Cistanche Glycoside는 Bmi1을 상향 조절하고 Akt 신호 경로를 통해 마우스 정자 줄기 세포의 증식을 촉진합니다

목적: Cistanche glycosides가 생쥐 정조줄기세포의 증식에 미치는 촉진효과 및 관련기전을 조사하고자 한다. 방법: MTT 분석 및 EdU 세포 증식 분석을 사용하여 마우스 정원 줄기 세포의 증식 능력에 대한 Cistanche 배당체의 효과를 검출했습니다. Western blot 방법은 cistanche glycoside에 의한 Bmi1, p-Akt 및 Akt 단백질의 발현을 검출하는 데 사용되었습니다. RT-PCR 실험은 관련 유전자의 발현 결과를 검출하였고, 최종적으로 억제제와 siRNA를 통해 p-Akt와 Bmi1 단백질 간의 상류 및 하류 조절 관계를 입증하였다. 결과: 대조군과 비교하여 0.5-1 µ M Cistanche glycoside는 생쥐 정원 줄기세포(P<0.05); Compared with the control group, the expression levels of p-Akt and Bmi1 proteins in the 0.5-1 µ M Cistanche glycoside treated group increased (P<0.05); Akt inhibitors downregulated the levels of p-Akt and Bmi proteins (P<0.05); SiBmi1 had no significant effect on Akt mRNA levels (P>0.05). 결론: Cistanche glycoside는 Akt 신호 전달 경로를 활성화하고 Bmi1 발현을 상향 조절하여 마우스 정원 줄기 세포의 증식을 촉진합니다.

키워드: Cistanche 배당체; 마우스 정원 줄기 세포; Bmi1 ; 세포 증식

불임은 인류 사회의 발전을 저해하는 세계적인 문제가 되었습니다[1-2]. 역학 통계에 따르면 전 세계 부부의 약 15% -20%가 불임 질환을 앓고 있으며, 남성의 기능 장애가 불임 증상의 50% 이상을 유발합니다[3]. 따라서 남성 불임에 대한 효과적인 치료 방법을 찾는 것이 생식 건강 분야에서 국내외적으로 뜨거운 연구 주제가 되었습니다.

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B 세포 특이적인 Moroni 마우스 백혈병 바이러스 통합 부위 1(Bmi1)로 구성된 polycomb protein inhibitory complex 1(PRC1)은 조기 노화를 예방하고 줄기 세포의 자가 재생 능력을 유지할 수 있습니다[4]. 단백질 키나아제 B(Akt)는 세포 증식 및 분화에 관여하고[5], 활성화된 Akt는 다양한 중요한 생물학적 활동에 관여합니다[6-7].

Cistanche glycoside I(C27H30O11, 분자량: 530.52)은 중국 전통 의학 Cistanche glycoside에서 분리된 Cistanche glycoside의 가수분해물이며 다양한 약리 및 생물학적 활성[8-9]을 가지고 있습니다. 보고서에 따르면 Cistanche 배당체는 골다공증에 특정 치료 효과가 있을 수 있습니다[10]. 그러나 Cistanche 배당체 I이 남성 생식 기능에 미치는 영향은 아직 명확하지 않습니다. 정자형성줄기세포(spermatogenic stem cell, SSC)는 자가 재생 및 분화 능력을 가진 가장 원시적인 정자 그룹으로, 남성의 생식 기능을 유지하는 데 있어 대체할 수 없는 역할을 합니다. 따라서 이 연구에서는 마우스 SSC의 증식 능력과 작용 메커니즘에 대한 Cistanche 배당체의 효과를 조사하기 위해 마우스 SSC를 시험관 내 모델로 사용했습니다.

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1 재료 및 방법

1.1 세포 배양

본 연구에서는 마우스 정원 줄기세포(C18-4)를 사용하였다. 세포는 He Zuping 교수의 연구 그룹에서 왔으며 사양에 따라 분리, 정제 및 식별되었습니다. 마우스 정자 줄기세포를 DMEM/F12(Gibco)에 10% fetal bovine serum(Gibco)과 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 배지(37도, 5% CO2)에서 배양하였다.

1.2 MTT 실험

균일한 세포 접종을 보장하기 위해 96-웰 플레이트에 웰당 5000개 세포의 양으로 C18-4를 접종합니다. 세포 접착 후 치료에 필요한 약물과 약물 농도를 선택합니다. 약물 중독 72시간 후, 세포를 접종한 웰에 준비된 티아졸 블루(MTT) 50μL를 첨가하고, 96웰 플레이트를 세포 배양기에 4-5시간 동안 두었다. 배양 후 96 well plate의 배양액을 버리고 각 well에 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150 μL를 첨가한 후 최종적으로 490 nm의 파장에서 Enzyme-linked immunosorbent assay(Biotek)를 사용하여 흡광도를 측정한다.

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1.3 EdU 세포 증식

세포를 {{0}}well plate(6.0 × 103/well)에 균일하게 접종하고 세포가 벽에 붙은 후 실험적 필요에 따라 24시간 동안 약물을 첨가한 후 100 μ LDMEM/ F12에는 원래 배양 배지 대신 20µL EdU가 포함되어 있으며 세포의 증식 가능성은 EdU 테스트 키트 지침에 따라 테스트됩니다.

1.4 웨스턴 블롯

미리 저장된 세포 단백질 샘플을 SDS PAGE 겔로 분리한 후 전기영동 후 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 5% 탈지유로 1시간 동안 밀봉하였다. 밤새 4도에서 특이적인 1차 항체와 조합하였다: 토끼 항-마우스 p-Akt 항체(1∶2000)(CST), Akt 항체(1∶1000)(CST), GAPDH(1∶5000)(Abcam), Bmi1(1 ∶ 5000)(Abcam). 2일째 토끼 2차항체와 상온에서 1시간 동안 결합한다. 해당 단백질은 Chemiluminescence Liquid (ECL) kit (Bio-Rad)를 이용하여 검출하였고, 마지막으로 ChemiDoc system (Bio-Rad)을 이용하여 항원-항체 반응을 관찰하였다.

1.5 RT-PCR

total RNA 추출 과정에 사용되는 시약은 TRIzol 시약(Invitrogen)이며 cDNA는 first strand cDNA reverse transcription kit(Vazyme)의 지시에 따라 얻는다. 지침에 따라 TaqMan 유전자 발현 Master Mix(Bio-Rad)를 사용하여 RT PCR을 수행했습니다. (표 1)의 프라이머 서열표

1.6 siRNA 형질감염

Bmi 1 mRNA의 siRNA는 Ribobio에서 구입했으며 서열 목록은 표 2에 있습니다. 형질감염 시약 Lipofectamine 6000(Invitrogen)을 사용했습니다. 세포(2.0 × 105/웰)를 6-웰 플레이트에서 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM/F 12에서 밤새 배양했습니다. 제조사의 가이드라인에 따라 Lipofectamine 6000을 control siRNA와 Bmi1 siRNA 각각과 충분히 혼합한 후 fetal bovine serum이 없는 배지에서 5시간 동안 transfection하였다. PBS로 세척한 후 원래의 배양 배지를 10% 태아 소 혈청 DMEM/F12로 교체했습니다. 24시간 후, 상응하는 다양한 단백질 및 유전자의 발현 변화를 검출하기 위해 세포를 수집하였다.

표 1 RT PCR 증폭 프라이머 서열

표 2 siRNA Bmi1 서열

1.7 통계 분석

모든 데이터는 SPSS 16.0 및 GraphPad Prism 8 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 두 개 이상의 그룹 간의 평균 값의 차이를 기반으로 Student t-test 및 one-way ANOVA 테스트를 선택하여 비교했습니다. P의 차이<0.05 was considered statistically significant.

2 결과

2.1 Cistanche glycosides가 정원줄기세포에 미치는 영향

Epimedium glycoside I이 생쥐 정조 줄기세포에 증식 효과가 있는지 알아보기 위해 MTT 실험을 통해 Cistanche glycoside I이 {{0}} 농도에서 생쥐 정조 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있음을 확인했습니다.5 및 1 μM(그림 1A). 다음으로 마우스 정조 줄기세포에 대한 Cistanche glycoside I의 증식 효과를 추가로 검증하기 위해 EdU 세포 증식 실험을 통해 Cistanche glycoside I도 0.5 및 1 μM 농도에서 마우스 정원 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있음을 확인하였다. (그림 1B).

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2.2 Cistanche 배당체는 Bmi1의 발현을 상향 조절합니다.

이전의 실험실 연구에서 Bmi1은 다른 장기 조직에 비해 고환 조직에서 높게 발현되며 주로 마우스 정원 줄기 세포의 핵에서 발현되는 것으로 나타났습니다. 최근 연구에 따르면 Bmi1은 정원 줄기 세포의 증식을 유지하는 데 매우 중요합니다[12]. 따라서 우리는 Cistanche glycoside I이 Bmi1에 대한 조절 효과가 있어 마우스 정원 줄기 세포의 증식을 촉진한다고 추측합니다. 웨스턴 블롯 결과는 Cistanche 배당체 I이 Bmi1 단백질의 발현을 상당히 상향 조절한다는 것을 보여주었습니다(그림 2).

2.3 Cistanche 배당체는 Akt 신호 전달 경로를 활성화합니다.

보고서에 따르면 인산화된 Akt는 세포 증식 및 분화와 밀접한 관련이 있다[13]. 따라서 우리는 Akt 인산화에 대한 icariin I의 영향을 조사했습니다. 우리는 Cistanche 배당체가 0.5 및 1 μM의 농도에서 Akt 인산화 발현을 상당히 상향 조절한다는 것을 발견했습니다(그림 3).

2.4 Bmi1의 Akt 하향조절 억제

이전 연구 보고서[14]에 따르면 농도 10(μM)의 Akt 억제제(MK-2206)를 선택했으며 p-Akt를 억제하면 Bmi1이 유의하게 억제된다는 사실을 발견했습니다. 이 결과는 Bmi1 발현이 Akt에 의해 조절됨을 나타냅니다(그림 4).

그림 1: 마우스 정원 줄기 세포에 대한 Cistanche 배당체 I의 효과

A. MTT 분석을 사용하여 3일 동안 Cistanche 배당체 I 처리가 마우스 정원 줄기 세포의 생존력에 미치는 영향을 검출했습니다. B. EdU 세포 증식 실험은 Cistanche 배당체 처리 3일 후 생쥐 정조 줄기 세포의 증식을 검출하기 위해 사용되었으며 통계 분석 차트; *피<0.05, * * P<0.01 compared to the control group, n=3.

그림 2: Bmi1 단백질에 대한 Cistanche 배당체 I의 효과

Cistanche deserticola 배당체 I 처리가 24시간 후 마우스 정조 줄기세포에서 Bmi1의 발현에 미치는 영향을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 사용했으며, 통계 지도도 제시했습니다* P<0.05, compared to the control group, n=3.

그림 3: Akt 신호 전달 경로에 대한 Cistanche 배당체 I의 효과

Cistanche Cistanche glycoside I 처리 24시간 후 생쥐 정조 줄기세포에서 Akt 및 Akt 인산화 발현을 검출하기 위해 Western blot assay를 이용하였고, 통계지도도 제시하였다** P<0.01, compared to the control group, n=3.

그림 4: Bmi1에 대한 Akt 억제제의 효과. Akt 저해제 처리 24시간 후 마우스 정조 줄기세포에서 인산화된 Akt와 Bmi1의 발현을 검출하기 위해 Western blot 실험을 이용하여 통계도를 제시하였다* P<0.05 * * P<0.01, compared to the control group, n=3.

2.5 Bmi1의 침묵은 Akt 발현에 영향을 미치지 않습니다.

Bmi1과 Akt 사이의 업스트림-다운스트림 관계를 추가로 검증하기 위해 Bmi1을 침묵시키고 세포 Akt 발현의 변화를 관찰했습니다. 첫째, Bmi1의 다른 서열의 siRNA를 마우스 세포에 형질감염시켜 형질감염 효율을 조사했습니다. RT PCR 실험 결과 siBmi1-1, siBmi1-2 및 siBmi1-3 모두 Bmi1의 발현을 유의하게 감소시켰으며, siBmi1-2 및 siBmi1-3 더 나은 효과가 있습니다(그림 5A). 웨스턴 블롯은 siBmi1-2 및 siBmi1-3 모두 Bmi1 단백질 수준을 상당히 감소시킬 수 있음을 추가로 확인했습니다(그림 5B). 따라서 후속 연구를 위해 siBmi1-2 및 siBmi1-3를 선택했습니다. 흥미롭게도 RT-PCR은 Bmi1을 침묵시키는 것이 Akt 발현에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했습니다(그림 5C). 위의 결과는 Akt가 Bmi1의 업스트림에 위치함을 나타냅니다.

그림 5: Bmi1 침묵이 Akt에 미치는 영향

A. Bmi1 유전자의 발현에 대한 3개의 침묵화 서열의 효과에 대한 RT-PCR 분석; B. 웨스턴 블롯 실험을 사용하여 siCtrl과 비교하여 Bmi1 단백질 침묵에 대한 3개의 상이한 siRNA 서열의 효과를 검출하고 통계 분석을 수행하였다; C. Akt 유전자** P에 대한 Bmi1 침묵 효과의 RT-PCR 분석<0.01, * * * P<0.001 compared to the control group, n=3.

3 토론

불임은 인류사회의 지속가능한 발전을 심각하게 저해하고 있으며, 남성 불임환자가 전체 불임환자의 50%를 차지합니다. 의료 기술의 지속적인 발전으로 남성 불임의 임상적 치료 수준이 크게 향상되었습니다. 그러나 보조생식술과 같은 기존의 외과적 치료 방법은 비용이 높고 성공률이 낮은 단점이 있으며, 수혜자 범위가 작습니다. 고환 미세정자 채취 시 완전 무정자증이 있고, 유전적 질환이 명확하며, 여러 가지 이유로 치료를 꺼리는 환자에게 적합하다[16]. 따라서 국내외적으로 남성 불임에 대한 보다 안전하고 신뢰할 수 있는 치료 방법을 개발하기 위한 노력이 이루어지고 있으며 약물 요법은 남성 불임 분야의 연구 핫스팟이 되었다[17]. 기존의 임상 실습은 중국의 한약이 남성 불임 치료에 좋은 효능과 안전성을 가지고 있음을 보여주었습니다[18].

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Cistanche 배당체는 최근 한의학에서 남성 불임 치료에서 뜨거운 주제입니다. 주성분인 Cistanche glycoside는 면역기능강화[19], 남성 생식기능강화[20], 항산화제[21], 골다공증 예방[22] 등 다양한 약리작용을 한다. Cistanche glycoside가 인체에 들어간 후 작용기전을 보다 명확히 하기 위하여 본 연구에서는 Cistanche glycoside의 가수분해물인 Cistanche glycoside를 연구대상으로 선정하여 가수분해물이 약리작용을 발휘하는 구체적인 기전을 탐색하였다. 첫째, 우리는 Cistanche glycoside I이 마우스 정원 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있음을 발견했습니다. Cistanche 배당체 I이 농도 의존적 ​​방식으로 마우스 정조 줄기 세포의 증식을 촉진하지 않았다는 점은 주목할 가치가 있으며, 이는 Cistanche 배당체 I이 용량 안전 범위를 가지고 있음을 나타냅니다. 다음으로 우리는 Cistanche 배당체 I이 남성 생식 기능과 밀접한 관련이 있는 Bmi1 단백질의 발현 수준을 상당히 상향 조절한다는 것을 발견했습니다. 최근 연구자들은 Bmi1의 부재가 수컷 생쥐의 생식 기능에 심각한 영향을 미칠 수 있으며 주로 정자 과소증과 고환 비대에서 나타날 수 있음을 발견했습니다[23]. 한편, 우리 연구 그룹의 또 다른 연구에서도 Bmi1을 억제하면 정원 줄기 세포의 증식 능력에 심각한 영향을 미칠 수 있음을 확인했습니다. 따라서 우리는 마우스 정원 줄기 세포의 증식을 촉진하는 Cistanche glycoside I이 Bmi1 발현 조절과 관련이 있을 수 있다고 추측합니다. 보고서에 따르면 p-Akt는 세포 증식 및 분화와 밀접한 관련이 있습니다[14]. 따라서 우리는 Cistanche glycoside I에 의해 유발된 p-Akt 단백질의 변화를 테스트했으며 Cistanche glycoside I도 p-Akt를 상향 조절한다는 것을 발견했습니다. 마지막으로 Akt와 Bmi1 간의 업스트림 및 다운스트림 관계를 조사했습니다. 서로 다른 실험실[24-25]에서 얻은 Bmi1과 Akt 사이의 업스트림 및 다운스트림 관계의 연구 결과에 차이가 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이 연구의 결과는 Akt 특이적 억제제가 Bmi1을 하향 조절하는 반면 Bmi1을 침묵시키는 것은 Akt mRNA 수준에 영향을 미치지 않음을 나타내며, 이는 Akt가 Akt에 의해 조절되는 Bmi1의 업스트림일 수 있음을 나타냅니다. Bmi1이 Akt에 미치는 영향에 대한 연구에서 우리는 mRNA 수준에서만 조사했습니다. Bmi1은 전사 억제제이므로 Bmi1 단백질과 Akt 단백질 사이에 상호 작용이 있을 수 있다고 추측합니다. 그러나 현재 Akt와 Bmi1 간의 업스트림 및 다운스트림 관계를 확인하는 완전한 증거는 없습니다. 따라서 향후 이를 보완 및 개선하도록 하겠습니다.

Cistanche-Tonifying 신장의 효과

요약하면, 본 연구는 Cistanche glycoside I이 정원 줄기세포의 증식을 촉진하는 효과가 있음을 처음으로 밝혀내어, Cistanche glycoside I이 세포 수준에서 정원 줄기세포의 증식을 촉진하는 새로운 기작을 밝혀 이론적 근거를 풍부하게 하였다. 남성 불임의 임상 치료에 Cistanche 배당체의 적용을 위해.

참조

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