Cistanche Tubulosa는 세포사멸 및 신경교세포 유래 신경영양 인자의 조절을 통해 도파민성 뉴런을 보호합니다: 생체 내 및 생체외-Ⅰ
Sep 05, 2024
소개
파킨슨병(PD)은 퇴행으로 인해 흑색질(SN)의 도파민 신경세포가 소실되는 병리학적 징후를 보이는 노인에서 발생하는 일반적인 신경퇴행성 질환입니다. 질병의 중증도는 SN의 도파민(DA) 신경세포 손실과 상관관계가 있으며, 이는 증상이 나타나기 전 수년에 걸쳐 신경변성 과정이 진행된다는 견해와 일치합니다.소울과 마이어스, 1993). 질병의 진행성 특성은 근본적인 신경변성 과정을 차단함으로써 치료적 개입에 대한 흥미로운 가능성을 제시합니다. 따라서 DA 뉴런 생존에 대한 신경 영양 인자의 치료 유발 강력하고 구체적인 작용에 대한 검색은 상당한 관심을 끌고 있습니다.
도파민 뉴런 보호를 위한 천연 CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%
신경영양인자는 신경성장인자(NGF), 뇌유래 신경영양인자(BDNF), 신경교세포유래 신경영양인자(GDNF)를 포함하는 필수 단백질로, 신경 성장, 신경 발달, 축삭 유도 및 신경 기능을 촉진합니다. 도파민성 뉴런의 복구를 보호하고 촉진하는 모든 신경영양 인자 중에서 GDNF는 가장 강력한 효과를 갖는다(Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). GDNF는 시험관 내에서 DA 뉴런에 대한 강력한 신경 영양 효과를 보유하고(Lin et al., 1993) 생체 내에서 신경 보호 효과를 발휘하는 것으로 나타났습니다. GDNF는 쥐의 수술 또는 독소 유발 축삭절단술 후 병변 유발 세포 사멸로부터 흑색질 DA 뉴런을 구출하는 것으로 나타났으며(Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) 부분적으로는 이후에도 전신 투여N-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP)생쥐에서 (Tomac et al., 1995). 다양한 병리학적 요인에 의해 잠재적으로 촉발될 수 있는 신경세포 사멸의 증가된 발생률과 신경영양성 인자의 감소된 보호 효과는 도파민성 신경세포의 변성의 기초가 됩니다(Holden et al., 2006).
C. tubeulosa는 Cistanche 속의 여러 식물에서 유래한 약초입니다. 이는 한의학(TCM)의 안드로겐 호르몬과 밀접한 관련이 있는 신장 결핍 증후군의 주요 치료 옵션입니다. 현재까지 C. tubeulosa에 대한 많은 임상 및 기초 연구에서 신경퇴행성 질환의 활동이 밝혀졌습니다. 따라서 PD 치료에서 TCM 신장 강화 처방의 확인은 PD에 대한 대체 임상 치료법을 제공할 수 있습니다.에키나코사이드(ECH)약초인 C. tubeulosa에서 발견되는 주요 생리활성 성분입니다. 연구에 따르면 Cistanche 및 ECH 배당체의 치료 효과가 나타났습니다.베르바스코사이드(VER), 알츠하이머병(AD), PD 및 기타 혈관성 치매 환자에 대한 이카리인(ICA)(Urano and Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wuet al. (2014)은 충분한 ECH와 acteoside를 함유한 C. tubeulosa 추출물이 아밀로이드 침착을 차단하고 콜린성 및 해마 도파민성 신경 기능을 역전시킴으로써 A-42로 인한 인지 기능 장애를 개선했다고 제안했습니다. Taoet al. (2015)은 다음을 발견했습니다.페닐에타노이드 배당체C. tubeulosa(Ph Gs-Ct)의 추출물은 쥐 모델의 뇌 조직에서 AQP4의 단백질과 mRNA 발현을 감소시켜 고지대 뇌부종을 예방했습니다.
천연 CISTANCHE TUBULOSA 추출물 스낵은 기억력을 향상시킵니다. PHGS75% ECH 30% ACT 12%
이전 연구에서는 C. tubeulosa, epimedium 및 rhizomapolygonati의 세 가지 성분을 포함한 한약 화합물이 신경 영양 인자의 발현을 조절하여 도파민 신경 세포의 손상을 완화하고 도파민 수준을 증가시키는 것으로 나타났습니다(Wu et al., 2013). 따라서 C. tubeulosa에 의해 유도된 신경 보호 효과가 오래 지속되는지 여부와 GDNF 투여에 의한 흑질 DA 뉴런의 구조가 PD 동물의 증상과 관련된 운동 행동의 유의미한 보존을 어느 정도까지 제공할 수 있는지는 아직 알려져 있지 않습니다. 이 연구에서는 중국에서 국가 특허(특허 번호: 2011103028541)를 받았으며 이전에 PD에서 특정 치료 효과를 보여준 TCM 신장 강화 처방인 C. tubeulosa 나노분말을 사용했습니다. 따라서 본 연구는 C. tubeulosa 치료의 신경 보호 및 재생 효과를 조사하고 MES23.5 세포 및 행동 결정 쥐의 세포 사멸과 일련의 표적 테스트로 측정된 GDNF의 조절을 조사하기 위해 고안되었습니다. .
재료 및 방법
재료, 시약 및 장비
C. tubeulosa는 중국 베이징의 Beijing Tong Ren Tang Group, Ltd.에서 구입했습니다. ECH, VER 및 ICA는 중국 국립 식품 의약품 통제 연구소에서 나왔습니다. MES23.5 도파민성 신경 세포주는 중국 베이징 수도 의과대학 신경생물학 연구소 Biao Chen 교수의 선물이었습니다. 50마리의 C57BL/6 수컷 마우스(각각 무게 20-25g)는 중국 상하이에 있는 Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.(라이센스 번호: SCXK2012-0002)에서 구입했습니다.
MPP+, MTT 및 글루타민은 Sigma-Aldrich(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했습니다. DMEM/F12 배지와 소 태아 혈청은 Gibco Co.(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에서 구입했습니다. MPTP, DA 표준 및 HVA(homomovanillic acid) 표준은 Sigma-Aldrich(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했습니다. -actin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF 계열 수용체 알파(GFR 1) 및 Ret 항체는 Cell Signaling Technology, Inc.(Beverly, MA, USA)에서 구입했습니다. 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 염색 시약 키트는 Fuzhou Maixin Biotech., Ltd.(Fujian, China)에서 구입했습니다. SDS-PAGE 젤 샘플 준비 키트, 초민감 강화 화학발광(ECL) 검출 키트 및 BCA(bicinchoninic acid) 분석은 Beyotime Institute of Biotechnology(Beijing, China)에서 구입했습니다.
이 연구에서는 다음 장비를 사용했습니다: ELX800 마이크로플레이트 리더(Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2 인큐베이터(Heraeus, Hanau, Germany); Gel DOC 2000 겔 영상 분석 시스템, 전기영동 셀 및 전기영동 탱크(Bio-Rad, Hercules, CA, USA); DU-650 단백질 분석기(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R 고속 냉장 원심분리기(Eppendorf, Hamburg, Germany); SXQM 이중 유성 볼 밀(Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, China); MM400 혼합기 밀(Retsch GmbH, Haan, Germany); Agilent 1200 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); PowerPac Basic 전기영동, PowerPac Basic 막관통 전달 시스템, Universal Hood II 화학발광 이미저, S1000 Thermal Cycler RNA 역전사 시스템(Bio-Rad); Motic Med 6.0 조직 및 세포 이미지 분석 시스템(Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).
준비C. 투불로사나노분말
C. tubeulosa의 무게를 측정한 다음 정제하고 탈수했습니다. 통상적인 분쇄 후 C. tubeulosa 미세분말을 200-메시체에 통과시킨 후 동결건조하였다. C. tubeulosa 나노분말을 제조하기 위해 온도 조절 진공 및 고에너지 볼밀을 사용했습니다. 먼저, C. tubeulosa 나노분말을 카바이드 분쇄 볼이 장착된 진공 볼 밀링 탱크에 넣었습니다. 그라인딩 볼과 C. tubeulosa 나노분말 사이의 비율은 15:1에서 5:1 범위였습니다. 미세한 분말을 얻기 위해 고에너지 볼밀의 속도는 300rpm, 지속시간은 20분으로 설정하였다. 나노 규모 물질의 가공을 위해 미세 분말의 무게를 측정하고 믹서 밀에서 25/s의 주파수와 20초의 진동으로 3회 반복 처리했습니다. PBS를 사용하여 25mg/mL 스톡 용액을 용해 및 준비한 후 30분 동안 초음파 처리하고 오토클레이브한 후 마지막으로 -20°C에서 보관했습니다.
활성 성분의 품질 관리C. 투불로사HPLC로
ECH와 VER는 옥타데실실란 결합 실리카를 필러로, 메탄올을 이동상 A로, 0.1% 포름산 용액을 이동상 B로 사용하여 구배 용출을 포함했습니다. 검출 파장은 330nm였습니다. ICA에는 옥타데실실란 결합 실리카를 필러로 사용하고 아세토니트릴-물(30:70)을 이동상으로 사용하는 구배 용출이 포함되어 있습니다. 검출 파장은 270nm였다. 테스트를 위해 샘플, 컨트롤, 음성 컨트롤이 각각 10μL로 측정되었습니다.
MPP의 생존 가능성을 측정하기 위한 세포 배양 및 MTT 분석+-처리된 세포
MES23.5 세포에 5% 송아지 태아 혈청, 1% 글루타민, 2% 5{11}}× Sato 용액 및 2% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 배지를 접종했습니다. 그들은 포화 습도가 있는 5% CO2 인큐베이터에서 37°C로 배양되었습니다. 세포를 분리하고 0.25% 트립신으로 계대배양하고 세포 현탁액을 대수 성장 단계에서 수확했습니다. 1 x 105 밀도의 분리된 세포를 폴리라이신으로 코팅된 96- 웰 플레이트에 시딩한 후 다양한 최종 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 및 800 µmol/L)를 첨가했습니다. ) MPP+ 미디어. 24시간 및 48시간 동안 일반 배양 배지와 함께 배양된 MES23.5 세포를 시험관 내 실험에서 음성 대조군으로 사용했습니다. 서로 다른 처리 그룹의 세포를 MTT 시약과 함께 4시간 동안 배양했습니다. 이어서 웰의 용액을 버리고 150 μL의 DMSO를 첨가하고 10분 동안 진동시켰습니다. 570 nm 파장에서 각 샘플의 흡광도는 자동 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정되었습니다. 세포 생존율(%)= 실험군의 평균 흡광도/음성 대조군의 평균 흡광도 × 100%입니다.
시험관내 배양에서와 동일한 접근법을 사용하여 MES23.5 세포에서 24-시간 처리를 위해 관련 농도의 MPP+ 배지를 첨가했습니다. 처리 후, 웰의 용액을 폐기하였다. 다양한 농도(10, 50, 100, 200, 250, 500 및 1000μg/mL)의 C. tubeulosa 나노분말을 함유한 배지를 다양한 웰의 MES23.5 세포에 첨가하고 24시간 및 48시간 동안 배양했습니다. 24시간 및 48시간 동안 일반 배양 배지와 함께 배양된 MES23.5 세포를 음성 대조군으로 사용했습니다. MPP+ 배지와 함께 배양된 MES23.5 세포를 비히클로 사용했습니다. 측정은 각 샘플에 대해 3회 수행되었습니다. 해당 처리군과 대조군의 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산했습니다.
천연 시스탄체 투불로사 추출물 피로 방지 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
면역세포화학으로 측정한 TH 발현
C. tubeulosa 나노분말이 100, 200 및 250 µg/ml인 경우 세포 생존율이 크게 증가했습니다(그림 2G). 따라서 후속 실험에서는 저용량, 중간 용량, 고용량의 3가지 농도로 테스트를 진행했습니다. C. tubeulosa 그룹 각각에 대해 3개의 복제를 테스트했습니다. 멸균된 폴리라이신 코팅 커버슬립을 6-웰 플레이트에 넣었습니다. 다음으로, 각 웰에 5×104개의 세포를 파종하고 24시간 동안 배양하였다. 정상 대조군에서는 기존의 새로운 배지로 교체하였고, 나머지 처리군에서는 최종 농도 100 µmol/L MPP+ 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 일반 대조군과 비히클 그룹에서 기존의 새로운 배지를 교체하고 최종 농도 100, 200 및 250μg/mL C. tubeulosa 나노분말을 저용량, 중간 용량 및 고용량으로 24시간 동안 세포와 함께 배양했습니다. C. tubeulosa 처리 그룹. 다른 그룹의 MES23.5 세포를 PBS로 3회 세척하여 상층액을 제거하고 4% 파라포름알데히드에서 15분 동안 추가로 고정시켰습니다. PBS로 세척한 후 세포를 퍼옥시다제 차단제와 함께 37℃에서 30분간 배양한 후 PBS로 다시 세척했습니다. 0.2% Triton X-100 용액을 사용하여 10분간 세포 투과성을 확보한 후 PBS로 세척했습니다. 각 샘플에 일반 염소 혈청을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양했습니다. 그런 다음 정상적인 염소 혈청을 제거하고 PBS에 1:400으로 희석된 1차 항체를 각 샘플에 첨가하고 4°C에서 밤새 배양했습니다. 음성 대조군의 세포는 밤새 4℃에서 PBS와 함께 배양되었습니다. PBS로 세척한 후, 세포를 37℃의 수분 챔버에서 20분간 비오틴으로 표지된 2차 항체와 함께 배양했습니다. 그런 다음 각 샘플을 PBS로 세척하고 양고추냉이 퍼옥시다제-스트렙타비딘 접합체(작업 용액 C)로 37℃에서 20분 동안 표지했습니다. PBS로 세척한 후 세포를 어두운 곳에서 약 1~10분 동안 DAB 시약으로 염색하고 광학 현미경으로 갈색의 발달을 모니터링했습니다. 그런 다음 각 샘플을 증류수에서 1~2분 동안 두 번 세척하고 핵을 헤마톡실린 용액으로 0.5~1분 동안 대비염색했습니다. 각 시료를 물에 충분히 헹구고 세포를 1% 염산알코올(분화용)과 1% 암모니아수에 담근 후 물로 충분히 세척하였다. 각 샘플의 세포를 70% 에탄올에서 2분, 80% 에탄올에서 2분, 90% 에탄올에서 2분, 95% 에탄올에서 2분, 100% 에탄올에서 2분 동안 탈수시켰다. 그런 다음 세포를 자일렌 용액에 2분 동안 두 번 담근 후 중성 수지가 들어 있는 유리 슬라이드 위에 올려 놓았습니다. 광학 현미경 하에서 각 샘플은 갈색 입자의 강도로 표시되는 도파민성 뉴런에서 선택된 단백질의 발현을 결정하고 평균 회색 값으로 단백질 함량을 반정량화하기 위해 이미지 캡처 및 5-10개의 유효 시야를 무작위로 선택했습니다. .
유세포분석법으로 측정한 MES23.5 세포의 세포사멸 속도
부착 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 세포 분리를 위해 실온에서 적당량의 EDTA가 없는 트립신 용액을 첨가하고 용액을 부드럽게 피펫팅하여 부착된 세포가 분리되도록 했습니다. 그런 다음 트립신화를 중지하기 위해 세포 배양 배지를 첨가했습니다. 혼합물을 새로운 원심분리 튜브에 옮긴 후 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여 분리된 세포를 수집하였다. 상청액을 버린 후, 세포 펠릿을 PBS를 사용하여 부드럽게 재현탁시키고 세포 수를 세었다. 대략 1×105내지 5×105개의 재현탁된 세포를 1500rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다. 5 마이크로리터의 Annexin V-FITC 결합 용액을 세포 펠릿에 첨가하여 세포를 부드럽게 재현탁시켰습니다. Annexin V-FITC 5μL를 더 첨가하고 완전히 혼합했습니다. 5 마이크로리터의 요오드화 프로피듐 용액을 유세포 분석 직전에 실온에서 10분 동안 배양하여 세포 염색에 사용했습니다.
웨스턴 블롯 분석시험관 내에서
세포를 정상군, MPP+ 치료군, 저용량군으로 나누었다.C. 투불로사치료군, 중등도 C. tubeulosa 치료군, 고용량 C. tubeulosa 치료군. Bcl2와 Bax의 발현을 각각 측정했습니다. 6-웰 플레이트의 웰당 총 1 x 105개의 세포를 세포 수확 전 각 그룹의 모델링 및 처리에 사용했습니다. RIPA 완충액, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제가 포함된 혼합 용해물을 첨가하여 얼음 위에서 3{19}}분 동안 세포를 용해했습니다. 원심분리 후 상청액을 단백질 분석에 사용하였다. 전체 단백질은 BCA 분석을 사용하여 정량화하고 10% SDS-PAGE로 분리했습니다. 분리된 단백질을 멤브레인으로 옮기고 5% 탈지유 차단 완충액과 함께 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 막을 1차 항체(Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0.11 mg/ml, 1:200 희석)에서 밤새 4°C에서 배양했습니다. 세척 단계 후, 막을 2차 항체(0.5 mg/ml, 1:5000 희석)에서 4℃에서 1시간 동안 배양한 후 ECL 현상액에서 2분 동안 배양하여 일반적인 현상을 수행했습니다. 단백질 발현의 반정량 분석에는 Quantity One 소프트웨어가 사용되었습니다.
피로 방지 간 보호를 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%
실험동물 모델링 및 의약품 관리
특정 병원체가 없는 8-주된 수컷 생쥐 50마리를 무작위로 5개 그룹으로 나누었습니다: 정상군, MPTP 처리군(차량), 저용량 C. tubeulosa 처리군, 중간 용량 C. tubeulosa 처리 그룹, 고용량 C. tubeulosa 치료 그룹. 동물들은 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 20~22°C에서 사육되었습니다. 정상군의 생쥐에는 연속 7일 동안 동량의 생리식염수를 복강내 주사하였다. 다른 치료군의 마우스에는 MPTP(30mg/kg/d)를 7일 연속 복강내 주사하여 비히클을 확립하였다.
PD 모델링 동안, 저용량, 중등도 용량 및 고용량 C. tubeulosa 처리 그룹의 마우스에 4g/kg/d, 8g/kg/d 및 16g/d의 동등한 임상 용량을 위내 투여했습니다. kg/일C. 투불로사 나노분말, 각각 연속 14일 동안. 대조군과 비히클 그룹의 마우스에는 연속 14일 동안 등가량의 생리 식염수를 위내 투여했습니다. 모든 실험 절차는 Fujian University of TCM 윤리위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물 사용 및 관리에 대해 국제적으로 인정되는 원칙에 따라 수행되었습니다. 본 연구에서는 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
