시스탄체 허바의 시스타노사이드는 산화 스트레스 억제를 통해 저산소증으로 인한 남성 생식 손상을 개선합니다-Ⅱ

체외에서 저산소증으로 인한 GC{1}} 세포 생존 가능성에 대한 Cis의 영향.

Cis가 GC{0}} 세포 생존 가능성에 대한 저산소증의 억제 효과를 예방할 수 있는지 조사하기 위해 CCK-8 분석을 수행했습니다. GC-1 세포를 다양한 하위 유형(Cis-A, B, C, H) 및 농도 범위(0.02 μM, 0.2 μM, 72시간 동안 2 μM)의 Cis. 모델 그룹과 DMSO 그룹을 비교하면 DMSO가 GC{{1{24}}}} 세포 생존 가능성을 직접적으로 촉진하지 않는 것으로 나타났습니다(그림 2A). 그러나 Cis 처리를 통해 세포 생존력이 현저하게 회복되었습니다(P < 0.05). 모델 그룹과 비교하여 Cis-A, Cis-B, Cis-C 및 Cis-H는 모두 저산소증으로 인한 GC{19}} 세포 생존력 손상에 대해 특정 보호 효과를 나타냈으며 Cis-B는 가장 유의미한 보호 효과를 나타냈습니다. 효과(그림 2A). 0.2 μM의 Cis 보호 효과는 0.02 μM의 Cis 보호 효과보다 상당히 높았으나, 2 μM과 0.2 μM의 차이는 명확하지 않아 회복된 것으로 나타났습니다. Cis에 의해 유도된 GC-1 세포 생존율은 0.02-0.2 μM의 농도 범위에서 용량 의존적 증가를 보여주었습니다(그림 2A). 따라서 실험적 필요에 따라 다음 in vitro 실험에서는 0.2 μM Cis를 최적 농도로 선택했습니다. 생식세포가 실제로 Cis에 의해 보호되는지 확인하기 위해 Cis 처리 후 GC{38}} 세포의 증식 변화를 평가하기 위해 FCM 및 Ki{37}} 염색을 수행했습니다. Cis 처리 시 G1 단계의 GC{39}} 세포 비율이 감소했습니다. 대조적으로, 더 많은 세포가 S기에 진입하여 Cis 처리가 생식 세포 증식 지수를 증가시킬 수 있음을 시사합니다(P < 0.01; 그림 2B). GC-1 세포 주기에 대한 통계는 그림 2Bb에 나와 있습니다. Ki-67 염색 결과에서도 Cis-A, Cis-B, Cis-C 및 Cis-H 처리가 저산소증 유발 GC{{54}의 Ki{52}}양성 세포 비율을 크게 향상시키는 것으로 나타났습니다. } 체외 세포(그림 2C).

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cis의 메커니즘은 체외에서 저산소증으로부터 생식 세포를 보호합니다.

GC{0}} 세포에 대한 Cis의 보호 효과가 과도한 ROS 제거와 관련이 있는지 조사하기 위해 형광 염료 DCFH-DA를 사용하여 각 그룹의 ROS 수준을 감지했습니다. 그림 3A 및 3B에서 볼 수 있듯이 DMSO 처리는 모델 그룹과 비교하여 세포 내 ROS 함량이나 LPO 수준을 변화시키지 않았습니다. 그러나 GC-1 세포의 ROS 수준은 Cis 처리 그룹에서 현저하게 감소했습니다(그림 3A). 또한, Cis를 적용한 GC-1 세포에서도 LPO의 감소가 관찰되었습니다(그림 3B).

Cis가 저산소 손상으로부터 생식 세포를 보호하는 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 TUNEL 염색 및 Western blot 분석을 수행하여 세포 사멸을 평가했습니다. TUNEL 염색(그림 3C)은 모델 및 DMSO 그룹에서 상당한 세포사멸을 보여주었습니다. 그러나 Cis 처리에서는 더 적은 수의 세포사멸 세포가 관찰되었으며, 이는 Cis 처리가 GC{1}} 세포의 세포사멸을 감소시켰음을 나타냅니다. 또한 분자 메커니즘을 확증하기 위해 PARP, Caspase-3, Bax 및 Bcl{3}}의 발현을 측정했습니다. 그림 3D에 제시된 바와 같이 Caspase-3 및 PARP는 저산소 상태에서 GC-1 세포에서 활성화되었으며 이 활성화는 Cis 처리에 의해 억제되었습니다. 또한 Bax/Bcl-2의 비율은 대조군보다 모델 그룹에서 더 높았으며 Cis 처리는 Bax/Bcl-2의 비율을 감소시켰습니다(그림 3D). 이러한 데이터는 Cis가 저산소증으로 유발된 산화 손상을 약화시킬 수 있는 잠재적인 능력을 가지고 있음을 나타냈으며, 이 보호 효과는 ROS 축적을 줄이고 Caspase관련 세포사멸 경로 활성화를 억제함으로써 달성될 수 있습니다.

OS를 억제하는 효소 메커니즘에는 글루타티온 환원효소(GR), 글루타티온 퍼옥시다아제(GPx) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)와 같은 자유 라디칼 제거제가 포함됩니다. OS를 억제하는 효소 메커니즘은 세포와 조직의 산화 손상을 예방하는 데 필수적인 역할을 합니다. GC-1 세포에서 저산소증 유발 OS에 대한 Cis 억제의 잠재적 메커니즘을 추가로 검증하기 위해 GR, GPx 및 SOD의 활성을 측정했습니다. 그 결과 GR, GPx 및 SOD 활동은 대조군과 비교했을 때 저산소증 하에서 모두 크게 감소했으며(P < 0.01, 그림 3E) Cis 치료는 이들의 활동을 현저하게 회복시켰습니다. 저산소증에 노출된 GC-1 세포(P < 0.05, 그림 3E)는 이러한 화합물이 강력한 내인성 항산화 시스템을 활성화할 수 있음을 시사합니다.

정자 생산 자극용 CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

저압 저산소증 유발 쥐의 생식에 대한 Cis의 영향.

수컷 쥐에 대한 저압 저산소증의 영향을 확인하기 위해 우리는 먼저 저압 저산소증 유발 쥐에서 고환의 형태학적 변화를 테스트했습니다. HE 염색 결과, 대조군에서는 다양한 단계의 정상 정자 형성 세포가 기저막부터 내강까지 질서정연하게 배열되어 있었고, 성숙한 정자가 세뇨관 내강에서 볼 수 있는 것으로 나타났습니다(그림 4A). 대조군과 비교하여, 모델군에서는 고환 조직의 병리학적 변화가 관찰되었고, 고환 상피 세포의 기저막이 느슨하게 배열되었으며, 정자 형성 상피가 극도로 얇았고, 생식 세포의 수준과 수가 현저히 감소했습니다(그림 4A). . 그러나 Cis를 사용한 치료는 생체 내 저압 저산소증으로 인한 고환 손상의 조직학을 현저하게 개선했습니다(그림 4A). 또한 체중, 고환 무게, 부고환 무게, 정낭 무게를 측정하여 생식 기관 지수(생식 기관/체중 비율)를 계산했습니다. 그림 4B-D에 표시된 대로 생식 기관 지수(고환, 부고환 및 정낭)는 대조군보다 모델 그룹(P < 0.01)에서 현저히 낮았습니다. 그러나 쥐의 생식 기관 지수에 대한 저압 저산소증의 효과는 Cis 치료로 역전되었습니다(그림4B-D).

다음으로 고환 기능 손상을 규명하기 위해 수컷 쥐 정자의 첨체효소활성과 생정자율도 측정하였다. 그림 4E, 4F에 나타난 바와 같이, 첨체 효소 활성 및 정자 운동성은 대조군보다 모델 그룹 쥐에서 더 낮았습니다(P < 0.01). 그러나 모델 그룹의 쥐와 비교하여 8 mg/kg/d Cis로 처리한 쥐에서 선체 효소 활성이 회복되었습니다(P < 0.05)(그림 4D). 더욱이, 도 4F에 도시된 바와 같이, Cis로 처리하는 경우에도살아있는 정자 비율을 향상시켰습니다.; 8 mg/kg/d Cis로 치료한 쥐는 모두 생존 정자 비율이 상당히 증가한 것으로 나타났습니다(55.83 ± 6.03%, P < 0.05; 69.{ 모델 쥐(43.83 ± 4.01%)와 비교했을 때 {8}} ± 2.29%, P < 0.01; 52.33 ± 3.40%, P < 0.05, 각각 53.67 ± 2.25%, P < 0.05 .

종합하면, 이러한 결과는 저압 저산소 환경이 수컷 쥐의 고환 형태적 변화, 생식 기관 체중 감소 및 고환 기능 손상을 초래하고 Cis가 저산소증으로 인한 손상으로부터 생식 기관을 효과적으로 보호할 수 있음을 시사합니다.

저압 저산소증 유발 쥐의 고환에서 Cis가 OS에 미치는 영향.

쥐의 고환에서 ROS와 LPO 수준을 측정하여 저압 저산소증으로 인한 OS에 대한 Cis의 영향을 분석했습니다. ROS 분석에 따르면 대조군과 비교하여 모델 그룹의 고환 내 ROS 수준이 크게 증가한 것으로 나타났습니다(P < 0.01 그림 5A). 반대로, LPO는 정상 산소 조건과 비교하여 저압 저산소증 하에서 고환(P < 0.01)에서 극적으로 증가했습니다(그림 5B). 그러나 Cis 처리는 위의 변화(P < 0.05)를 변경하여 Cis-B가 다른 Cis보다 더 나은 효과를 발휘했습니다(그림 5A, 5B). Cis는 생체 내 저압 저산소 상태에서 OS를 감소시켜 고환을 보호하는 것으로 보입니다.

또한 Cis가 저압 저산소증으로 인한 고환 기능 손상으로부터 보호되는 메커니즘을 추가로 평가하기 위해 세포 사멸 분석을 수행했습니다. TUNEL 염색 결과(그림 5C)는 대조군에 비해 모델 그룹에서 상당한 세포사멸이 존재함을 보여주었습니다. 그러나 Cis(8 mg/kg/d) 처리 후에는 세포사멸 세포가 더 적게 발생했습니다(P < 0.05)(그림 5C). Western blot 데이터는 또한 저산소증과 저압증 치료로 인해 Caspase-3 및 PARP가 활성화되고 고환 조직에서 Bax/Bcl-2 비율이 증가하여 세포사멸이 증가함을 나타냅니다(그림 5D). 또한, 다양한 유형의시스 치료고환 조직의 세포 사멸이 크게 감소했습니다 (그림 5D). 마찬가지로 고환 조직에 대한 IHC 분석에서도 비슷한 결과가 나타났습니다 (보충 그림 1).

저압성 저산소증에 의해 유발된 Cis 감소 OS의 메커니즘을 확인하기 위해 고환 조직에서 GR, GPx 및 SOD의 활동을 추가로 테스트했습니다. 그림 5E에서 볼 수 있듯이, 대조군과 비교하여 저압성 저산소증 치료는 GR, GPx 및 SOD 활동을 크게 감소시켰습니다(P < 0.01). 그러나 Cis 치료는 저압성 저산소증을 치료한 쥐의 고환 조직의 효소 활성(GR, GPx 및 SOD)을 회복시켰습니다(P < 0.05). 결론적으로 Cis는 저압성 저산소증 조건에서 강력한 내인성 항산화 효소 방어 메커니즘을 활성화하여 고환을 보호하는 것으로 보입니다.

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

논의

고지대에서 저압성 저산소증은 남성 생식 기관을 포함하여 인간의 여러 시스템에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다[4, 20]. 최근 실험적 조사는 저압성 저산소증이 남성 생식 기관을 손상시키는 메커니즘을 이해하는 데 맞춰져 있습니다. 본 연구에서는 저산소증으로 인한 생식 손상에 대한 Cistanches Herba의 Cis 추출물의 치료 효과를 조사했습니다. 결과는 Cis가 내인성 항산화 효소의 활성을 강화함으로써 저산소증으로 인한 ROS 축적 및 OS를 감소시킴으로써 저산소증 손상으로부터 남성 생식 기관을 보호할 수 있음을 입증했습니다.

ROS는 인간의 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을 하는 산소 유래 자유 라디칼입니다. 저용량 ROS는 다음과 같은 경우에 필수적입니다.정자수용량, 선체 반응 및 정자-난 모세포 융합 [24, 25]. 그러나 ROS가 과도하게 축적되면 생식세포와 간질세포가 손상되어 남성 불임으로 이어지는 경우가 많습니다[26]. ROS는 과산화를 통해 세포막, 핵산, 단백질, 효소 및 기타 생물학적 거대분자를 쉽게 손상시킬 수 있습니다. 더욱이, 항산화제 운반 능력을 초과하면 잠재적인 세포 및 DNA 손상을 초래할 수도 있습니다. 축적된 증거는 남성 생식력의 발병기전에서 ROS의 중추적인 역할을 뒷받침합니다[27, 28]. ROS의 생산은 산소 장력에 의해 조절됩니다. 저산소 상태에서는 환경의 이용 가능한 산소가 감소하고 혈액 점도가 증가하여 유기체의 많은 산소 의존 대사 과정에 영향을 미칩니다 [29, 30]. 그러나 높은 고도에서 낮은 기압은 정맥 환류를 저하시키고 혈류를 통해 유기체의 모든 세포로 운반되는 산소의 양을 감소시켜 장기와 세포의 저산소증을 더욱 증가시킵니다 [29, 30]. 따라서 높은 고도에 노출되면 산소 요구량이 혈관 공급을 초과할 때 ROS의 생성 및 축적을 포함한 일련의 저산소 생리학적 반응이 발생합니다. 이전에 언급한 바와 같이, ROS의 축적은 다양한 세포 내 효과를 일으키며, 그 중 가장 중요한 것은 세포에서 OS를 유발하는 것입니다.

OS는 산화와 환원 반응 사이의 불균형을 말하며, 다른 반응물로부터 전자를 받아들이는 과잉 산화제 또는 분자가 생성되어 차례로 ROS를 생성합니다 [31, 32]. OS는 높은 고도에 대한 노출을 포함하여 일련의 내인성 및 외인성 요인에 의해 유발될 수 있는 것으로 잘 알려져 있습니다. 정자는 세포 복구 시스템이 부적절하고 원형질막의 다중 불포화 지방산 함량이 높기 때문에 OS에 특히 취약한 세포입니다[33]. 저산소증에 노출된 쥐의 둥근 정자에서 심각한 OS의 존재가 관찰되었으므로 고환 및 부고환 조직도 예외는 아닙니다[4]. OS는 DNA의 안정성에 영향을 미치므로 배우자 유전 물질 [34-36]의 무결성을 위태롭게 합니다. 그러나 수컷 배우자의 높은 수준의 DNA 손상은 세포사멸 신호 전달의 활성화로 이어져 부고환 정자 수의 감소와 결함 세포의 비율 증가로 이어지는 것으로 확인되었습니다[28, 37]. 본 연구에서 저산소증은 세포사멸 및 세포주기 정지 유도를 통해 GC{7}} 세포의 생존능력을 크게 감소시켰습니다. 더 중요한 것은 저산소증 자극 후 FCM 분석에서 ROS 수준이 크게 증가한 것으로 나타났으며, 세포사멸 속도가 증가하고 Caspase{8}}, PARP 및 Bax/Bcl{9}} 비율의 활성화가 높아져 ROS가 활성화될 수 있음을 나타냅니다. 저산소증으로 인한 생식력 손상 동안 Caspase 신호 전달 경로를 활성화하여 세포 사멸. 이번 발견은 저산소증이 과도한 ROS 축적을 초래하여 생식 세포에 산화 손상을 일으킨다는 것을 보여주었습니다. 따라서 저산소증으로 인한 생식능력 손상을 완화하는 효과적인 접근법이 될 수 있는 새로운 항산화제를 식별하는 것은 의미가 있습니다.

OS로부터 보호하기 위해 신체에는 주로 효소 인자로 구성된 복잡한 항산화 시스템이 존재합니다. 생리학적 조건 하에서 ROS 함량과 항산화 시스템은 일정한 균형을 유지합니다. 그러나 ROS 과잉 생산은 정자 항산화 시스템을 고갈시켜 OS로 이어지며, 이는 정자 DNA 손상을 유발하고 출산율과 임신율을 저하시킵니다[23]. 따라서 남성 생식 기관의 세포 수준에서 ROS 과잉 생산 및 관련 유해 효과를 해결하기 위해 다양한 항산화 전략이 테스트되었습니다 [23]. 현재 항산화 활성을 갖는 화합물의 사용에 관한 문헌과정자 기능 개선광범위하다. 중요한 것은 대부분의 보고서가 다음을 포함하여 경구 항산화제 섭취 후 정자 매개변수의 개선을 기술하고 있다는 것입니다.정자 농도 개선및 운동성 또는 DNA 손상 감소 [38]. 따라서 OS 관련 문제로 인한 불임에 경구용 항산화제를 처방하는 비뇨기과 의사가 점점 늘어나고 있다[39]. 이러한 항산화제에는 주로 카르니틴, 비타민, 아연, 멜라토닌 및 천연 화합물이 포함됩니다[23, 40]. 현재 약물 추출 기술의 발달로 남성 불임 완화를 위한 한의학 추출물의 증가도 고려되고 있다. 이러한 항산화제는 OS의 파괴적인 영향을 감소시킬 수 있기 때문이다[41]. Yüce A. et al. 2013년에 계피가 고환과 정자의 질에서 산화 및 항산화 균형에 유익한 효과가 있다고 보고했습니다[42]. 장 L 외. 커큐민은 환자의 정자 운동성을 크게 향상시키고 H2O2를 감소시키는 것으로 나타났습니다 [43]. 또한 블루베리, 크로커스 사티부스(crocus sativus), 석류씨, 녹차와 같은 다양한 식물 추출물도 항산화 메커니즘을 통해 생식 기관을 보호하는 것으로 나타났습니다[27, 44-47]. Cistanches Herba는 특히 불임 치료에 유리한 안전성 프로필과 광범위한 의약 기능을 보유한 중요한 TCM입니다[13]. 현대 약리학 연구에 따르면 Cistanches Herba는 항산화, 항염증, 간 보호, 항신경퇴행성 질환 활성 등 다양한 활성을 가지고 있는 것으로 나타났습니다[13, 48]. 따라서 Cistanches Herba의 추출물, 분획 또는 화합물은 불임 치료를 위한 잠재적인 항산화 기능을 가질 수 있습니다.

생식력을 향상시키는 식물의 활성 물질에는 PhG, 사포닌, 산소화 휘발성 화합물 및 알칼로이드와 같은 다양한 화학 그룹이 포함됩니다 [41]. PhG의 약리학적 활성 연구는 PhG가 항산화, 항방사선 신경 보호 및 성기능 향상과 같은 광범위한 생체 활성을 나타내는 것으로 나타났습니다 [49, 50]. 그 중에서도 항산화작용이 점차 주목을 받고 있습니다. PhG의 일부 단일 구성 요소 또는 분획은 다양한 화학 물질에 의해 유도된 생식 세포 세포 사멸을 억제하는 것으로 보고되었으며, 시험관 내 항산화 능력은 여러 동물 모델의 생체 내에서도 입증되었습니다 [51, 52]. 이러한 결과는 PhG가 매력적인 후보가 될 수 있음을 나타냅니다.남성 불임의 치료. Cis는 Cistanches Herba에서 분리할 수 있는 활성 PhG입니다. 현재 연구에서 우리는 저산소증 처리 세포 또는 쥐 모델에 대한 Cis의 영향을 조사하고 기본 분자 메커니즘을 조사했습니다. Cis는 GC-1 세포에서 저산소증으로 인한 생존력 감소와 세포사멸 증가에 대해 보호 활성을 나타냈으며, 쥐의 생체 내 저산소증으로 인한 생식계 손상에도 보호 효과를 보였습니다. 정상 산소 그룹과 비교하여 저산소 상태에서 GR, GPx 및 SOD 활성이 크게 감소한 반면, Cis로 처리한 고환 또는 GC{4}} 세포에서는 GR, GPx 및 SOD의 특정 활성이 크게 증가했습니다. Cis는 항산화 효소의 활성을 강화하여 저산소 조건에서 고환과 GC{5}} 세포를 보호하는 것으로 보입니다.

효소 항산화제는 주로 과산화물 음이온을 제거하여 지질 과산화 및 DNA 손상을 방지하여 불임을 예방하는 기능을 합니다. 효소 항산화 메커니즘은 산화 손상을 예방하는 데 중요한 역할을 합니다[23]. OS에 대한 효소 메커니즘은 GR, GPx 및 SOD를 포함한 자유 라디칼 제거제와 글루타티온 의존 효소로 구성됩니다. 항산화 효소는 남성 생식 기관에 필수적인 것으로 잘 알려져 있습니다. 현재 연구에서 저압 저산소증 하에서 항산화 효소 활성 감소의 효과는 모델 그룹에서 ROS 및 LPO 증가를 동반했으며 이는 이전 보고서와 일치합니다 [12]. 그러나 Cis 투여로 인해 GC{4}} 세포와 쥐의 고환에서 항산화 효소 활성이 회복되어 이전에 제안된 바와 같이 저압성 저산소증으로 인한 손상을 예방하기 위해 Cistanches Herba를 투여하는 전략을 생성할 수 있게 되었습니다. 현재 결과는 Cis로 치료하면 쥐의 저산소증으로 인한 생식 세포 손상이 부분적으로 감소한다는 것을 보여 주었지만 생식 보호 효과의 전체 그림을 밝히기 위해서는 추가 조사가 필요합니다. 예를 들어 Cis의 특정 메커니즘은 항산화 효소의 활성에 영향을 미칩니다. 또한 Cis가 저산소증으로 인한 생식 손상으로부터 부분적으로만 회복되었기 때문에 다른 메커니즘도 관련이 있을 수 있는지에 대한 의문이 있습니다. 마지막으로 Cis가 생식세포에 직접적인 성장 촉진 효과를 갖는지 여부도 고려해야 합니다.

정자 활동 유지를 위한 천연 시스탄체 튜불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

결론

일반적으로 이 연구의 결과는 저산소증으로 인한 남성 생식 손상 치료를 위한 항산화제로서 Cis의 잠재력을 강조합니다. Cis는 항산화 효소 활성을 회복하고 ROS로 유발된 OS를 감소시키며 동시에 세포 생존력을 증가시키고 세포사멸을 감소시킴으로써 저산소증으로 인한 남성 생식 손상을 예방할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 연구에서 연구된 Cis 하위 유형(Cis-A, Cis-B, Cis-C 및 Cis-H)은 모두 생식 기관에 대한 특정 보호 효과를 나타냈으며 Cis-B가 가장 중요한 효과를 나타냈습니다. 그러므로 우리는 Cis가 다음과 같은 항산화제 후보가 될 수 있다고 추측합니다.저산소증으로 인한 남성 생식 손상 치료, 정확한 기본 메커니즘은 추가 조사가 필요하지만.