Cistanche Glyside Rg1은 SAMP8 마우스에서 NOX4/NLRP3 Inflammasome을 억제하여 노화로 인한 간 섬유증을 개선합니다.

추상적인.노화동반되는 경우가 많다간 손상그리고섬유증, 결국 감소로 이어짐간 기능. 그러나, 메커니즘노화로 인한 간 손상그리고섬유증우리가 아는 한 아직 완전히 이해되지 않았으며 현재 간 노화에 사용할 수 있는 효과적인 치료 옵션이 없습니다. Cistanche Glycoside Rg1(Rg1)은 강력한 항산화 및 항염증 활동으로 인해 강력한 노화 방지 효과를 발휘하는 것으로 보고되었습니다. 본 연구는 Rg1의 보호 효과와 기본 작용 메커니즘을 조사하는 것을 목표로 했습니다.노화로 인한 간 손상그리고섬유증~에노화 가속마우스 경향성 8(SAMP8) 마우스를 9주 동안 치료했습니다.

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조직병리학적 결과는 간세포의 배열이 무질서하고 대부분의 세포에서 액포와 같은 변성이 일어나고 콜라겐 IV와 TGF- 면역조직화학을 통해 검출된 1 발현 수준도 SAMP8 그룹에서 상당히 상향 조절되었습니다. Rg1 처리가 현저하게 개선됨노화로 인한 간 손상 및 섬유증, 콜라겐 IV 및 TGF‑의 발현 수준을 상당히 하향 조절했습니다. 1. 또한, dihydro ethylene 염색과 western blot 결과 Rg1 처리가 활성산소종(ROS)과 IL-1의 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다. , NADPH 산화효소 4(NOX4), p47phox, p22phox, 인산화 NF‑의 발현 수준을 하향 조절했습니다.κB, caspase-1, C-말단 caspase 모집 도메인 및 3(NLRP3) inflammasome을 포함하는 NLR 계열 피린 도메인을 포함하는 세포사멸 관련 반점 유사 단백질로, 노인 SAMP8 마우스의 간 조직에서 상당히 상향 조절되었습니다. 결론적으로, 본 연구의 결과는 Rg1이 약화될 수 있음을 시사한다.노화로 인한 간 손상 및 섬유증NOX4 매개 ROS 산화 스트레스를 줄이고 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제합니다.

소개

간 섬유증은 주로 원섬유 콜라겐(3)과 같은 세포외 기질의 지속적인 침착 및 재흡수와 관련된 역동적인 과정으로, 종종 간(4)의 정상적인 기능을 방해하는 구조적 왜곡 및 기능 장애의 첫 번째 단계입니다. 치료하지 않으면 간 섬유증이 진행된 간경화 및 간종양으로 이어질 수 있습니다(4). 축적된 증거에 따르면 간 섬유화 및 간염에 대한 감수성이 나이가 들면서 크게 증가합니다(5). 따라서 노화 관련 간 섬유증을 예방하기 위한 새로운 전략을 제공하기 위해 간 노화 및 관련 기본 메커니즘을 연구하는 것이 매우 중요합니다.7

카스파제-1의 인식 수용체 및 C-말단 카스파제 모집 도메인(ASC)을 포함하는 세포사멸 관련 반점 유사 단백질. 이전 연구 결과에 따르면, 간을 비롯한 수많은 조직에서 편재적으로 발현되는 인플라마좀의 일종인 NLRP3 인플라마좀이 간 섬유증의 진행과 간 손상 및 노화 관련 간 질환의 진행에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 20‑22). 박테리아, 바이러스 및 곰팡이 병원균뿐만 아니라 ATP 및 콜레스테롤 결정과 같은 다양한 자극제에 의해 활성화될 때 NLRP3 inflammasome은 IL-1과 같은 일련의 전염증성 사이토카인의 성숙을 촉진하여 염증에 반응합니다. 및 IL-18(25). 또한 과도한 ROS 축적은 노화 과정에서 간에서 NLRP3 inflammasome을 활성화시켜 결국 노화 관련 간 질환으로 이어진다고 보고되었다(26).

재료 및 방법

Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98퍼센트 ; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.) 9주 동안 하루에 한 번. SAMP8 및 SAMR1 그룹은 9주 동안 증류수로 처리되었다. 9주간의 치료 후, 각 그룹에서 6마리의 마우스를 경추 탈구로 희생시켰다. 간을 수확하여 추후 Western blotting 실험에 사용하기 위해 -80˚C에 보관하거나

tome(Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH) -20˚C. 절편을 PBS로 세척하고 실온에서 5분 동안 5 mg/l Hoechst 33258 용액(Sigma-Aldrich; Merck KGaA)과 함께 배양했습니다. 그런 다음 섹션을 항형광 소광제(Beyotime Institute of Biotechnology)로 밀봉하고 형광 현미경(Olympus IX72; Olympus Corporation; 배율, x400)을 사용하여 시각화했습니다. Image Pro Plus 6.0 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 ROS 생성을 나타내기 위해 각 섹션에서 무작위로 선택된 3개의 시야에서 적색 형광의 평균 밀도를 감지했습니다.

간 조직의 병리학적 검사.

간의 형태학적 변화는 H&E, PAS(periodic acid-Schiff), Masson's trichrome 염색법을 이용하여 조사하였다. H&E 염색은 조직의 병리학적 변화를 관찰하는 가장 일반적인 방법이다(38). 간단히 말해서, 간 표본을 24~48시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하고 탈수 및 파라핀 포매한 다음 5μm 두께로 절단했습니다. 간 절편(n=4)을 크실렌에서 탈파라핀 처리하고 등급별 알코올 계열(무수 에탄올, 85% 에탄올, 75% 에탄올)로 재수화한 다음 헤마톡실린으로 3분, 에오신으로 30초 동안 염색했습니다. 이 모든 단계는 실온에서 수행되었습니다. 섹션을 중성 수지로 밀봉하고 광학 현미경(Olympus IX72; Olympus Corporation; 배율, x200)을 사용하여 관찰했습니다.

면역조직화학 염색.

H&E 염색에 대해 설명된 방법에 따라 파라핀 포매 섹션(n=4)을 탈파라핀화하고 재수화했습니다. 그런 다음 절편을 37˚C에서 10분 동안 3% H2O2와 함께 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 차단한 후 항원 검색을 위해 전자레인지에서 끓는 구연산나트륨 완충액에 7분 동안 담급니다. 이후 절편을 10% 염소 혈청(카탈로그 번호 C0265, Beyotime Institute of Biotechnology)과 함께 37˚C에서 30분 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단했습니다. 그런 다음 섹션을 다음 1차 항체와 함께 4˚C에서 밤새 배양했습니다: 토끼 다클론 항콜라겐 IV(1:100; Bioworld Biotechnology,Inc.; 카탈로그 번호 BS1072), 토끼 다클론 항NLRP3(1:100; Bioworld Biotechnology, Inc., 카탈로그 번호 BS90949) 및 토끼 다클론 항-TGF-1(1:100, Abcam, 카탈로그 번호 ab92486).

웨스턴 블로팅.

간 조직(n{0}})에서 RIPA 용해 완충액(cat. no. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) 및 자동 시료 급속 분쇄기(Jinxing Industrial Development Co.,Ltd)를 사용하여 총 단백질을 추출했습니다. .) 4˚C에서 60초 동안 65Hz에서. 총 단백질은 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화되었고 단백질(20µg)은 8-15% SDS/PAGE를 통해 분리되었습니다. 이어서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인(MilliporeSigma)으로 옮기고 실온에서 1시간 동안 TBS‑0.05% Tween‑20(TBST) 완충액에서 5% 탈지유로 차단했습니다. 그런 다음 막을 다음 1차 항체와 함께 4˚C에서 밤새 배양했습니다: Anti‑NLRP3(1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; 카탈로그 번호 BS90949), anti‑ASC(1:1) ,000; BIOSS; 카탈로그 번호 bs‑67412‑R), 항카스파제‑1(1:1,000; Abcam; 카탈로그 번호 ab1872), 항‑IL‑1 (1:500; Abcam; 카탈로그 번호 ab9722), 항-NOX4(1:1,000; Bioworld Biotechnology,Inc.; 카탈로그 번호 BS60435), 항-p47phox(1:1,{ {40}}; Bioworld Biotechnology, Inc.; 카탈로그 번호 BS4852), 항-p22phox(1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; 카탈로그 번호 BS60290), 항-NF-κB p65(1:1,000; 우한서비스과기유한회사;

1차 항체 배양 후 멤브레인을 TBST로 3회(매회 10분) 세척하고 HRP 결합 염소 항토끼 IgG(1:10,000; Affinity Biosciences; cat. no. S)로 배양했습니다. 0001) 및 염소 항마우스 IgG(1:10,000 Affinity Biosciences; 카탈로그 번호 S0002) 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 처리합니다. ECL 키트(Bio‑Rad Laboratories, Inc.) 및 Bioshine Chemi Imaging System(Q4600 Mini; Shanghai Bioshine Technology)을 사용하여 단백질 밴드를 시각화했습니다. ImageJ 1.53a 소프트웨어(National Institutes of Health)를 사용하여 각 밴드의 광학 밀도를 반정량화하고 GAPDH 발현으로 정규화했습니다.

통계 분석.

모든 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시됩니다. GraphPad Prism 8.0 소프트웨어(GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 단방향 ANOVA에 이어 Tukey의 사후 검정을 수행하여 그룹 간 차이를 비교했습니다. 피< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

결과

Rg1이 노화 관련 간 섬유증을 완화하는지 알아보고, Masson 염색을 사용하여 간 조직에서 콜라겐 침착을 측정했습니다. 결과는 SAMR1 그룹에 비해 SAMP8 그룹의 간 조직에서 파란색 양성 영역이 유의하게 증가했음을 보여주었습니다(그림 2A 및 B). 그러나 SAMP8 모델군에 비해 tempol, apocynin, Rg1(5 및 10 mg/kg) 처리군에서 콜라겐 침착 정도가 유의하게 감소하였다(도 2A 및 B). 또한 면역조직화학적 염색법을 이용하여 간조직에서 콜라겐 IV와 TGF-1의 발현량을 측정하였다.

콜라겐 IV 염색 결과, SAMR1 그룹의 간 조직에서 콜라겐 IV가 낮은 수준으로 발현됨이 밝혀졌다(도 3A 및 C). 그러나 SAMR1 그룹에 비해

Rg1 처리는 SAMP8 마우스의 간에서 ROS 생성 및 NOX4 발현을 감소시킵니다. ROS는 간 섬유화증의 발달에 중요한 요소입니다(41). 본 연구에서는 ROS 프로브인 DHE를 사용하여 간 조직에서 ROS 생산 수준을 감지했습니다. 결과는 SAMR1 그룹의 간 조직에서 낮은 수준의 ROS 생산이 있음을 보여주었습니다. 그러나 SAMR1군에 비해 SAMP8군에서 ROS 생성량이 유의하게 증가하였고(Fig. 4A, B), SAMP8군에 비해 tempol, apocynin, Rg1 (5 and 10 mg/kg) 처리군에서는 유의하게 증가하였다. 간 조직에서 ROS 생산 수준을 감소시켰습니다(그림 4A 및 B). NOX4가 노화 동안 ROS 축적에 미치는 영향을 확인하기 위해 NOX4 관련 단백질의 발현 수준을 분석했습니다. 결과는 SAMR1 그룹과 비교하여 간 조직에서 NOX4, p22phox 및 p47phox의 발현 수준이 SAMP8 그룹에서 상당히 상향 조절되었음을 보여주었습니다(그림 5A-D).

그러나 SAMP8 그룹과 비교하여 tempol, apocynin 및 Rg1(5 및 10mg/kg) 처리는 노화 동안 간 조직에서 NOX4, p22phox 및 p47phox의 발현 수준을 유의하게 하향 조절했습니다(그림 5A-D). 이러한 데이터는 Rg1 치료가 생쥐에서 노화하는 동안 NOX4를 억제함으로써 간 조직에서 ROS 유발 산화 스트레스 손상을 개선할 수 있음을 시사합니다.