. (f) 요단백의 쿠마시 블루 염색. 모든 마우스에 대해 24-시간 소변의 0.3%(vol)를 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 겔에 로딩했습니다. 평균±SEM이 주어진다. GFR 측정을 제외하고 각 그룹에서 n=9, 여기서 n=6 및 n=9 마우스는 각각 STZ 처리된 대조군 및 cKOpgroup에서 사용되었습니다. 모든 결과는 19-주된 동물에서 얻은 것입니다. Sidak 다중 비교 테스트를 통한 양방향 분산 분석이 사용되었습니다. *P < 0.{16}}5,="" †p="">< 0.01,="" ‡p="">< 0.001.="" alb,="" 알부민(65kda);="" lmwp,="" 저분자량="">
그림 2|비히클 또는 스트렙토조토신(STZ) 처리된 대조군 및 c Kot 마우스의 일반적인 특성. (a) 체중. 비히클 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 n=8, STZ 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 n=9. (b) 금식하지 않은 혈당. 비히클 및 STZ 처리 대조군 및 c Kot 마우스에 대해 각각 n=8 및 n{8}}. (c) 공복 혈당(16시간 금식). 비히클 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 n=9, STZ 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 각각 n{14}} 및 n{15}} (d) 비히클 또는 STZ 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 인슐린 수준. 비히클 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 각각 n{19}} 및 n{20}}, STZ 주입 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 각각 n{22}} 및 n{23}}. 혈장 인슐린 수치는 비활성 단계의 중간인 ZT18에서 측정되었습니다. ( e ) 혈당 수치는 차량 내 또는 STZ 처리 대조군 및 c Kot 생쥐 내 내당능 테스트 과정에서 측정되었습니다. 비히클 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 n=9, STZ 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 각각 n=7 및 n{32}}. ( f ) 혈당 수준은 차량 내 또는 STZ 처리 대조군 및 c Kot 마우스에서 인슐린 내성 테스트 과정에서 측정되었습니다. 비히클 또는 STZ 처리된 대조군 마우스의 경우 n=5, 비히클 또는 STZ 처리된 cKO 마우스의 경우 n{40}}. (g)당뇨병-유도신장비대. 각 그룹의 n{{0}}. 신장 비대는 신장 중량(KW)을 체중(BW)으로 나누어 평가했습니다. STZ 주입 대조군 및 c Kot 동물에 대한 상대 KW/BW 값은 1{{10}}0%를 해당 차량 주입 그룹. (h) 사구체 여과율(GFR)(인슐린 제거율). STZ 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 경우 각각 n=5 및 n=6입니다. 평균±SEM이 주어진다. Sidak 다중 비교 테스트를 통한 양방향 분산 분석이 사용되었습니다. *P < 0.05,="" †p="">< 0.01,="" ‡p=""><>
cKOt 마우스의 악화된 고혈당증은 신장에서 글루코네오제닉 효소의 발현 증가와 상관관계가 있습니다
STZ 처리된 cKOt 마우스에서 악화된 고혈당증과 관련된 분자 경로를 확인하기 위해 다음의 RNA 시퀀싱 분석을 수행했습니다.신장전사체에 이어 전체 전사체 경로 농축 분석 및 신장 글루코스 신생합성 및 신장 글루코스 재흡수에 관여하는 단백질을 암호화하는 RNA의 특정 분석. 전사체의 비교는 비히클 및 STZ 처리 대조군 사이에 차등적으로 발현된 1833개의 전사체(보충 표 S2; FDR < 5%),="" 비히클="" 및="" stz="" 처리된="" ckot="" 마우스="" 간에="" 차등적으로="" 발현된="" 1784개의="" 전사체(보충="" 표="" s3;="" fdr="">< 5%="" 차등="" 발현),="" 3107="" 전사체를="" 나타냈다.="" 비히클="" 처리="" 대조군과="" c="" kot="" 마우스="" 사이(보충="" 표="" s4,="">< 5%),="" and="" 2667="" transcripts="" differentially="" expressed="" between="" stz-treated="" control="" and="" c="" kot="" mice="" (supplementary="" table="" s5;="" fdr="" <="" 5%).="" gene="" ontology="" analysis="" of="" differentially="" expressed="" transcripts="" revealed="" enrichment="" of="" pathways="" related="" to="" lipid,="" amino="" acid,="" and="" carboxylic="" acid="" metabolism,="" and="" organic="" anion="" transport="" between="" control="" and="" cko="" mice="" in="" both="" vehicle="" and="" stz="" treatment="" groups="" (figure="" 4a="" and="" b,="" respectively,="" and="" supplementary="" tables="" s6="" and="" s7,="" respectively).="" a="" total="" of="" 284="" transcripts="" exhibited="" genotype-by="" treatment="" interaction="" effects="" (supplementary="" table="" s8;="" fdr="" <="" 5%),="" including="" glud1="" and="" g6pc="" transcripts="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" renal="" gluconeogenesis="" (see="" below).="" gene="" ontology="" analysis="" of="" transcripts="" with="" significant="" interaction="" showed="" enrichment="" of="" only="" a="" limited="" number="" of="" pathways,="" mainly="" related="" to="" lipid="" metabolism="" and="" organic="" anion="" transport="" (figure="" 4c="" and="" supplementary="" table="" s9).="" among="" the="" genes="" encoding="" transporters="" involved="" in="" glucose="" reabsorption="" in="" the="" proximal="" tubule="" (sglt1,="" sglt2,="" glut1,="" and="" glut2),="" only="" glut1="" (slc2a1)="" displayed="" higher="" expression="" in="">신장당뇨병 대조군과 비교한 당뇨병 cKOt 마우스(보충 표 S5).
그림 3|비히클 또는 스트렙토조토신(STZ) 처리 대조군 및 c Kot 마우스의 수분 섭취 및 소변 특성. (a) 24-시간 물 섭취량. 비히클 처리 대조군 또는 cKOt 마우스의 경우 n=8, STZ 처리 대조군 또는 cKOt 마우스의 경우 n=9. (b) 24-시간 소변량. 비히클 처리 대조군 또는 cKOt 마우스의 경우 n=8, STZ 처리 대조군 또는 cKOt 마우스의 경우 n{11}} (c) 소변 삼투질 농도. n{13}} 비히클 처리 대조군, n{15}} 비히클 처리 c Kot 마우스, n{17}} STZ 처리 대조군 또는 cKOt 마우스. (d) 포도당의 부분 배설(Fe). n{19}} 차량 처리 대조군 또는 cKOt 마우스, n{21}} STZ 처리 대조군 또는 cKOt 마우스. (e) 나트륨의 Fe. 비히클 처리된 대조군 마우스의 경우 n=8, 비히클 처리된 c Kot 마우스의 경우 n{25}}, STZ 처리된 대조군 또는 cKOt 마우스의 경우 n{27}}. (f) 인산염의 철. 비히클 처리된 대조군 마우스의 경우 n=8, 비히클 처리된 cKOt 마우스의 경우 n{31}}, STZ 처리된 대조군 마우스의 경우 n{33}}, STZ 처리된 대조군 마우스의 경우 n{35}} cKOt 마우스. (g) 마그네슘의 Fe. n=8 차량 처리 대조군 마우스, n{39}} 차량 처리 c Kot 마우스, n{41}} STZ 처리 대조군 또는 cKOt 마우스. (h) 칼슘의 철. n=8 차량 처리 대조군 마우스, n{45}} 차량 처리 c Kot 마우스, n{47}} STZ 처리 대조군 또는 cKOt 마우스. SEM이 제공됨을 의미합니다. Sidak 다중 비교 테스트를 통한 양방향 분산 분석이 사용되었습니다. *P < {{50}}.{54}}5,="" †p="">< 0.01,="" ‡p="">< 0.001.="" bw,="">
2가지 주요 포도당 생성 전구체신장arelactate 및 glutamine.29 그림 4d 및 e 및 보충 표 S5에서 볼 수 있듯이 신장 글루타민 글루코스 신생합성(Snat3, Gls 및 Glud1)에 관여하는 transcriptsencoding 단백질의 발현 수준은 STZ 처리 대조군과 비교하여 STZ 처리 cKOt 마우스의 신장에서 증가했습니다. . 반대로, GLS에 의해 유도된 글루타민분해의 초기 단계를 역전시키는 글루타메이트 암모니아 리가제(Gull)를 코딩하는 mRNA의 발현이 감소했습니다. 유사하게, 포도당신생합성 경로의 공통 부분(즉, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제[Pck1] 및 포도당{10}}포스파타아제[G6pc])에서 2가지 효소를 인코딩하는 mRNA의 발현 수준은 STZ 처리된 cKOtmice에서 더 높았습니다. 당뇨병 cKOt 마우스의 신장에서 GLUD1 및 PCK1의 더 높은 발현은 모세관 웨스턴 블롯에 의해 단백질 수준에서 확인되었습니다(그림 4f 및 보충 그림 S3). 당뇨병 마우스의 간에서 GLUD1의 발현 수준은 대조군과 c Kot 마우스간에 차이가 없었고 PCK1의 발현은 c Kot 마우스에서 더 낮았습니다 (보충 그림 S4). 참고로, Glud1, Snat3, fructose{22}},{23}}biphosphate 2(Fbp2) 및 Glut1의 발현 수준은 더 높았고 Glul, Fbp1 및 Glut2의 발현 수준은신장비히클 처리된 대조군과 비교한 비히클 처리된 cKOt 마우스의.
그림 4|유전자 온톨로지(GO) "생물학적 과정" 농축 분석. (a) 에서 차등적으로 발현된 전사체의 GO 분석신장차량 처리 대조군 및 c Kot 마우스. (b) 스트렙토조토신(STZ) 처리된 대조군 및 c Kot 마우스의 신장에서 차등적으로 발현되는 전사체의 GO 분석. (c) 유전자형별 치료 상호작용 효과를 나타내는 전사체의 GO 분석. 상위 20개의 가장 중요한 용어에 대한 점 그림(Q 값 < 0.{15}}1).="" 중복="" 용어가="" 필터링되었습니다.="" 세대는="" 표시된="" 용어로="" 주석이="" 달린="" 중요한="" 유전자의="" 비율을="" 나타냅니다.="" 점의="" 크기는="" 표시된="" 용어로="" 주석이="" 달린="" 중요한="" 유전자의="" 수를="" 나타냅니다.="" 조건당="" n="6" (d)="" 신장="" 포도당="" 신생합성에="" 관여하는="" 전사체="" 코딩="" 효소="" 및="" 전사체에="" 대한="" 배수-변화="" 플롯.="" 발현="" 수준="" 값은="" 보충="" 표="" s2,="" s3,="" s4="" 및="" s5에서="" 추출되었습니다.="" *p="">< 0.05,="" †p="">< 0.01,="" ‡p="">< 0.001.="" (e)="" 신장="" 포도당신생합성="" 과정에="" 관여하는="" 주요="" 단백질/효소가="" 있는="" 근위="" 세뇨관="" 세포의="" 도식적="" 표현.="" 빨간색:="" stz="" 처리="" 대조군과="" c="" kot="" 마우스="" 간의="" 차등="" 발현에="" 대한="" p="" 값.="" 파란색:="" 비히클="" 처리="" 대조군과="" c="" kot="" 마우스="" 간의="" 차등="" 발현에="" 대한="" p="" 값.="" 빨간색과="" 파란색="" 화살표는="" 증가([)="" 또는="" 감소(y)="" 발현="" inckot="" 마우스를="" 나타냅니다.="" (f)="" 글루타메이트="" 탈수소효소(glud1)="" 및="" 포스포에놀피루베이트="" 카르복시키나아제(pck1,="" 각각="" 보충="" 그림="" s2="" 및="" s3)에="" 대한="" 모세관="" 웨스턴="" 블롯의="" 정량="">신장인산염 완충 식염수 또는 STZ 처리 대조군 및 c Kot 마우스(n=6 percondition). Sidak 다중 비교 테스트를 통한 양방향 분산 분석이 사용되었습니다. *P < 0.05,="" †p="">< 0.01,="" ‡p="">< 0.001.="" au,="" 임의="" 단위,="" fbp1/2,="" 과당{12}},{13}}바이포스파타제="" 1/2;="" g6pc,="" 포도당{17}}포스파타제;="" gls,="" 글루타미나제;="" glul,="" 글루타민="" 합성효소;="" glut2,="" 포도당="" 수송체2;="" nhe3,="" 나트륨-수소="" 교환기="" 3;="" p="" 조정,="" p="" 조정;="" pc,="" 피루베이트="" 카르복실라제;="" snat3,="" 글루타민="" 수송체;="" tca,="" xxx="">
당뇨병 cKOt 마우스의 신장에서 포도당 신생 경로에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치는 여러 메커니즘이 변경됩니다
글루코네오제닉 경로는신장의 영향을 받을 수 있습니다일주기 시계신장 글루코스 신생합성에 관여하는 단백질의 전사, 번역 또는 번역 후 조절을 통해 직접적으로 또는 근위 세뇨관에서 포도당 생성과 본질적으로 연결된 다른 신장 기전에 영향을 주어 간접적으로. gluconeogenic enzyme의 전사를 관장하는 전사인자, coactivators, corepressors는 간, 신장, 기타 조직에서 부분적으로 특징지어진다. 도 5a 및 b는 글루코스신생합성의 공지된 전사 조절자를 코딩하는 전사체의 발현 수준의 변화를 요약한다.신장ofcontrol 및 cKOt 마우스(보충 표 S4 및 S5 참조). 분석된 전사체 중에서 peroxisome proliferator-activated receptor d (PPARd)와 cryptochromes 1과 2를 코딩하는 것은 상당한 증가를 보인 반면, 핵 수용체 NR1D1(REV-Erba로도 알려짐)은 차량과 STZ 모두에서 cKOt 마우스의 신장에서 실질적으로 감소했습니다. 동일한 처리로 대조군과 비교한 처리된 동물. peroxisomeproliferator-activated receptor g coactivator{11}}a(Pgc1a,Ppargc1a)의 발현은 STZ 처리된 대조군과 비교하여 STZ 처리된 cKOt 마우스에서 증가하였고, 글루코코르티코이드 수용체(Gr, Nr3c1)의 발현은 비히클 처리된 cKOtmice에서 감소했습니다. 비히클 처리 대조군과 비교. Forkhead O box protein(Foxo1), hepatocyte nuclear factor 4a(Hnf4a), cyclic adenosine monophosphate responsiveelement binding protein(Creb1), Para, Sirt1, CREB-binding protein(Cbp, Crebbp), CREB-regulated transcriptional coactivator 2(Crtc2), 히스톤 데아세틸라제 3(Hdac3)은 치료 또는 유전자형에 영향을 받지 않았습니다.
그림 5|(a) 비히클 및 스트렙토조토신(STZ) 처리된 대조군 및 cKOt 마우스에서 글루코스신생성 효소의 전사를 제어하는 전사 인자, 보조 활성화제 및 공동 억제인자를 인코딩하는 전사체에 대한 접힘-변화 플롯. 발현 수준 값은 보충 표 S2, S3, S4 및 S5에서 추출되었습니다. *P < 0.{{10}}5,="" †p="">< 0.01,="" ‡p="">< 0.001.="" (b)="" 그림="" 5a에="" 제시된="" 데이터의="" 도식적="" 표현.="" 빨간색:="" stz="" 처리="" 대조군과="" ckot="" 마우스="" 간의="" 차등="" 발현에="" 대한="" p="" 값.="" 파란색:="" 비히클="" 처리="" 대조군과="" ckot="" 마우스="" 간의="" 차등="" 발현에="" 대한="" p="" 값.="" 빨간색과="" 파란색="" 화살표는="" ckot="" 마우스에서="" 증가된([)="" 또는="" 감소된(y)="" 발현을="" 나타냅니다.="" au,="" 임의="" 단위;="" cbp,="" xxx;="" 크렙1,="" xxx;="" crtc2,="" xxx;="" 외침1,="" xxx;="" 외침2,="" xxx;="" foxo1,="" xxx;="" g6pc,="" xxx;="" 그르,="" xxx;="" hdac3,="" xxx;="" hnf4a,="" xxx;="" nrld1,="" xxx;="" pck1,="" xxx;ppara,="" xxx;="" pparg,="" xxx;="" sirt1,="">
산증은 신장 포도당 신생합성의 주요 간접 자극이기 때문에 혈액 및 소변 pH, 혈액 가스, 암모니아의 소변 배설(NH3/NH4þ), 적정 산도를 측정했습니다. 도 6에 도시된 바와 같이, 혈액 pH는 비히클 처리된 대조군에 비해 비히클 처리된 cKOt 마우스에서 더 높았지만 두 유전자형의 당뇨병 마우스 간에는 차이가 없었다. 혈장 중탄산염은 비히클 처리 대조군과 비교하여 당뇨병 대조군에서 더 낮았습니다. 그러나, 당뇨병 대조군과 cKOt 마우스 사이의 혈장 중탄산염에서 nodifference가 발견되었습니다. 혈장 염기 과잉과 소변 pH는 치료나 유전자형에 영향을 받지 않았습니다. 그러나 STZ 처리된 cKOt 마우스는 STZ 처리된 대조군과 비교하여 증가된 양의 암모니아 및 적정 가능한 산도를 배설했습니다. 신장산-염기 처리에 관여하는 단백질을 코딩하는 전사체의 분석은 나트륨 수소 교환체 NHE3(Slc9a3, 그림 4d 및 e 참조)의 발현 감소를 보여주었습니다. 및 음이온 교환기 AE1(Slc4a1) 및 탄산탈수효소 II(Car2) 및 Hþ-ATPase(Atp6v1b1)의 b1 서브유닛의 발현 증가. 그러나 chloride-proton antiporter Clcn5, Hþ-ATPase의 b2 subunit(Atp6v1b2), 암모니아 운반체 Rhcg, 중탄산나트륨 공동수송체 NBCE1(Slc4a4), sodium-dependent chloride-bicarbonate exchanger NDCBE(Slc4a8), 및 당뇨병 대조군과 비교한 음이온 교환기 펜드린(Pds, Slc26a4) 당뇨병 cKOt 마우스(보충 표 S5). 참고로, Nhe3의 발현 수준은 비히클 처리 대조군과 비교하여 비히클 처리 cKOt 마우스의 신장에서 더 낮았습니다(그림 4d 및 보충 표 S4).
논의
의 기능장애는 잘 알려져 있다.일주기 시계생물학적 시계와 사회적 및 환경적 단서 사이의 메커니즘 또는 불일치(예: 교대 근무) 컴퓨터/인터넷 중독, 잦은 시차 또는 수면 장애는 다양한 만성 질환의 발병 및/또는 진행에 대한 주요 위험 요소입니다. 그러나, 특정 병태생리학적 과정에 대한 조직 고유의 국소 일주기 시계 대 전신 일주기 신호의 기여는 널리 조사되지 않았습니다. 우리는 내인성 신장 일주기 시계의 섭동이 DN 및/또는 당뇨병성 고혈당증의 발병에 기여할 수 있다고 가정했습니다. 이러한 가설을 테스트하기 위해 우리는 DN에 상대적으로 내성이 있는 것으로 알려진 C57BL/6 유전적 배경에서 개발된 2개의 마우스 모델(즉, cKOp 및 cKOt 마우스)을 사용했습니다. 두 모델 모두 당뇨병 상태에서 BMAL1의 결핍은 질병의 2가지 주요 특징인 추가 알부민뇨 또는 GFR의 차이를 초래하지 않았습니다. 이것은 C57BL/6 배경의 형질전환 마우스가 DN에서 "두 번째 히트" 가설을 연구하기에 적절한 모델이 아닐 수 있거나 DN의 발병 및/또는 진행이 내재적 신장 일주기 시계보다는 전신 일주기 섭동에 의해 더 영향을 받는다는 것을 시사합니다. 당뇨병성 고혈당과 내인성 신장의 상호작용 가설 검증일주기 시계당뇨병 cKOt 생쥐에서 강화된 신세뇨관 포도당 생성 경로와 악화된 고혈당이 밝혀졌습니다. mRNA 및 단백질 발현 분석은 글루타민 글루코스 신생합성과 글루코네오제닉 경로의 공통 부분이 당뇨병 대조군에 비해 향상된 당뇨병 cKOt 마우스임을 나타냅니다. 이 관찰은 두 가지 주요 포도당 생성 기질이신장(즉, 글루타민 및 젖산염) cKOt 마우스에서 고혈당증의 악화에 기여할 수 있습니다.
그림 6|비히클 또는 스트렙토조토신(STZ) 처리 대조군 및 cKOt 마우스에서 혈장 pH, 혈장 중탄산염, 혈장 염기 과잉, 소변 pH, 24-시간 소변 적정 산도(TA) 및 암모늄 배설. n=6-9. Sidak 다중 비교 테스트를 통한 양방향 분산 분석이 사용되었습니다. *P < 0.05,="" †p="">< 0.01,="" ‡p=""><>
신장포도당 신생합성은 전신 대사 균형과 신장 질환 모두에서 신장 세뇨관에서 생성되는 포도당의 잠재적으로 중요한 역할 때문에 최근 몇 년 동안 관심이 증가했습니다(이전에 검토됨2,30). 신장은 밤새 단식한 인간의 전체 신체 드 노보 포도당 생산의 40%를 차지합니다.29당뇨병, 간과 신장 모두 포도당 합성을 증가시키지만, 신장의 포도당 신생합성의 상대적인 증가는 간에서보다 훨씬 더 강력합니다. 간 연구에 따르면일주기 시계여러 방법을 통해 간의 포도당 신생합성에 영향을 미칠 수 있습니다.일주기 시계- 제어된 세포 메커니즘. Zhang et al. 일주기 억제 인자인 크립토크롬 1과 2가 CREB1.31Li et al. 핵심 생체 시계에서 중요한 음성 사지를 형성하는 NR1D1이 Pck1 및 G6pc의 전사를 억제한다는 것을 입증했습니다. Nr1d1 성적표신장당뇨병 대조군과 비교한 당뇨병 cKOtmice의. 이러한 모순된 결과는 핵심 시계 요소에 의한 포도당신생합성 조절의 조직 특이성을 시사할 수 있습니다. 재미있게,신장당뇨병 cKOt 마우스는 Ppard의 강력한 유도를 나타냈으며, 이는 근육에서 Pck1 발현을 극적으로 자극하는 것으로 나타났습니다. 당뇨병 cKOtmice의 신장에서 증가했습니다. 종합적으로, 신장 전사체의 분석은 당뇨병 cKOt 마우스가 글루코스 신생합성의 조절에 관여하는 여러 세포 경로에서 상당한 변화를 나타내는 것으로 밝혀졌습니다.신장및/또는 기타 조직.
잠재적인 메커니즘 평가일주기시계당뇨병 환자의 포도당 생성 경로에 영향을 줄 수 있습니다.신장암모늄의 소변 배설 증가 및 적정 가능한 산도를 포함하여 보상된 혈액 산-염기 상태의 여러 특징을 밝혔습니다. 이러한 관찰은 Hþ 분비에 관여하는 HþATPase의 Atp6v1b1 소단위를 코딩하는 유전자 발현의 잠재적인 보상적 증가와 함께 근위 세뇨관 산-염기 처리에서 핵심적인 역할을 하는 수송체인 NHE3를 코딩하는 전사체의 발현 수준 감소를 입증하는 전사체학 데이터를 비교했습니다. 말단 네프론. 24시간 주기 시계에 의한 Nhe3 발현의 직접적인 조절은 전사16 및 단백질 발현 수준 모두에서 입증되었습니다. 따라서 NHE3 발현 감소로 인한 세포내 산성화는 cKOt 마우스의 근위 세뇨관 세포에서 증가된 포도당신생합성의 가능한 원인으로 간주될 수 있습니다. 이러한 결과는 NHE3의 세뇨관 특이적 녹아웃이 신장에서 포도당신생합성 효소의 발현을 증가시킨다는 것을 입증한 Onishi et al.,36의 발견과 평행합니다. 당뇨병 cKOt 생쥐에서 글루코스 신생합성 경로의 속도 제한 공통 부분(Pck1 및 G6pc)의 향상은 수소 이온을 생성하는 대사 과정인 글루타민 글루코스 신생합성의 향상을 통해 세포내 산성화를 더욱 악화시킬 수 있습니다. 흥미롭게도 Nhe3, Glul, Glud1 및 Snat3의 발현뿐만 아니라 포도당신생합성 효소(Gr, Ppard, Nr1d1, Cry1 및 Cry2)의 전사를 제어하는 전사인자를 코딩하는 여러 전사체, 보조활성화제 또는 공동억제제의 발현이 STZ- 및 비히클 처리된 cKOt 마우스. 이것은 비히클 처리된 cKOt 마우스에서도 신장 글루코스 신생합성이 향상됨을 시사합니다. 비당뇨병 상태에서 고혈당증 incKOt 마우스의 부재는신장.
이러한 발견과 병인의 관련성은 무엇입니까?당뇨병인간에서? 섭식 리듬이 말초 일주기 시계의 동조에 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있습니다.37 식품 성분(예: 고염분,38 저탄수화물 고단백 식이39 및 케토제닉 식이40) 및 식품 섭취에 의한 측분비/자가분비 인자(예: , 코르티코스테로이드41)는 24시간 주기 리듬에 강한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.신장. 여러 주요 인구 집단이 주기적으로 또는 지속적으로 변이되거나 무질서한 음식 섭취에 노출됩니다. 예를 들어, 북미 및 유럽 직원의 최대 20%에서 25%가 교대 근무를 수행하는데, 이는 변경된 섭식 패턴과 관련이 있습니다.42 영향을 받는 두 번째로 빠르게 성장하는 식이 행동 그룹은 심각한 인터넷 중독자로, 현재 추정치에 따르면, 6 일반 인구의 퍼센트에서 8퍼센트입니다.43 수면 장애,44 만성 신장 질환,45 및 일부 약물(예: 시스플라틴46)도 신장 일주기 리듬을 상당히 손상시키는 것으로 나타났습니다. 따라서 당뇨병 환자의 상당 부분에서 내인성신장을 포함한 말초 조직의 일주기 시계의 조절 장애로 인해 고혈당증이 더욱 악화될 수 있다고 추측할 수 있습니다.일주기 시계. 이러한 라인을 따라 많은 연구에서 교대 근무와 당뇨병 발병 위험 사이의 강력한 연관성이 입증되었습니다(이전에 검토47). 종합적으로, 우리의 결과는 일주기 시스템과 당뇨병의 병태생리학 사이에 새로운 분자 연결을 제공합니다.당뇨병.
Cistanche는 신장 질환을 예방할 수 있습니다
폭로
모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.
감사의 말
이 작업은 스위스 국립 과학 재단(Swiss National Science Foundation) 연구 보조금 310030-188499(DF에)의 지원을 받았습니다. 이 작업의 일부는 미국 신장 학회의 2021년 연례 회의에 초록으로 제출되었습니다.
저자 기여
HAIRY, FG 및 DF가 연구를 설계했습니다. CA, GC, DO, YB 및 AG 수행 실험; CA, GC, DO, SP, LM 및 HAIY는 데이터를 분석했습니다. CA와 HAIY가 수치를 만들었습니다. DF와 HAIY가 원고를 작성했습니다. 모든 저자는 원고의 최종 버전을 승인했습니다.
보충 자료
보충 파일(PDF)
그림 S1. 비히클 오르스트렙토조토신(STZ) 처리 대조군 및 cKOt 마우스의 소변 단백질의 쿠마시 블루 염색.
그림 S2. (A) Masson trichrome 염색신장차량 또는 스트렙토조토신(STZ) 처리 대조군 및 cKOt 마우스의 절편. (B) 차량 또는 스트렙토조토신(STZ) 처리 대조군 및 cKOt 마우스의 신장 절편의 과요오드산-쉬프(PAS) 염색.
그림 S3. 글루타메이트히드로게나제 1(GLUD1; A) 및 포스포에놀피루베이트카르복시키나제(PCK1; B) 발현의 모세관 웨스턴 블롯 분석신장비히클 오르스트렙토조토신(STZ) 처리된 대조군 및 cKOt 마우스의.
그림 S4. 비히클 오르스트렙토조토신(STZ) 처리된 대조군 및 cKOt 마우스의 간에서 글루타메이트히드로게나제 1(GLUD1; A) 및 포스포에놀피루베이트카르복시키나제(PCK1; B) 발현의 모세관 웨스턴 블롯 분석.
표 S1. 비히클 또는 스트렙토조토신(STZ) 주입 대조군 및 cKOt 마우스의 플라즈마 화학.보충 파일(Excel)
표 S2. 전사체: 대조군 스트렙토조토신(STZ) 대 대조군 인산완충식염수(PBS).
표 S3. 전사체: 녹아웃(KO) 스트렙토조토신(STZ) 대 KO 인산염 완충 식염수(PBS).
표 S4. 전사체: 녹아웃(KO) 인산염 완충 식염수(PBS) 대 대조군 PBS.
표 S5. 전사체: 녹아웃(KO) 스트렙토조토신(STZ) 대 대조군 STZ.
표 S6. 녹아웃(KO) 인산완충식염수(PBS) 대 대조군 PBS에 대한 유전자 온톨로지(GO) 농축.
표 S7. 녹아웃(KO) 스트렙토조토신(STZ) 대 대조군 STZ에 대한 유전자 온톨로지(GO) 농축.
표 S8. 전사체: 유전자형별 치료 상호작용.
표 S9. 상호작용을 위한 유전자 온톨로지(GO) 농축.
표 S10. 통계.
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