Clec12a는 대장균 공생의 확장을 제한하면서 염증을 완화합니다
Dec 29, 2023
요약
미생물총의 조절은 장 건강에 매우 중요하지만 선천성 면역에 사용되는 메커니즘은 아직 불분명합니다. 여기에서 우리는 C-Type-렉틴 수용체인 Clec12a가 결핍된 쥐가 미생물군에 의존하는 심각한 대장염을 일으켰다는 것을 보여줍니다. 무균 마우스에 대한 대변-미생물총 이식(FMT) 연구에서는 그람 양성 유기체인 Faecalibaculum 설치류의 확장으로 표시되는 Clec12a-/- 마우스 내에서 형성된 대장균 생성 미생물이 밝혀졌습니다. F. Rodentium 처리는 야생형 마우스에서 대장염을 악화시키는데 충분했습니다. 장내 대식세포는 최고 수준의 Clec12a를 발현합니다. Clec12a-/- 대식세포의 사이토카인 및 시퀀싱 분석에서는 염증이 증가했지만 식세포작용과 관련된 유전자가 현저하게 감소한 것으로 나타났습니다. 실제로 Clec12a-/- 대식세포는 F. Rodentium을 흡수하는 능력이 손상되었습니다. 정제된 Clec12a는 F. Rodentium과 같은 그람 양성 유기체에 더 높은 결합을 보였습니다. 따라서 우리의 데이터는 Clec12a가 명백한 염증 없이 잠재적으로 유해한 공생체의 확장을 제어하는 타고난 면역 감시 메커니즘으로 식별합니다.
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소개
미생물군의 구성과 기능은 포유류의 건강과 질병에 큰 영향을 미칠 수 있습니다(Fassarella et al., 2021). 이는 염증성 장 질환(IBD)에 대해 잘 문서화되어 있으며, IBD의 대부분의 마우스 모델은 미생물총 구성의 변화에 민감합니다(Gkouskou et al., 2014). 미생물군 기반 치료법이 개발됨에 따라 미생물군 안정성에 영향을 미치고 이를 지시하는 요인을 이해하는 것이 중요할 것입니다(Sharma et al., 2020; Sorbara 및 Pamer, 2022). 미생물군은 식이요법, 약물, 면역체계를 포함한 다양한 매개변수의 영향을 받습니다. 최근 몇 년 동안 적응성 면역 구성 요소, 특히 IgA가 미생물군 구성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다(Nakajima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang and Palm, 2020). 그러나 특정 선천성 면역 수용체가 항상성 미생물총 구성에 어떻게 영향을 미치는지에 대해서는 알려진 바가 적습니다.
미생물 인식 및 점막 면역을 조절하는 유전자의 유전적 다형성은 자가포식 단백질 ATG16L1을 포함하여 IBD에 대한 중요한 위험 대립유전자입니다(Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux et al., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007 ). ATG16L1T300A 다형성을 가진 개인의 골수성 유전자 발현 변화를 조사한 최근 연구에서 억제성 C형 렉틴 수용체(CLR)인 Clec12a가 이들 세포에서 유의하게 억제되는 것으로 확인되었습니다(Begun et al., 2015). 동일한 연구에서 Clec12a가 자가포식 경로와의 연관을 통해 병원성 감염을 방어하는 기능을 한다는 것이 입증되었습니다. 이러한 데이터는 IBD 환자의 Clec12a 하향 조절이 질병의 심각도 및/또는 발달에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 이러한 증거에도 불구하고 대장염 동안 Clec12a가 발휘하는 면역 조절 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
C형 렉틴은 숙주 유래 또는 미생물 유래 지질, 단백질 및 탄수화물 모두에 결합할 수 있는 다양한 수용성 또는 막 결합 분자 그룹입니다(Brown et al., 2018). Mincle(Clec4e)과 Dectin{6}}(Clec7a)은 장내 항상성을 유지하기 위해 미생물군의 특정 구성원에 영향을 미치는 두 가지 CLR입니다(Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). 그러나 1개가 넘는000 서로 다른 C형 렉틴이 있으므로 이 단백질군 내에서 아직 발견할 부분이 많이 남아 있습니다. Clec12a는 자연 살해 수용체 계열에 속하며 염증 신호 전달 경로를 제한할 수 있는 면역 티로신 억제 모티프(ITIM)를 포함하는 단 두 개의 C형 렉틴 중 하나입니다(Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004) . Clec12a는 세포 손상의 신호인 요산을 인식합니다(Neumann et al., 2014). Clec12a는 선천성 면역 세포에서 가장 많이 발현되며, 호중구에서는 요산 인식 시 활성화를 감소시키고 염증성 사이토카인 생성을 하향 조절하는 역할을 합니다(Neumann et al., 2014). 반대로, Clec12a는 다발성 경화증의 자가면역 모델 동안 단핵 식세포(MNP)가 혈액 뇌 장벽을 통과하여 이동하도록 허용하고 바이러스 감염에 대한 반응으로 I형 인터페론 신호 전달을 강화함으로써 염증을 촉진합니다(Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). Clec12a는 또한 Plasmodium 감염 후 뇌의 CD{29}} T 세포를 증가시키는 것으로 밝혀진 Plasmodium 생성물인 hemozoin을 인식할 수 있습니다(Raulf et al., 2019). 따라서 Clec12a는 면역 및 고유한 신호 전달 기능에서 다양한 역할을 하는 난잡한 CLR을 나타내지만 장에서의 역할은 아직 알려지지 않았습니다.
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우리는 이전에 특정 장내 곰팡이가 퓨린 대사산물인 요산을 유도하여 대장염을 악화시킨다는 것을 입증했습니다(Chiaro et al., 2017). 더욱이, 최근 퓨린 대사는 인간 장 질환과 관련이 있는 것으로 나타났습니다(Zhu et al., 2019). 이러한 데이터는 요산 검출이 IBD와 관련이 있을 수 있음을 종합적으로 시사합니다. 이를 바탕으로 우리는 장내 Clec12a의 기능을 탐구하기 시작했습니다. 우리는 Clec12a가 결핍된 동물이 Clec12a가 없을 때 형성된 미생물군 구성에 의존하는 대장염에 매우 취약하다는 것을 발견했습니다. Clec12a-/- 미생물군의 WT 무균 동물로의 FMT는 대장염을 악화시키기에 충분했으며 Clec12a-/- 동물의 대장균 생성 미생물군의 형성은 적응 면역과 무관합니다. 대장염을 악화시킬 수 있는 관련 미생물을 확인하기 위해 Clec12a-/- 동물을 다양한 항생제로 치료했고 그람 양성 박테리아를 표적으로 삼은 동물은 질병을 완화했습니다. 16S rDNA 시퀀싱은 Faecalibaculum Rodentium이 Clec12a-/- 동물에서 훨씬 더 풍부하다는 것을 확인했으며 F. Rodentium의 경구 위관 영양법은 WT 동물의 질병 병리를 악화시키기에 충분했습니다. Clec12a-/- 동물의 면역 프로파일링은 결장에서 항상성 골수 세포의 현저한 감소를 보여주었습니다. F. Rodentium 처리 대식세포의 RNA 염기서열 분석을 통해 Clec12a가 식세포작용을 촉진한다는 사실이 밝혀졌습니다. Clec12a가 여러 리간드에 결합하는 것으로 나타났기 때문에 우리는 Clec12a가 미생물총의 다양한 구성원에 결합하는지 물었습니다. Clec12a-Fc 융합 단백질을 사용하여 우리는 Clec12a가 미생물총의 그람 양성 구성원에 가장 많이 결합한다는 것을 확인했습니다. 종합적으로 이러한 데이터는 Clec12a가 염증 반응을 예방하면서 직접적인 결합과 식균작용을 통해 미생물총의 대장균 생성 구성원을 제어하는 모델을 제시합니다. Clec12a 발현이 감소하는 시나리오에서는 그람 양성 병균이 확장되어 염증을 촉진할 수 있습니다. 따라서 우리의 연구에서는 Clec12a가 건강한 미생물총의 항상성과 유지를 보장하는 중요한 염증 억제제로 확인되었습니다.
결과
Clec12a-/- 동물은 적응 면역 체계와 관계없이 대장염에 매우 취약합니다.
IBD 환자에게서 Clec12a 발현 감소가 보고되었으며, 우리는 Clec12a에 대한 리간드 중 하나인 요산의 생성을 차단하면 대장염을 개선할 수 있음을 입증했습니다(Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015). 그러나 Clec12a는 아직 대장염 동물 모델에서 연구되지 않았습니다. 이를 위해 WT 및 Clec12a-/- C57BL/6 마우스에 급성 DSS 대장염을 접종했습니다. Clec12a-/- 동물은 WT 동물과 비교할 때 훨씬 더 많은 체중을 감량하고 더 짧은 결장을 나타냈으며 대변에서 염증 마커 LCN2가 크게 증가하여 염증 및 질병이 악화되었음을 나타냅니다(그림 1A-C). 이를 뒷받침하는 조직학적 분석에서는 WT에 비해 Clec12a-/- 동물에서 상피 손상, 선와 손실 및 면역 세포 유입이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 1D, E). DSS 대장염 모델의 결과와 일치하여 CD{21}} CD45RBhi 세포를 TCRb-/-로 전달합니다. Clec12a-/- 이중 녹아웃 마우스는 TCRb-/- 마우스로 옮겨진 T 세포와 비교할 때 시간이 지남에 따라 체중 증가가 적고 결장이 짧아졌습니다(그림 1F, G). 종합적으로, 이러한 결과는 Clec12a의 손실이 장 질환의 악화로 이어진다는 것을 입증합니다.
Clec12a는 선천성 면역 세포 내에서 주로 발현되는 것으로 보고되었으며 CD{1}} T 세포에서는 발현이 매우 낮은 것으로 보고되었습니다. 따라서 Clec12a-/- 동물에서 관찰되는 질병 악화에 적응성 면역이 관여하는지 확인하기 위해 Clec12a-/- 동물을 Rag-/- 동물과 교배하여 T 세포와 B 세포를 모두 제거했습니다. 다시, Clec12a-/- 동물은 WT 대조군보다 더 많은 체중을 감량하고 더 짧은 결장을 가졌기 때문에 WT 동물과 비교할 때 질병이 악화되었습니다(그림 1H, I). 마찬가지로 Clec12a-/-; Rag-/-는 Rag-/- 대조군과 비교했을 때 장 질환이 악화되어 체중이 많이 감소했으며 WT 및 Rag-/-보다 Clec12a-/-(그림 1H, I)보다 짧은 결장을 가졌습니다. 우리는 이전에 S. cerevisiae로 경구 치료하면 요산 수치가 높아져 대장염이 악화된다는 사실을 보고한 바 있습니다. 그러나 WT와 Clec12a-/- 동물의 혈청 또는 대변의 요산 수치에는 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 Clec12A-/-에서 관찰된 질병의 증가가 요산 증가의 결과가 아님을 시사합니다(그림 S1). 따라서 Clec12a-/- 동물에서 관찰된 악화된 대장염 발생은 적응 면역 체계와 무관합니다.
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Clec12a-/- 동물의 악화된 대장염은 미생물군에 의존합니다
대장염은 부분적으로 미생물군 구성의 변화에 의해 유발되는 것으로 알려져 있습니다(Kubinak et al., 2015; Ray and Dittel, 2015). Clec12a-/- 동물이 대장염 악화를 촉진하는 미생물군을 보유하고 있는지 확인하기 위해 WT 또는 Clec12a-/- 마우스에서 무균 WT 동물로 FMT를 수행했습니다. 이식 후 4주 동안 동물의 절반은 함께 공동 수용되었고 나머지 절반은 별도로 수용되었습니다. 그런 다음 각 그룹에서 급성 DSS 대장염이 유발되었습니다(그림 2A). Clec12a-/- FMT를 받은 동물과 공동 수용된 동물은 WT 마우스로부터 FMT를 받은 동물보다 훨씬 더 많은 체중을 감량하고(그림2B)콜론이 상당히 짧았습니다(그림2C). 또한, 조직학적 분석에서는 Clec12a-/- 미생물군을 이식한 후 더 큰 상피 손상과 염증 유입이 나타났습니다(그림2D, E). 확립된 미생물 군집은 Bray-Curtis(PERMANOVA, p=0.0001), 비가중(PERMANOVA, p=0.0062) 및 가중치를 사용한 16S rRNA 유전자 시퀀싱에 의해 결정된 대로 그룹 간에 구별되었습니다. Unifrac 거리(PERMANOVA, p=0.0001). 그룹 내 미생물총의 차이는 각 FMT 유전자형에서 미생물의 획득을 나타내는 동일한 측정법에 의해 공동 수용 동물에서 가장 컸습니다(그림 2 FH). 이러한 데이터는 Clec12a-/- 동물 내 악화된 대장염이 Clec12a가 없을 때 농축된 특정 미생물에 의해 유발된다는 것을 나타냅니다. 그리고 이 미생물은 확립된 WT 미생물군이 존재하는 경우에도 대장균 표현형의 지배적인 동인이 되었습니다.
Clec12a-/- 동물에서 형성된 미생물총 구성은 적응 면역과 무관합니다.
면역 체계는 미생물총의 구성을 결정하는 데 중요합니다. FMT 실험은 Clec12a-/-가 대장염 발병을 악화시키는 미생물총 구성의 변화를 가져온다는 것을 나타냅니다. 우리는 먼저 면역 구획 내의 Clec12a-/- 결핍이 장내 미생물군을 재구성할 수 있는지 여부를 확인하고 싶었습니다. 이를 위해, 미생물군을 표준화하기 위해 WT 또는 Clec12a-/- 마우스의 골수를 치명적으로 조사된 WT SPF 수용자 마우스로 옮겨 8-주의 면역 재구성 기간을 두었습니다(그림 3A). 이 기간 동안 이식된 면역 체계는 수용자 내에서 발달하여 미생물총의 구성을 차별적으로 형성할 시간을 갖습니다. 미생물총에 대한 대장균 생성 변화가 이러한 면역 조각으로 인해 발생했는지 확인하기 위해 우리는 WT 또는 Clec12a-/- 키메라 마우스의 대변을 사용하여 FMT를 수행하고 DSS 대장염을 유발했습니다(그림 3A). 체중 감소에는 큰 변화가 없었지만(그림3B), Clec12a-/-키메라 마우스로부터 FMT를 받은 동물의 결장은 WT 마우스로부터 FMT를 받은 동물과 비교할 때 상당히 짧았으며(그림3C), 이는 질병이 악화되었음을 나타냅니다. 더욱이, WT와 Clec12a-/- FMT 수혜자가 공동 수용되었을 때 WT FMT를 받는 동물과 비교할 때 콜론이 상당히 짧았습니다(그림3C). 따라서 조혈 구획 내의 Clec12a-/- 결핍은 우세한 대장균 생성 미생물군을 형성하게 됩니다.
Clec12a-/- 동물에서 대장균 생성 미생물의 형성에 적응형 면역 체계가 필요하지 않다는 점을 추가로 지원하기 위해 우리는 Rag-/- 또는 Rag-/-의 대변을 사용하여 FMT를 수행했습니다. Clec12a-/- -는 이전에 설명한 대로입니다. Rag-/-를 받은 동물; Clec12a-/- FMT는 Rag-/- 동물로부터 FMT를 받은 동물보다 더 많은 체중을 감량하고 결장이 상당히 짧았으며, 더욱이 공동 수용 동물도 질병이 악화되었습니다(그림 3D, E). 이러한 데이터는 선천성 면역 체계 내의 Clec12a 결핍이 대장염을 악화시킬 수 있는 미생물군을 형성하기에 충분하다는 것을 보여줍니다.
Clec12a는 Faecalibaculum Rodentium의 확장을 억제합니다
우리는 Clec12a-/- 동물 내에서 질병을 유발하는 관련 유기체를 식별하기 위해 일련의 다양한 항생제를 활용했습니다. 첫째, 에리스로마이신, 암피실린, 네오마이신 및 젠타마이신을 포함하는 강력한 스펙트럼 항생제 칵테일로 치료하면 Clec12a-/- 및 WT 동물 모두에서 질병 심각도가 크게 감소하여 미생물총의 박테리아 개체군이 질병과 관련이 있음을 시사합니다. 그림 4A, 그림 S2). 다음으로, 우리는 독특한 박테리아 분류군을 표적으로 하는 다양한 항생제를 활용하여 질병과 가장 관련이 있는 박테리아 개체군을 더욱 좁혔습니다. 구체적으로, 우리는 그람 음성 박테리아를 표적으로 하는 아미노글리코사이드인 젠타마이신과 그람 양성 박테리아를 주로 표적으로 하는 세팔로스포린인 세팔로틴을 선택했습니다. 이 약물은 DSS 대장염 동안 Clec12a-/- 동물에게 투여되었습니다. 젠타마이신을 사용한 치료는 질병 심각도에 차이가 없었지만, 세팔로틴을 투여한 동물은 체중을 유지하고 모의 치료를 받은 동물보다 훨씬 긴 결장을 가졌으며(그림 4B, C), 이는 Clec12a-/- 미생물군 내에 거주하는 그람 양성 유기체가 활동한다는 것을 나타냅니다. 질병 병리를 악화시키는 데 중요한 역할을 합니다.
다음으로 우리는 SPF WT 및 Clec12a-/- 대변의 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 수행하여 미생물군의 구성 변화를 프로파일링했습니다. WT 및 Clec12a-/- 동물은 각각 비계통발생 및 계통발생 존재비 가중 측정 항목인 Bray-Curtis 및 Weighted-UniFrac에 따라 상당히 다르게 클러스터링되었습니다(그림 S3A-C). 알파 다양성 측정항목은 풍부함(관찰된 특징)에 큰 차이가 없음을 나타냈으며, 이는 Clec12a-/-가 더 많은 종을 보유하지 않았음을 나타냅니다(그림4D). 그러나 Clec12a가 없는 경우 균등성과 Shannon 다양성 지수가 증가하여 Clec12a-/- 마우스의 박테리아의 비례 분포가 변경되었음을 나타내며(그림 4E, F) Clec12a가 장내 미생물군 구조를 조절하는 데 중요하다는 것을 추가로 뒷받침합니다.
미생물군집(ANCOM)의 구성 분석에 따르면 차별적으로 풍부한 ASV(앰플리콘 서열 변종) 중에서 Faecalibaculum 속(Erysipelotrichaceae 계열)으로 분류된 ASV가 WT와 비교하여 Clec12a-/- 배설물 내에서 크게 확장된 것으로 나타났습니다(그림 4G, H). 분석에서 ASV 대표 서열을 사용한 BLAST는 박테리아 Faecalibaculum Rodentium의 서열과 100% 동일성을 나타냈습니다. 이러한 데이터는 Clec12a-/- 동물의 그람 양성 박테리아가 대장균 형성 표현형에 책임이 있다는 증거를 제공하며 특히 그람 양성 유기체인 F. Rodentium이 질병 악화에 연루되어 있음을 나타냅니다.
이를 바탕으로 우리는 F. Rodentium이 대장염을 악화시킬 수 있다는 가설을 테스트했습니다. 우리는 구강 위관 영양법을 통해 1 x 108 CFU의 살아있는 F. Rodentium으로 WT SPF 동물을 전처리했으며 높은 수준의 F. Rodentium 식민지화를 보장하기 위해 DSS의 급성 모델 동안 매일 치료를 계속했습니다. 살아있는 동물과 고정된 F. Rodentium을 모두 받은 동물은 차량 처리 동물보다 더 많은 체중을 감량하고 결장이 상당히 짧았으며(그림 4I, J), F. Rodentium의 수준이 증가하면 질병이 악화될 수 있음을 나타냅니다.
Clec12a는 식세포 작용을 향상시키면서 대 식세포 염증 반응을 제한합니다
질병이 없는 상태에서 Clec12a 세포 발현을 정의하기 위해 우리는 다색 유동 세포 계측법을 사용하여 고유층(LP)의 선천성 및 적응성 면역 세포를 프로파일링했습니다. 이전 보고서와 일치하게 Clec12a는 주로 림프구에서 발현이 거의 또는 전혀 없는 골수 계통으로 제한됩니다(그림 5A)(Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001). 장의 호중구, 대식세포 및 수지상 세포는 비슷한 수준의 Clec12a 발현을 보인 반면(그림 S4A), 대식세포는 Clec12a를 발현하는 장 조직 내 세포의 비율이 가장 높았습니다(그림 5A). 고전적인 활성화를 통해 염증을 촉진하고 조직 손상에 반응하여 회복 메커니즘을 시작하는 대식세포의 이중 역할을 고려할 때 우리는 Clec12a가 대장염 동안 이 이분법에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 물었습니다. 대식세포는 매우 다양하지만 각각 CD38과 EGR2의 발현에 따라 M1 염증성 대식세포와 M2 회복성 대식세포로 크게 나눌 수 있습니다. 우리는 Clec12a-/- 동물이 대장염 동안 대장 LP에서 M1 대식세포를 증가시키고 M2 대식세포를 감소시켰다는 것을 보여줍니다(그림 5B, C, 그림 S4B). 이 데이터는 Clec12a가 장에서 대식세포 반응을 조절한다는 것을 나타냅니다.
Clec12a가 미생물 리간드에 반응하여 대식세포 생물학에 어떻게 영향을 미치는지 더 잘 이해하기 위해 WT 또는 Clec12a-/- 동물에서 분리된 골수 유래 대식세포(BMDM)를 LPS, Pam3CysK 및 Flagellin을 포함한 다양한 일반적인 미생물 리간드로 처리했습니다. 이러한 모든 샘플에 대해 사이토카인 분석을 수행했습니다. 테스트된 많은 사이토카인은 이러한 조건에서 유도되지 않았지만 MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a 및 IL-6은 이러한 배양에서 일관되게 검출되었습니다( 그림 5D). Clec12a-/- BMDM은 많은 미생물 리간드에 반응하여 이러한 사이토카인의 발현이 상당히 높았으며 TLR2 작용제 Pam3CysK에 대한 반응에서 가장 큰 차등 반응이 나타났습니다. 이 데이터는 무균 염증 동안 염증 반응을 완화하는 데 있어 Clec12a의 알려진 역할과 일치합니다(Neumann et al., 2014).
시스탄체 식물의 면역 체계 증가
Clec12a가 이 특정 박테리아 유기체에 대한 이들 세포의 반응을 어떻게 조절하는지 확인하기 위해 F. Rodentium으로 처리된 WT 또는 Clec12a-/- 처리된 BMDM에서 RNA-seq를 수행했습니다. 우리는 차량 제어를 통해 F. Rodentium에 노출된 Clec12a-/- BMDM을 WT BMDM의 것과 비교하여 차등 반응을 평가했습니다. 차등적으로 발현된 유전자의 농축 분석은 Clec12a 결핍 대식세포가 F. 설치류로 공격을 받았을 때 세포 주기 제어와 관련된 유전자가 유의하게 증가했음을 보여주었습니다(그림 S5A). 세포 주기는 본질적으로 식균 작용과 연관되어 있으며 식균 작용 및 염증 반응과 관련된 유전자의 상당한 감소도 있었습니다(그림 5E)(Luo et al., 2005). Clec12a 및 Salmonella에 대한 최근 연구와 일관되게, 이러한 데이터는 정상 장내 상주 F. Rodentium에 대한 반응으로 Clec12a가 없으면 식세포작용에 결함이 있음을 시사합니다(Begun et al., 2015). 이를 테스트하기 위해 WT 및 Clec12a-/- 동물로부터 복막 대식세포를 수집하고 Sybr®-green 표지 F. Rodentium과 공동 배양했습니다. Clec12a-/- 대식세포는 세포당 미생물 수가 현저히 적었으며(그림 5F, G, 그림 S5B), 이는 Clec12a 결핍으로 인해 더 적은 수의 유기체가 흡수되고 RNA-seq 데이터세트에서 식세포작용이 감소한 것과 일치함을 나타냅니다. 종합적으로, 이러한 데이터는 Clec12a가 일반적인 미생물 리간드에 대한 명백한 염증 반응을 완화하는 동시에 대식세포 박테리아 흡수를 촉진하는 이중 역할을 한다는 것을 보여줍니다.
Clec12a는 그람 양성 공생균에 우선적으로 결합합니다
식균 작용은 미생물의 결합과 내재화 및 살해에 의해 시작되므로 Clec12a가 F. Rodentium과 같은 미생물총의 특정 구성원에 결합할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이러한 가능성을 해결하기 위해 쥐 Clec12a의 세포외 결합 도메인과 인간 IgG1의 Fc 부분(Clec12a-Fc)을 포함하는 융합 단백질이 생성되었습니다(그림 6A)(Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf 외, 2019). F. Rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria Animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes 균일성 등 항상성 장 내에 존재하는 것으로 알려진 다양한 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 패널과의 결합에 대해 단백질을 정제하고 스크리닝했습니다. 그리고 유세포 분석에 의한 진균 공생 칸디다 알비칸스(Candida albicans). 이전 연구에서 Clec12a가 S. enterica의 세포 유입과 연관될 수 있음이 나타난 것처럼 Salmonella enterica도 포함되었습니다(Begun et al., 2015). Clec12a는 F. Rodentium을 포함하여 여러 계통 발생적으로 구별되는 박테리아와 다양한 정도로 결합했지만 곰팡이인 C. albicans는 그렇지 않았습니다(그림 6B). Clec12a는 그람 양성 유기체인 F. Rodentium과 Lachnospiraceae 계열 Roseburia sp.에 가장 많이 결합했으며 B.animalis, B.uniformis 및 S.enterica와 가장 적게 상호작용했습니다(그림 6B). 이는 Clec12a가 다음을 수행할 수 있음을 나타냅니다. 그람 양성 유기체를 선호하여 미생물총의 특정 구성원과 결합합니다. 우리의 데이터를 종합해보면 Clec12a는 장내 미생물 군집을 조사하고 직접적인 결합과 식균작용을 통해 미생물군을 정리하는 동시에 장 건강을 유지하는 데 중요한 풍부한 그람 양성 미생물에 대한 명백한 염증 반응을 방지하기 위해 면역 체계가 사용하는 메커니즘으로 확인됩니다.
논의
장 내 항상성은 손상을 주는 염증을 시작하지 않고 공생 미생물을 제한하는 메커니즘이 필요합니다(Macpherson et al., 2000). 최근 몇 년 동안 IgA는 장내 면역이 미생물군을 제어할 수 있는 중요한 방법 중 하나로 등장했습니다(Pabst and Slack, 2020). 실제로 IgA는 미생물 및/또는 그 생성물에 직접 결합하여 원형 염증을 유발하지 않고 장에서 미생물을 제거할 수 있습니다. 이러한 이중 특성을 갖는 다른 면역 분자는 현재까지 연구되지 않았습니다. C형 렉틴은 미생물 및 숙주 산물로부터 다양한 단백질, 탄수화물, 지질 분자를 인식할 수 있는 다양한 종류의 단백질로 구성됩니다(Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). 그러나 장내 면역과 미생물군과 관련된 연구는 거의 없습니다(Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). 따라서, 우리가 아는 한, 이것은 Clec12a 결핍이 질병의 심각도를 유발하는 미생물총의 구성을 변화시킨다는 최초의 시연입니다.
시스탄체 효능-면역체계 강화
Clec12a는 종종 세포 사멸의 지표인 요산일나트륨(MSU) 또는 요산을 인식하는 맥락에서 주로 연구되었습니다(Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014). 요산은 NLRP3 인플라마솜을 통해 염증 반응을 활성화할 수 있으므로 세포 사멸 중 조직 파괴를 방지하려면 이 염증을 조절해야 합니다(Martinon et al., 2006). Clec12a는 Syk 신호전달의 하향조절을 통해 이러한 염증 반응의 균형을 맞추는 것으로 나타났습니다(Marshall et al., 2004). 이와 일관되게 무균 염증 모델과 관절염의 자가염증 모델에서 Clec12a 결실은 호중구 활성화를 강화하고 질병을 악화시켜 Clec12a를 중요한 염증 브레이크로 만듭니다(Redelinghuys et al., 2016). 그러나 최근에는 Clec12a가 바이러스 감염에 반응하여 I형 인터페론 신호 전달을 강화하고 항균 자가포식 경로를 통해 살모넬라균의 흡수를 중재하는 것으로 입증되었습니다(Begun et al., 2015; Li et al., 2019). 이는 Clec12a가 염증을 제한하는 역할만 하는 것이 아니라 상황에 따라 다양한 역할을 할 수 있음을 보여줍니다. 장은 질병이 없어도 면역세포가 많다는 점에서 다릅니다. 이는 면역 발달을 지시하고 병원성 유기체의 집락화를 예방하는 데 중요한 역할을 하는 미생물군의 존재 때문입니다. 미생물군은 병원균도 인식하는 TLR에 의해 감지되는 것과 동일한 표면 패턴을 가지고 있으므로 장 면역 체계는 이러한 외부 유기체에 대한 염증을 억제하기 위한 엄격한 조절 메커니즘을 갖추고 있어야 합니다(Blander et al., 2017).
우리는 원래 장내 곰팡이인 Saccharomyces cerevisiae가 요산을 유도하여 대장염을 악화시킨다는 사실을 확인했기 때문에 Clec12a에 관심을 가지게 되었습니다(Chiaro et al., 2017). 더욱이, 다른 연구에서는 미생물군이 포유동물의 최종 생성물이 요산인 퓨린 대사 유도를 통해 장 질환에 영향을 미칠 수 있음을 확인했습니다(Zhu et al., 2019). 이러한 데이터는 Clec12a와 같은 요산을 감지하는 메커니즘이 장의 항상성에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 그러나 우리는 혈청이나 대변의 요산 수치에 변화가 없음을 관찰했는데, 이는 Clec12a-/- 동물의 질병 심각도 증가가 요산 증가에 의해 유발되지 않았음을 나타냅니다. 그러나 Clec12a-/-에서 대장염의 심각도 증가는 미생물총의 구성에 의해 발생합니다. 따라서 우리의 데이터에 따르면 Clec12a-/-의 감소된 발현은 IBD 환자의 미생물총 구성에 영향을 미칠 수 있습니다(Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). 흥미롭게도 우리는 그람 양성 유기체를 표적으로 하는 항생제가 Clec12a-/- 동물의 대장염 심각도를 개선할 수 있다는 것을 발견했습니다. 이는 장 염증 동안 그람 음성 장내세균의 확장을 확인한 여러 보고서와 대조적입니다. 따라서 이는 대장염 발병과 관련된 그람 양성 유기체의 확장을 확인한 몇 안 되는 연구 중 하나입니다. 이 모델에서 대장염 심각도에 영향을 미치는 유일한 유기체는 아니지만 Clec12a-/- 동물에서 F. Rodentium의 극적인 확장이 관찰되었습니다. F. Rodentium은 Firmicutes(Bacillota) 문의 그람 양성, 산화효소 및 카탈라아제 음성 구성원입니다(Chang et al., 2015). F. Rodentium을 WT 마우스에게도 매일 도입하면 대장염이 증가하여 장 내 F. Rodentium의 수준이 확대되면 해롭고 Clec12a-/-에서 대장염 심각도를 유발할 가능성이 있음을 뒷받침합니다. 최근 보고에 따르면 F. Rodentium은 상피 회전율을 증가시키고 염증 반응을 하향 조절하는 상피 내 효소의 발현을 억제할 수 있으므로 F. Rodentium이 장에서 확장될 때 볼 수 있는 악화된 질병과 일치합니다(Cao et al., 2022). 인간은 F. Rodentium과 유사한 유기체로 식민지화되어 있으므로(Zagato et al., 2020), 추가 연구에서는 이러한 F. Rodentium 유사 박테리아가 대장염과 관련된 인간 생리학 측면에 미치는 영향을 밝혀야 합니다.
선천성 면역 세포 중에서 Clec12a의 역할을 뒷받침하면서 우리는 적응성 면역 체계가 부족한 Clec12a-/- 동물에서 대장균 생성 미생물군이 여전히 형성된다는 것을 관찰했습니다. Clec12a를 발현하는 내장 내 세포의 가장 높은 비율은 대식세포였으며, 이는 우리가 이 세포의 Clec12a 기능에 초점을 맞추게 했습니다. 이전 연구에서는 Clec12a가 바이러스 감염에 대한 반응으로 제1형 인터페론 생산의 중요한 중재자임을 입증했습니다(Li et al., 2019). 그러나 Clec12a가 광범위한 박테리아 리간드에 대한 반응에 어떻게 영향을 미치는지는 평가되지 않았습니다. 이는 풍부한 TLR 리간드가 존재하는 장에서 매우 관련이 있습니다. 여기에서 우리는 Clec12a가 장내 대식세포 반응을 조절하는 역할을 하며 미생물군에 대한 반응으로 항상성을 보장하는 기능을 한다는 것을 보여줍니다. F. Rodentium과 함께 배양된 대식세포의 RNA-seq는 Clec12a 결핍이 이러한 공생 박테리아에 반응하여 세포 주기 및 식세포작용 결함을 유발한다는 것을 강조했습니다. 최근 연구에 따르면 Clec12a-/- 대식세포는 살모넬라에 반응하여 자가포식을 감소시켰습니다(Begun et al., 2015). 우리의 데이터는 Clec12a가 비침습적 공생 유기체를 제어하는 기능도 포함한다는 사실을 포함하도록 이러한 발견을 보완하고 확장합니다. F. Rodentium은 상피 생물학에 영향을 미치는 것으로 다른 사람들에 의해 나타났습니다. 이는 F. Rodentium이 숙주에 매우 근접해 있으므로 면역 체계에 의해 엄격하게 통제되어야 함을 의미합니다. 우리의 데이터는 Clec12a가 식세포작용의 조절을 통해 F. Rodentium을 제어한다는 것을 뒷받침합니다. 식균 작용은 리간드 또는 미생물의 물리적 결합에 의해 시작되며 C형 렉틴은 여러 리간드와 결합할 수 있으므로 Clec12a가 장내 박테리아와 직접 결합할 수 있는지 여부를 테스트하게 되었습니다. 흥미롭게도, Clec12a는 그람 양성 유기체인 F. Rodentium 및 Roseburia에 가장 강하게 결합했으며 그람 음성 유기체인 A. muciniphila 및 B.uniformis에는 훨씬 덜 결합했으며 C. albicans에는 전혀 결합하지 않았습니다. 이 데이터는 Clec12a가 미생물총의 특정 구성원에 결합하는 경향이 있음을 보여줍니다. 이를 통해 우리는 Clec12a의 참여와 후속 식균 작용이 미생물총의 특정 구성원을 제어하고 확장으로 인한 잠재적으로 해로운 영향을 방지할 수 있는 모델을 구축할 수 있습니다. 이는 미생물 리간드에 대한 염증을 억제하는 동시에 미생물총의 특정 구성원을 인식하고 제어할 수 있는 Clec12a의 이중 기능을 강조합니다. 따라서 Clec12a는 선천성 면역계가 위장관 내 항상성을 보장하기 위해 사용하는 독특한 방식을 나타냅니다.
그림 전설
그림 1. Clec12a는 적응면역체계와 독립적으로 장질환을 억제합니다.
(A) 대장염 중증도를 평가하기 위해 WT 또는 Clec12a-/- C57BL/6 특정 병원균이 없는(SPF) 마우스를 식수에서 7일 동안 2.5% 덱스트란 황산나트륨(DSS)으로 자유롭게 처리했습니다. 체중 감소율을 매일 평가했습니다. 평균 +/- SEM, 데이터는 양방향 ANOVA 및 Śídák의 다중 비교 테스트를 사용하는 세 가지 독립적인 실험에서 수집되었습니다.
(B) 표시된 동물의 결장 길이(cm)를 희생 시 측정했습니다. 산점도는 평균 +/- SEM이며 데이터는 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 3개의 독립적인 실험에서 풀링됩니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
(C) 표시된 동물의 대변 리포칼린-2(ng/mL)을 염증 판독값으로 측정했습니다. 막대 그래프는 평균 +/- SEM이며, 데이터는 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 두 개의 독립적인 실험에서 풀링됩니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
(D) DSS 유발 대장염 후 표시된 동물의 대표적인 H&E 염색 결장 섹션.
(E) 표시된 동물의 조직학 점수는 결장 절편에서 생성되었습니다.
(디). 막대 그래프는 unpaired t-test를 사용하여 비교한 평균 +/- SEM입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
(F) 만성 대장염을 평가하기 위해 대장염의 T 세포 전달 모델을 수행했습니다. TCRb-/- 및 Clec12a-/-;TCRb-/- 동물의 체중을 매주 측정했습니다. 그래프는 실험 전반에 걸쳐 표시된 동물의 체중 감소율을 나타냅니다. 2-방향 ANOVA와 비교한 평균 +/- SEM입니다.
(G) (I)에서 표시된 동물의 콜로니 길이를 희생 시 측정했습니다. 막대 그래프는 unpaired t-test를 사용하여 비교한 평균 +/- SEM입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
(H) WT, Clec12a-/-, Rag-/- 또는 Rag-/-;Clec12a-/- C57BL/6 SPF 마우스를 급성 대장염에 대해 평가했습니다. 표시된 동물에게는 7일 동안 2.5% DSS를 자유롭게 제공했습니다. 체중 감소율을 매일 평가했습니다. 평균 +/- SEM, 데이터는 두 개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 양방향 ANOVA 및 Śídák의 다중 비교 테스트.
(I) 표시된 동물의 결장 길이(cm)를 희생 시 측정했습니다. 막대 그래프는 평균 +/- SEM이고, 데이터는 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용한 두 개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 각 점은 마우스 한 마리를 나타냅니다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001
그림 2. Clec12a-/- 동물에서 형성된 미생물군은 대장염을 악화시킵니다.
A) 대변 미생물군 이식(FMT)은 WT 또는 Clec12a 동물의 대변 상층액을 무균 WT 마우스에 옮겨 수행되었습니다. 미생물총은 4주 동안 균질화되도록 허용되었으며, 그 후 WTFMT 마우스의 절반과 Clec12a-/-FMT 마우스의 절반을 공동 수용하고 추가로 4주 동안 혼합하도록 허용했습니다. 그런 다음 모든 그룹은 식수에 2.5% DSS를 자유롭게 섭취하고 7일에 희생되었습니다.
B) 표시된 동물의 체중 감소율을 매일 평가했습니다. 그래프는 평균 +/- SEM을 나타내며, 데이터는 양방향 ANOVA와 Śídák의 다중 비교 테스트를 사용한 두 개의 독립적인 실험에서 수집되었습니다.
C) 표시된 동물의 결장 길이(cm)를 희생 시 측정했습니다. 산점도는 Dunnett 다중 비교 테스트와 함께 일반 일원 분산 분석을 사용하여 비교한 평균 +/- SEM입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
D) FMT 및 DSS 유발 대장염 후 표시된 동물의 대표적인 H&E 염색 결장 섹션.
E) 조직학 점수는 (D)의 결장 섹션에서 생성되었습니다. 막대 그래프는 unpaired t-test를 사용하여 비교한 평균 +/- SEM입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
F) WTFMT, Clec12a-/- FMT 또는 공동 수용 동물의 16S rRNA 유전자 시퀀싱으로부터의 가중 Unifrac 거리. 모든 점(쌍별 거리 비교)을 표시하고 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교한 상자 및 수염 플롯.
G) WTFMT, Clec12a-/- FMT 또는 공동 수용 동물의 16S rRNA 유전자 시퀀싱으로부터 비가중 Unifrac 거리. 모든 점(쌍별 거리 비교)을 표시하고 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교한 상자 및 수염 플롯.
H) Bray-Curtis는 WTFMT, Clec12a-/- FMT 또는 공동 수용 동물의 16S rRNA 유전자 시퀀싱과의 거리를 측정합니다. 모든 점(쌍별 거리 비교)을 표시하고 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교한 상자 및 수염 플롯.
그림 3: Clec12a-/- 동물에서 형성된 미생물군 구성은 적응 면역과 무관합니다.
A) 후속 FMT를 통한 골수 재구성을 보여주는 개략도. C57Bl/6 WT 마우스는 치명적으로 방사선 조사를 받고 WT 또는 Clec12a-/- 골수로 재구성되었습니다. 8주 후, 이들 마우스로부터 배설물을 채취하여 (A)에 설명된 대로 WT 무균 마우스로 옮겼습니다. 원래 재구성된 키메라 동물에게 식수에 2.5% DSS를 자유롭게 제공했습니다.
B) (F)의 FMT 마우스의 체중 감소율을 매일 평가했습니다. 양방향 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 테스트를 사용한 평균 +/- SEM.
C) 표시된 동물의 결장 길이(cm)를 희생 시 측정했습니다. 산점도는 평균 +/- SEM, 짝을 이루지 않은 t-검정입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
D) 미생물 형성 및 대장염 중증도에 대한 적응성 면역계의 역할을 평가하기 위한 FMT는 Rag-/- 또는 Rag-/-로부터 분변 상층액을 전달하여 수행되었습니다. (A)에 설명된 대로 Clec12a-/- SPF 동물을 WT 무균 마우스에 넣습니다. 마우스를 7일 동안 2.5% DSS로 처리하였다. 체중 감소율을 매일 평가했습니다. 그래프는 양방향 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 테스트를 사용한 평균 +/- SEM입니다.
E) (F)에 표시된 동물의 결장 길이(cm)를 희생 시 측정했습니다. 평균 +/-, SEM은 Ordinary One-way ANOVA 및 Dunnet 다중 비교 테스트를 사용하여 비교되었습니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001
그림 4. Clec12a는 대장염을 악화시키는 미생물인 Faecalibaculum 설치류의 확장을 제한합니다.
A) WT 또는 Clec12a-/- C57BL/6 SPF 마우스에게 0 농도의 항생제 칵테일(A)(네오마이신, 젠타마이신, 암피실린, 에리스로마이신), 세팔로틴 또는 젠타마이신(B, C)을 투여했습니다. 14일 동안 5g/L. 7일 후, 희생될 때까지 동물에게 식수에 2.5% DSS를 첨가했습니다. 표시된 동물의 결장 길이(cm)를 희생 시 측정했습니다. 산점도는 평균 +/- SEM, 짝을 이루지 않은 t-검정입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
B) 표시된 동물의 체중 감소율을 매일 평가했습니다. 그래프는 양방향 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 테스트를 사용한 평균 +/- SEM입니다.
C) 희생 시 측정된 표시된 동물의 결장 길이(cm). 산점도는 평균 +/- SEM, 짝을 이루지 않은 t-검정입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
D) WT 또는 Clec12a-/- 대변, 16S rRNA 시퀀싱 알파 다양성에서 관찰된 특징. Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교한 평균 +/- SEM입니다.
E) WT 또는 Clec12a-/- 대변의 Pielou 균일성, 16S rRNA 시퀀싱 알파 다양성. Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교한 평균 +/- SEM입니다.
F) Shannon 엔트로피 평균 +/- SEM, Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교.
G) WT 및 Clec12a-/- 대변으로부터의 ANCOM 분석. 분류학적 이름은 GTDB(게놈 분류 데이터베이스)를 사용하여 ASV를 가장 잘 분류한 것입니다.
H) Faecalibaculum Rodentium ASV의 상대적 풍부함. Mann Whitney * p < {{0}}를 사용하여 비교했습니다.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001
I) C57Bl/6 WT SPF 마우스를 3일 동안 경구 위관 영양법으로 F. Rodentium 1x108 CFU로 전처리했습니다. 그런 다음 동물은 식수에 2.5% DSS를 7일 동안 공급하면서 매일 F. Rodentium 위관 영양 공급을 계속했습니다. 체중 감소율을 매일 평가했습니다. 평균 +/- SEM, 데이터는 양방향 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 테스트를 사용하여 4개의 개별 실험으로 통합됩니다.
J) 표시된 동물의 대장 길이(cm)를 희생 시 측정했습니다. 막대 그래프는 평균 +/- SEM이며, 데이터는 Dunnet 다중 보정 테스트와 함께 일반 일원 분산 분석을 사용하여 비교한 4개의 별도 실험에서 수집되었습니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001
그림 5. Clec12a는 염증을 제한하고 대식세포의 식세포작용을 촉진합니다.
A) 면역표현형 분석은 WT 및 Clec12a-/- 동물의 결장 고유판(cLP)에서 분리된 세포에 대한 유세포 분석을 통해 수행되었습니다. 히트맵은 선천성 및 적응성 면역 세포에서 Clec12a 발현 빈도를 보여줍니다.
B) 막대 그래프는 표시된 동물의 cLP에서 사전 게이트, CD{1}} 세포(M1 대식세포)의 빈도를 보여줍니다. unpaired t-test를 사용하여 비교한 평균 +/- SEM입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
C) 막대 그래프는 표시된 동물의 cLP에서 사전 게이트 EGR2+ 세포(M2 대식세포)의 빈도를 보여줍니다. unpaired t-test를 사용하여 비교한 평균 +/- SEM입니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
D) BMDM은 WT 및 Clec12a-/- 긴 뼈에서 수확하고 M-CSF(20ng/mL)의 존재 하에서 7일 동안 배양했습니다. 8일째에 BMDM을 LPS(100ng/mL), MDP(10mg/mL), Pam3cysk(1mg/mL) 또는 Flagellin(1mg/mL)으로 24시간 동안 펄스했습니다. 배지를 수집하고 사이토카인 생산에 대해 분석했습니다. 히트 맵은 WT에 비해 Clec12a-/-에서 표시된 사이토카인의 Log2 배수 변화를 보여줍니다.
E) WT 및 Clec12a-/- 마우스의 BMDM을 분리하고 (A)에서와 같이 배양한 다음 F. Rodentium과 MOI 10에서 24시간 동안 공동 배양했습니다. BMDM을 세척한 후 RNA를 수집하고 RNA 서열 분석을 위해 준비했습니다. Clec12a-/- 하향조절된 상위 10개 단순화된 GO 용어(생물학적 과정) 카테고리
F) 복막 대식세포를 WT 및 Clec12a-/- 마우스로부터 분리한 다음 식세포작용을 평가하기 위해 Sybr 녹색 염색 F. Rodentium과 함께 배양했습니다. 왼쪽: WT 대식세포. 오른쪽: Clec12a-/- 대식세포. 명시야(왼쪽 열), 형광(가운데 열) 및 병합(오른쪽 열)의 대표 이미지가 표시됩니다. 노란색 화살촉은 대식세포에 의해 삼켜진 F. Rodentium 세포의 예를 나타냅니다. 스케일 바=20 µm. 이미지는 두 가지 별도의 실험을 나타냅니다.
G) 막대 그래프는 (F)에서 볼 수 있듯이 세포당 유기체를 보여줍니다. 250개의 WT 세포와 269개의 Clec12a-/- 세포를 계수하여 세포당 F. Rodentium의 양을 정량화했습니다.
그림 6: Clec12a는 미생물총의 특정 구성원에 직접 결합합니다.
A) Clec12a-인간 IgG1-Fc 융합 단백질 또는 빈 벡터(Fc 부분만)를 묘사하는 개략도 B) 다양한 박테리아 또는 C. 알비칸스에 대한 Clec12a-Fc의 차등 결합을 나타내는 유세포 분석의 히스토그램.
보충 그림 범례
보충 그림 1. Clec12a가 없어도 요산 수치가 중단되지 않습니다.
A) 표시된 동물의 혈청 요산(μM)을 측정하여 WT와 Clec12a-/- C57Bl/6 마우스 사이의 퓨린 대사를 평가했습니다. 산점도는 평균 +/- SEM이며, 데이터는 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 3개의 독립적인 실험에서 풀링됩니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
B) 표시된 동물의 대변 요산(μM)을 측정하여 WT와 Clec12a-/- C57Bl/6 마우스 사이의 요산 장 배설을 평가했습니다. 산점도는 평균 +/- SEM이며, 데이터는 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 3개의 독립적인 실험에서 풀링됩니다. 각 점은 하나의 마우스를 나타냅니다.
보충 그림 2. WT 및 Clec12a-/- 미생물군은 차등 질병을 유발합니다
네오마이신, 젠타마이신, 암피실린 및 에리스로마이신으로 구성된 항생제 칵테일로 치료된 WT 및 Clec12a-/- 동물의 체중 감소율.
보충 그림 3. 미생물군 구성은 Clec12a의 영향을 받습니다.
A) 전체 미생물군 관계를 보여주는 Bray-Curtis 거리를 기반으로 한 처음 3개 축의 PCoA 플롯과 각 그룹 내의 차이점을 정량화하고 Mann-Whitney 테스트와 비교한 해당 상자 및 수염 플롯.
B) 가중 Unifrac 거리를 기반으로 한 PCoA 플롯과 짝을 이루지 않은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교한 그룹 내 차이점을 정량화하는 해당 상자 및 수염 플롯.
C) WT 대 Clec12a-/- 분변 미생물군에 대한 Bray-Curtis 및 가중치 Unifrac 거리에 대한 PERMANOVA 테스트 결과를 보여주는 표.
보충 그림 4: 대식세포의 Clec12a는 염증을 제한합니다.
A) 바이올린 플롯은 (A)에 표시된 면역 세포의 기하학적 평균 형광 강도(MFI)를 나타냅니다. 다중 비교를 위해 Dunn의 보정을 사용한 평균 +/- SEM, Kruskal-Wallis 테스트. 문자는 크게 다른 그룹을 나타냅니다.
B) DSS 대장염 후 WT 또는 Clec12a-/- 마우스의 cLP로부터의 M1 및 M2 대식세포의 대표적인 유동 세포측정 플롯. 세포는 라이브, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ 및 CD64+에서 사전 게이트됩니다. 그림 5A에서
보충 그림 5. Clec12a는 세포 주기 제어를 안정화하고 대식세포의 식세포증을 조절합니다.
A) F. Rodentium에 대한 반응으로 WT와 비교하여 Clec12a-/- 상향 조절된 유전자가 풍부한 상위 10개 단순화된 GO 용어(생물학적 과정) 카테고리. F. Rodentium과 공동 배양된 WT 및 Clec12a-/- 마우스의 BMDM을 분리하고 그림 7A와 같이 분석했습니다.
B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200개의 대식세포가 계수되었습니다. 막대 그래프는 4개 개별 웰의 F. Rodentium 평균 수를 표시하여 웰 전반에 걸친 계수 및 효과의 일관성을 보여줍니다. unpaired t-test를 사용하여 평균 +/- SEM을 비교했습니다.
감사의 말
이 프로젝트에 Clec12a-/- 동물을 제공한 Gordon Brown에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 이 작업은 헬렌 헤이 휘트니 재단(KSO), 유타 대학교 NRSA 미생물 병원성 T32 교육 보조금(KSO), CCFA 수석 연구 상(JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 및 NCCAM R01AT011423(JLR), Edward Mallinckrodt의 지원을 받았습니다. Jr. Foundation(JLR), NSF CAREER 상(IOS-1253278)(JLR), 과학 및 공학 Packard Fellowship(JLR), Burroughs Welcome Investigator in Pathogen Award(JLR), American Asthma Foundation(JLR), Margolis 재단(JLR), MS 소사이어티 센터 보조금(JLR) 및 WM Keck 재단(JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01(RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), 미국 암학회 연구 보조금(RMO), Kimmel Scholar Award(RMO), R01AG047956(RMO) 및 NIAID R01AI141202(ASI). 이 연구는 수상 번호 5P30CA042014-24를 통해 국립암연구소(National Cancer Institute)와 유타대학교 유세포분석 시설의 지원을 받았습니다. 유타 대학교 고성능 컴퓨팅 센터의 지원과 자원에 감사드립니다.
저자 기여
TRC는 연구 구상을 도왔고, 대부분의 마우스 및 면역학 실험을 수행했으며, 데이터를 그림으로 정리하고 원고 작성을 도왔습니다. RB는 무균 실험을 설정하고 모든 동물을 무균 상태로 유지했습니다. ESV는 면역학 장 고유판 실험을 도왔습니다. KSO는 마우스 수확을 도왔고 통찰력과 방향을 제공했습니다. KMB는 마우스 수확 및 유세포 분석에 도움을 주었습니다. MCN은 쥐 수확을 도왔습니다. WV는 융합 단백질 구축 및 정제에 도움을 제공했습니다. TJ는 식균작용 분석에 도움을 제공했습니다. JH는 식균작용 현미경 슬라이드를 분석했습니다. MH는 융합 단백질의 정제 및 사용에 도움을 제공했습니다. KAK는 박테리아 분리물을 제공합니다. ROC는 면역학 전문 지식과 통찰력을 제공했습니다. WZS는 생물정보학 분석을 수행하고 그림 준비 및 통계를 도우며 원고 작성을 도운 연구 구상을 도왔습니다. JLR은 연구 구상 및 지도를 도왔고, 실험 설계 및 결과를 감독하고, 공동 작업자 및 시약을 조직하고, 연구 자금을 확보하고, 원고 작성을 도왔습니다.
행동 양식
마우스 계통
여기에 사용된 모든 마우스 라인은 C57BL/6 배경에 있었습니다. Clec12a-/- 마우스는 Gordon Brown(엑서터 대학교 의료 연구 위원회 센터)에 의해 친절하게 제공되었으며 이전에 설명된 프로토콜(Redelinghuys, et al. 2016)에 따라 유전자형이 결정되었습니다. Rag2-/- 및 TCRb-/-(Jackson Laboratories, 002118)는 Jackson Laboratories에서 구입하여 여러 세대 동안 마우스 식민지에서 유지되었습니다. 모든 생체 내 대장염 실험에는 8주에서 12-주령의 성별이 일치하는 마우스가 사용되었습니다. 수컷 및 암컷 마우스를 모두 사용하였다. 마우스는 특정 병원균이 없는 조건에서 유지되었습니다.
박테리아 및 곰팡이 균주
다음 유기체는 DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH에서 획득했습니다: Faecalibaculum Rodentium(DSM# 103405); 아커만시아 뮤시노필리아(Akkermansia mucinophilia) DSMZ(DSM# 26127); 비피도박테리움 아니말리스 DSMZ(DSM# 26074). Bacteroides 유니폼은 American Type Culture Collection(ATCC® 8492™)에서 구입했습니다. Roseburia sp(균주 지정 JLR.KK002)는 포자가 풍부한 미생물군을 보유한 C57BL/6 마우스의 Schaedler 한천에서 분리되었습니다. 포자 형성자 농축은 이전에 설명한 대로 수행되었으며 JLR.KK002가 대변에서 분리되기 전에 마우스는 우리의 영생물 시설에서 이 미생물군으로 여러 세대 동안 유지되었습니다(Browne et al., 2016). 우리는 PCR 증폭 및 Sanger가 16S rRNA 유전자의 서열을 분석한 후 이를 SILVA ACT 서비스 및 SILVA 데이터베이스로 분류했습니다(Pruesse et al., 2012). Salmonella typhimurimum ST2 균주를 사용하였다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주 sc5314를 사용하였다. PhyLo11b 합성 커뮤니티에서 사용되는 박테리아 균주는 아래에 설명되어 있습니다.
DSS로 유발된 실험적 대장염
식수에 2.5% 또는 3%(w/v) 36,000-50,000MW 덱스트란 황산나트륨(DSS)(MP Biomedicals)을 7일 동안 첨가하면 대장염이 유발되었습니다. 대장염 중증도는 체중, 대변 농도 및 대변 혈액의 변화를 통해 매일 모니터링되었습니다. 단핵구 구조 실험을 위해 모든 마우스는 5일 동안 2.5% DSS를 받은 후 일반 물을 제공했습니다. 체중 모니터링은 동물을 수확한 10일째에도 계속되었습니다. 20% 이상의 체중 감량의 심각도 한계가 심각도 임계값으로 부과되었습니다. 실험 종료점에서 MLN과 콜론이 제거되었습니다. 결장의 길이를 결정하기 위해 맹장에서 직장까지의 길이를 측정했습니다. 그런 다음 조직학, RNA 추출 또는 유세포 분석을 위해 조직을 처리했습니다.
결장 조직학 및 채점
Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).
리포칼린-2(LCN-2) ELISA
프로토콜은 제조업체의 프로토콜(Fischer Scientific DY1857-05)에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해서, 대변을 수집하고 무게를 측정한 후 100mg/mL 농도의 HBSS 1X에서 으깨었습니다. 그런 다음 샘플을 50 xg에서 5분 동안 회전시켜 큰 잔해물을 제거했습니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 새 튜브에 넣고 박테리아를 펠렛화하기 위해 8000 xg에서 5분 동안 회전시켰습니다. 그런 다음 이 상등액을 동물의 질병에 따라 희석했지만 일반적으로 범위는 1:100- 500(건강함) – 1:500-1000(DSS 처리)이었습니다. 요산 측정 요산 농도는 제조업체의 지침(Invitrogen™ Amplex™Red Uric/Uricase 활성 분석 키트, 카탈로그# A22181)에 따라 수행되었습니다. 간략하게, 심장 천자를 통해 WT 또는 Clec12a-/- 마우스로부터 금 상부 혈청 분리기 튜브로 혈액을 수집했습니다. 튜브를 30분 동안 응고시킨 다음, 1300 xg에서 10분 동안 회전시켰습니다. 혈청을 제거하고 1.5ml Eppendorf 튜브에 넣고 급속 냉동한 후 테스트할 때까지 섭씨 -80도에 보관했습니다. 분변 요산은 WT 및 Clec{22}}/- 마우스로부터 신선한 분변 펠릿을 획득하여 수행되었습니다. 펠렛의 무게를 측정하고 기록한 후 1x 반응 완충액 1mL에 으깨었습니다. 물리적 매싱 후, 튜브를 50 xg에서 5분 동안 회전시켜 큰 잔해물을 제거했습니다. 남은 배설물 슬러리에서 요산이 분석되었습니다.
T 세포 전달 실험 대장염
WT 비장을 분리하고 10% 소태아혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유한 RPMI에 으깨었습니다. 세포를 367 xg에서 회전시켜 세포를 분리했습니다. 생성된 펠릿을 암실, 실온에서 5분 동안 1x RBC 용해 완충액에 현탁시켰습니다. 생성된 백혈구를 Miltenyi CD4+ MACS 컬럼에 통과시켜 CD4+ T 세포를 분리했습니다. 그런 다음 T 세포를 CD4 및 CDRB로 염색하고 FACS Aria Fusion(BD Biosciences)에서 분류했습니다. CD4+ CDRBhi 세포를 수집하여 TCRb-/- 또는 TCRb-/-에 투여했습니다. Clec12a-/- 마우스 복강 내(IP). 각 마우스는 5 x 105 세포를 받았습니다. 체중 감소를 평가하여 대장염 중증도 및 발달을 매주 모니터링했습니다. 실험 종료점에서 MLN과 결장을 제거하고 맹장에서 직장까지 결장을 측정하여 질병의 심각도를 평가했습니다.
결장 고유판에서 백혈구 분리
맹장이 부착된 쥐과의 결장을 수확하고 얼음 위의 6-웰 플레이트에 있는 1X PBS에 넣었습니다. 눈에 띄게 남아 있는 지방과 결합 조직을 모두 제거하고 맹장을 결장에서 잘라냈습니다. 결장을 벌리고 점액과 배설물을 결장에서 조심스럽게 제거한 후 다시 6-웰 플레이트에 넣었습니다. 모든 결장이 벌어지고 긁힌 후, 면도날을 사용하여 페트리 접시 뚜껑에서 각 결장을 잘게 자르고 별도의 50 mL 튜브에 넣었습니다. 미리 예열된 해리 용액(Ca+ 및 Mg+가 포함되지 않은 1X HBSS, 1.5mM DTT, 10mM HEPES 및 30mM EDTA) 10mL를 첨가하고 튜브를 잠시 와동시켰습니다. 결장을 대략 25분 동안 배양하였다. IEC 분리로 인해 용액이 흐려질 때까지 150rpm으로 진탕하면서 37도에서. 샘플을 3회 흔들고 15초 동안 와동시킨 다음 50ml 원뿔형의 100mM 필터 위에 부어 IEC와 같은 비면역 세포를 제거하고 필터를 2mL의 얼음처럼 차가운 1X PBS로 잠시 헹구었습니다. 남은 조직은 겸자를 사용하여 필터 위에 수집하고 새로운 50 mL 원뿔형으로 옮겼습니다. 미리 예열된 소화 용액 15mL(Ca+ 및 Mg가 포함된 1X HBSS, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, 고양이 # 4942078001], 0.5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, 고양이 # LS002139] 및 0.5 mg/mL 콜라게나제 D[Millipore-Sigma, 카탈로그 번호 11088866001])를 첨가하고 샘플을 간단히 와동시킨 후 45분 동안 배양했습니다. 150rpm으로 흔들면서 37도에서, 또는 용액이 흐려질 때까지. 그런 다음 샘플을 3회 흔들고 15초 동안 볼텍싱했습니다. 남은 면역 cLP 세포를 수집하기 위해 소화된 조직을 10 mL 1X PBS가 들어 있는 50 mL 원뿔형 튜브의 40 mM 필터 위에 부었습니다. 다음으로 샘플을 헹구고 얼음처럼 차가운 1X PBS 2mL로 여과한 다음 800xg에서 4도에서 10분간 회전시킵니다. 다음으로, 상등액을 제거하고 진공으로 폐기하였다. 그런 다음 세포를 500ml의 완전한 RPMI에 재현탁시키고 Trypan blue 배제 염색으로 계수했습니다.
유세포분석
cLP로부터 분리된 백혈구는 좀비 염료 510(AmCyan)을 사용하여 암실에서 실온에서 10분 동안 생존력에 대해 염색되었습니다. 그런 다음 샘플을 CD-16/32로 어둠 속에서 4도에서 20분 동안 Fc 수용체를 차단했습니다. 5분 동안 367 xg에서 스핀다운한 후 가만히 따라 둔 세포를 암실 4도에서 30분 동안 염색했습니다. 달리 명시하지 않는 한 모든 항체는 1:250으로 희석하여 사용되었습니다. 골수성 패널은 CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE-로 구성되었습니다. Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE(1:500), EGR2-APC(세포내, 1:50). T 세포는 좀비 염료 510(AmCyan), CD{41}}BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp{47}}APC(세포내 1:50), IL{{ 50}}PE(세포내 1:50), IFN-g(BV605)(세포내 1:50), RORgt-PE610(세포내 1:50), IL{61}}A-BV785(세포내 1:50). 염색 후, 세포를 컬럼 완충액(Ca2+, Mg2+ 및 HEPES, EDTA, FBS가 포함되지 않은 1X HBSS)으로 각각 5분 동안 2회 세척했습니다. 세포내 염색이 필요하지 않은 경우 세포를 2% PFA로 O/N 고정한 다음 유세포 분석기에서 실행하기 전에 컬럼 완충액 2X로 세척했습니다. 세포내 염색이 필요한 경우 FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer 키트(Tonbo Biosciences) 및 프로토콜을 따랐습니다. 그런 다음 모든 샘플을 300ul의 컬럼 완충액에 재현탁하고 UltraComp eBeads(ThermoFisher Scientific)로 보상하고 단일 염색 컨트롤을 사용한 후 BD LSR Fortessa에서 실행했습니다.
IgA 염색 박테리아
HBSS mL당 배설물 100mg의 농도로 Ca2+ 및 Mg2+가 포함된 HBSS로 매싱하여 배설물 펠릿에서 박테리아를 분리했습니다. 그런 다음 으깬 대변을 50 xg에서 5분 동안 회전시켜 큰 잔해물을 제거했습니다. 상등액을 제거하고 새 튜브에 넣었습니다. 그런 다음 이를 8000 xg에서 5분 동안 회전시켜 박테리아를 펠렛화했습니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 Ca2+ 및 Mg2+가 포함된 HBSS에서 세척했습니다. 마지막으로 펠렛을 100mg/mL 농도로 HBSS에 재현탁시키고, 이 중 10uL를 96-웰 플레이트에 넣고 HBSS w/ Ca2+ 및 Mg2+ 함유로 차단했습니다. RT에서 20분 동안 10% FBS. 100uL의 항-IgA(PE)를 샘플에 직접 첨가하고 암소에서 4℃에서 30분 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 HBSS+FBS 용액으로 2회 세척하고 마지막으로 HBSS+1x Sybr®-green에 재현탁하고 실온의 암실에서 20분 동안 배양했습니다. 그런 다음 샘플을 유세포 분석기에서 직접 판독했습니다.
골수 분리
골수는 이전에 설명한대로 분리되었습니다. 간단히 말하면, C57Bl/6 야생형 또는 Clec12a-/- 동물의 긴 뼈를 추출하고 종이 타월로 부드럽게 문질러 닦아냈습니다. 동물이 처리되는 동안 깨끗한 뼈는 얼음 위에 보관되었습니다. 골수를 노출시키기 위해 뼈의 끝 부분을 약간 잘랐습니다. 뼈를 18g 바늘로 뚫은 0.5mL Eppendorf 튜브에 삽입했습니다(노출된 끝이 아래를 향함). 이 0.5mL Eppendorf 튜브를 1.5mL Eppendorf 튜브 안에 넣고 13,000 x g에서 1분 동안 회전시켰습니다. 그런 다음 제조업체 권장 사항에 따라 RBC 용해 완충액(Biolegend)을 사용하여 골수를 통해 회전시킨 후 RBC 용해했습니다. RBC 용해 후, 세포를 10% FBS, 1mg/mL Pen/Strep, HEPES 10mM, 1x 비필수 아미노산, 피루브산나트륨 1mM을 함유하는 완전한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 재현탁시켰습니다. 이어서, 세포를 367 xg에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠렛화하였다. 그런 다음 분리된 세포를 사용하여 BMDM을 개발하거나 단핵구를 추가로 분리했습니다.
골수 유래 대식세포
백혈구는 골수 분리에서 분리하고 완전한 DMEM에 현탁한 다음 혈구계에서 트리판 블루 배제 염색을 통해 계수했습니다. 세포를 10mL의 완전 배지 + M-CSF(20ng/mL) 중 5-8 x 106 세포/플레이트의 농도로 조직 배양 처리된 10cm 접시에 플레이팅했습니다. M-CSF를 포함한 신선한 배지를 4일과 7일에 기존 배지에 추가했습니다. 7-9일 사이에 실험용으로 완전히 차별화된 BMDM을 사용했습니다.
단핵구 분리
이전에 설명한 대로 WT 및 Clec12a-/- 동물로부터 골수를 수확했습니다. 단핵구는 제조업체 지침에 따라 Monocyte Isolation Kit(BM), 마우스(Miltenyi Biotec) 및 LS MACS 컬럼을 사용하여 분리되었습니다.
F. Rodentium BMDM 공동 배양 및 RNAseq
F. Rodentium 배양물은 OD 600nm(1 OD 600nm=1 x 10^8 세포/mL 사용)로 정량화하고 멸균 PBS로 2회 세척한 후 1 x 106 세포/mL 완전히 분화된 BMDM과 함께 공동 배양했습니다. 6-웰 조직 배양 플레이트의 MOI는 10입니다. 24시간의 공동 배양 후, 배지를 수집하고 추가 사용 시까지 -20C에서 보관했습니다. BMDM을 차가운 멸균 PBS로 2회 세척했습니다. 그런 다음 Qiazol(Qiagen cat# 79306) RNA-안정화 시약을 각 웰에 직접 첨가했습니다. 1.5 Eppendorf 튜브에 수집된 세포 스크레이퍼로 웰을 긁어내고 RNA 추출까지 -20도에서 동결시켰습니다. RNA 추출은 제조업체 지침에 따라 Direct-zol RNA miniprep 키트(Zymo Research cat# R2070)를 사용하여 수행되었으며, 시퀀싱 라이브러리는 Huntsman Cancer Institute High-throughput Genomics 핵심 시설에서 준비되었습니다. 샘플에서 rRNA를 감소시키기 위해 먼저 총 RNA를 NEBNext rRNA Depletion 키트 v2(NEB, cat# E7400)와 혼성화했습니다. Illumina용 NEBNext Ultra II 방향성 RNA 라이브러리 준비 키트(NEB, cat# E7760L)를 사용하여 가닥 RNA 시퀀싱 라이브러리를 준비했습니다. 정제된 라이브러리는 D1000 ScreenTape 분석(Agilent, cat# 5067-5582 및 5067-5583)을 사용하여 Agilent Technologies 4150 TapeStation에서 검증되었습니다. 어댑터 변형 분자의 몰농도는 Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit(Roche, cat#07960140001)를 사용하여 정량적 PCR에 의해 정의되었습니다. Illumina 서열 분석을 준비하기 위해 개별 라이브러리를 5nM로 정규화하고 페어드 엔드 150-주기 시퀀싱 실행을 통해 NovaSeq 6000에서 시퀀싱했습니다.
사이토카인 분석
BMDM은 이전에 설명한대로 분리하고 성장했습니다. 완전히 분화된 BMDM을 12-웰 조직 배양 플레이트에 웰당 1 x 105개 세포로 플레이팅했습니다. BMDM은 100ng/mL LPS로 자극되었습니다. 1ug/mL Pam3Cysk; 또는 1ug/mL 플라젤린. 세포를 24시간 동안 자극하고 배지를 수집하여 분석을 위해 -20C에 보관했습니다. 사이토카인은 LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel(13-plex)(Biolegend, cat# 740150)을 사용하여 분석되었습니다. 데이터는 LEGENDplex™ 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.
16s rRNA 유전자 시퀀싱
배설물 펠릿 또는 회장 내용물을 개별 마우스로부터 수집하고 250 mg의 0.15 mm 가넷 비드(MoBio, cat# {{5 }}). DNA는 키트 지침에 따라 Power Fecal DNA Isolation Kit(MoBio 또는 QIAGEN)를 사용하여 추출되었으며 Mini-Bead-Beater 16(BioSpec Products)에서 4도에서 1분간 비드 비트를 2주기 포함했습니다. 16S rRNA 유전자의 V3 및 V4 영역은 V3/4 영역 16S rRNA 유전자 표적화 서열을 포함하는(3'에서 5'로 설명됨) 프라이머를 사용하여 단일 라운드의 PCR로 증폭되었으며, 이어서 2-뉴클레오티드 패드가 이어졌습니다. Illumina 프라이머 서열, 8- 뉴클레오티드 인덱스 서열 및 나머지 Illumina 어댑터 서열에 의해. V3/{23}}S-표적화 서열은 Takahashi(Takahashi et al., 2014)에서 가져왔고 지수는 Kozich(Kozich et al., 2013)에서 가져왔습니다. 사용된 전체 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같습니다(X로 표시된 인덱스): Prok16SV34_의 경우: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_버전: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. PCR 사이클링 조건은 다음과 같습니다: 2분 동안 98도 초기 변성; 20초 98도 변성, 20초 51.5도 어닐링, 20초 72도 확장의 26사이클; 2분간 최종 72도 확장을 1회 수행합니다. 각 PCR(각 샘플에 대해 3회 반복 수행)은 Q5 High-Fidelity 2X Master Mix(NEB, cat# M0492L), 각 프라이머 5pmol 및 50ng 템플릿 DNA를 사용하여 25ul 용량으로 수행되었습니다. 증폭 후, 각 샘플의 3중 PCR을 모아서 5ul를 아가로스 겔에서 실행하여 증폭을 확인하고, 나머지 부피를 Axygen AxyPrep MAG PCR 클린업 비드(Corning, cat# MAG-PCR-CL{{53)를 사용하여 정리했습니다. }}) 우선적으로 서열이 분석될 프라이머 이합체를 효율적으로 제거하기 위해 물에 62.5%로 희석되었습니다. 희석된 비드를 PCR 반응의 1.8X 부피로 추가하고 제조업체 지침에 따라 세척하고 세척된 앰플리콘을 25ul 10mM Tris-Cl, pH 8.0으로 용출했습니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더에서 pico green dsDNA 분석(ThermoFisher, cat #P11495)을 사용하여 앰플리콘을 정량화한 다음, 세척 및 인덱싱된 개별 시퀀싱 라이브러리를 균등하게 다중화(ng DNA 기준)하고 Illumina MiSeq 기기에서 페어드 엔드로 시퀀싱했습니다. Huntsman Cancer Institute의 High-Throughput Genomics 공유 자원 시설의 300주기 모드.
서열 데이터의 생물정보학 처리
16S rRNA 유전자 원시 읽기는 역다중화되어 인덱스의 0 불일치를 허용한 다음 이전에 설명한 대로(Stephens et al., 2021) QIIME2 프레임워크(Bolyen et al., 2019) 내에서 처리 및 분석했습니다. 간단히 말해서, 역다중화 및 품질 필터링된 서열은 먼저 Cutadapt 플러그인을 사용하여 프라이머 및 링커 서열을 다듬은 다음 DADA2로 노이즈를 제거했습니다(Callahan et al., 2016; Martin, 2011). 그런 다음 증폭된 V3/4 영역으로 트리밍되고 fit-classifier-naive-bayes 방법으로 훈련된 GTDB 참조 세트(release89)에 대해 기능 분류기 플러그인의 classifysklearn 방법을 사용하여 분류법을 ASV에 할당했습니다(Bokulich et al. , 2018; Parks 외, 2018; Pedregosa 외, 2011). Permanova에 의한 베타 다양성 그룹화의 다양성 측정항목, 거리 및 통계적 유의성은 QIIME2 내에서 계산되었습니다(Anderson, 2001).
BMDM의 RNA-seq의 경우 원시 읽기는 우선 품질이 우수하고 다양한 트림을 사용하여 어댑터 트리밍된 다음 어셈블리 GRCm38(mm10)의 전사체에 대해 Salmon을 사용하여 전사체 수를 정량화했습니다(Patro et al., 2{{ 16}}17). 전사 수준 정량화는 시간 패키지를 사용하여 R로 판독되었으며 '~ 유전형 + 치료 + 유전형: 치료' 설계 공식을 사용하여 DESeq2를 사용한 차등 발현 분석 전에 유전자 수준 수로 요약되었습니다(Love et al., 2014; Love et al., 2020). F. Rodentium에 대한 차등 반응은 비히클 대조군 처리 세포에 대한 살아있는 F. Rodentium 처리에 대한 각 유전자형의 반응 간의 차이를 나타냅니다. 유의미하게 차등적으로 발현된 유전자는 조정된 p-값 < 0.05 및 log2 배수 변화 > |0.58|을 갖는 유전자로 정의되었습니다. (1.5배 변화). 그런 다음 GO 용어 중복성을 줄이고 주요 생물학적 과정을 식별하는 단순화 기능이 포함된 ClusterProfiler 패키지를 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 용어의 강화를 테스트하는 데 크게 하향 조절 및 상향 조절된 유전자 목록을 사용했습니다(S, 2020; Wu et al ., 2021).
F. Rodentium DSS 챌린지
F. Rodentium은 이전에 설명한 대로 재배되었으며 멸균 PBS에서 1 x 109 CFU/mL로 정량화되었습니다. F. Rodentium은 먼저 멸균 PBS로 2회 세척한 후 10분 동안 1mL 10% Fomalin-PBS에 재현탁하여 고정되었습니다. 그런 다음 세포를 10mL 멸균 PBS로 2회 더 세척하여 경구 위관 영양법을 준비했습니다. 고정되지 않은 세포는 고정된 세포처럼 세척되었고 위관 영양법이 적용될 때까지 얼음 위에 보관되었습니다. WT C57BL/6 SPF 마우스에게 -3일부터 10일까지 PBS 단독(비히클), F. Rodentium(살아 있음) 또는 F. Rodentium(고정)을 포함하는 100uL의 용액을 경구로 측정했습니다. 동물에게 3.0%를 투여했습니다. 0-7일의 DSS; 신선한 DSS 물을 격일로 교체했습니다. 20% 이상의 체중 감량의 심각도 한계가 심각도 임계값으로 부과되었습니다. 실험 종료점에서 MLN과 콜론이 제거되었습니다. 결장의 길이를 결정하기 위해 맹장에서 직장까지의 길이를 측정했습니다. 그런 다음 조직학, RNA 추출 또는 유세포 분석을 위해 조직을 처리했습니다.
식균 작용 분석
복막강에 5mL의 멸균 PBS를 주입하여 복막 대식세포를 분리했습니다. PBS는 캐비티에 있는 동안 몇 초마다 부드럽게 교반되었습니다. 2분 후, 28게이지 바늘을 사용하여 PBS를 빼내고 차가운 완전 DMEM에 분배했습니다. 세포를 367 xg에서 회전시키고 완전 배지에서 세척했습니다. 그런 다음 세포를 혈구계산기로 계수하고 2.5 x 105개 세포/mL의 농도로 12-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅했습니다. 세포를 밤새 부착되도록 하였다. 다음날, 웰을 소용돌이로 부드럽게 혼합하고 배지를 흡인했습니다. 그런 다음 부착 세포를 500uL의 차가운 멸균 PBS로 두 번 세척했습니다. MOI가 10인 F. Rodentium을 함유하는 미리 예열된 완전 DMEM을 부착체(대식세포)에 첨가했습니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 3분 동안 200 xg에서 부드럽게 회전시킨 후 표준 세포 배양 조건(37℃, 5% CO2) 하에서 90분 동안 배양했습니다. F. Rodentium은 RNA 서열 분석만을 위한 BMDM의 공동 배양에 대해 설명된 대로 준비되었으며, 세척 후 세포를 1x Sybr® green(Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3)에 실온에서 20분 동안 재현탁했습니다. 그런 다음 박테리아 세포를 4000rpm에서 5분 동안 펠릿화하고 완전한 DMEM으로 재현탁하고 복막 대식세포에 대해 미리 예열했습니다. 90분의 공동 배양 후, 배지를 흡인하고, 세포를 차가운 멸균 PBS로 2회 세척했습니다. Sybr® 녹색으로 염색된 F. Rodentium을 함유한 부착 세포를 2% 파라포름알데히드(PFA)로 10분 동안 고정했습니다. PFA를 흡인하고 멸균 PBS를 세포 위에 두었습니다. 그런 다음 세포를 F. Rodentium의 식세포작용에 대해 이미지화했습니다.
대식세포 이미지 분석
F. Rodentium 처리된 대식세포 배양물의 명시야 및 형광 이미지는 EVOS m7000 이미징 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 촬영되었습니다. 각 배양물에 대해 3~5개의 개별 무작위 이미지를 촬영했으며, 이는 3회 반복해서 수행되었습니다.
Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).
CLEC12A-Fc 융합 단백질 구축nd 정화~에
마우스 Clec12a의 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA를 C57Bl/6 WT SPF 골수로부터 분리한 백혈구로부터 PCR로 증폭시키고 서열분석으로 확인했습니다. cDNA는 발현 벡터 pFuse-hIgG1- Fc2(InvivoGen)에서 인간 IgG1-Fc의 C 말단에 융합되었습니다. Clec12a 또는 빈 벡터를 포함하는 구조물을 DMEM +10% FBS 및 Pen/strep(1mg/mL)과 함께 배양된 Lx293 세포에 형질감염시켰습니다. 형질감염 후 분비된 융합 단백질을 배지 24-48로부터 수확하였다. 잔해물/죽은 세포를 제거하기 위해 배지를 367 xg에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 사용할 때까지 -20C에서 동결시켰습니다. Clec12a-Fc 또는 Fc 단독 융합 단백질은 Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kit(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호: 88804)로 분리하고 Pierce™ BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific 카탈로그 번호: 23227)로 정량화했습니다. 항Clec12a 항체(Novus Biologicals NBP2-27346SS)를 사용한 웨스턴 블롯으로 확인했습니다.
Clec12a-Fc 결합 분석
정제된 구조물을 HBSS w/ Ca2+ 및 Mg2+에서 0.4 mg/mL로 희석했습니다. 박테리아는 각각의 배지와 호기성 조건에서 성장하고 OD 600nm로 정규화되었습니다. 박테리아를 Ca2+ 및 Mg2+가 포함된 HBSS로 세척하고 Ca2+ 및 Mg2+ +10% FBS가 포함된 HBSS로 실온에서 20분 동안 차단했습니다. 모든 염색 과정은 대기 조건에서 이루어졌습니다. 1 x 107개의 박테리아 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 넣고 3,000 xg로 회전시키고 따라냈습니다. 50uL의 구조물을 박테리아 세포에 놓고 가볍게 혼합한 후 4℃에서 1시간 동안 배양했습니다. 박테리아 세포를 Ca2+ 및 Mg2+ + 10% FBS가 포함된 HBSS, 2x로 세척했습니다. 50uL의 염소 항-인간 Fc(PE)(ebioscience 카탈로그 번호 12-4998-82)를 세포에 첨가하고 암소에서 4℃에서 1시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 이전과 같이 세척하고 1x Sybr® green(Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3)이 포함된 Ca2+ 및 Mg2+가 포함된 HBSS에 넣었습니다. 세포를 실온에서 20분 동안 암실에서 인큐베이션하고 BD LSR Fortessa 유세포 분석기에서 즉시 판독했습니다.
방사선 조사 및 골수 재구성
이전에 설명한 대로 WT 및 Clec12a-/- 동물로부터 골수를 수확했습니다. 수용된 마우스는 -1일에 500 Rads로 치사적으로 방사선을 조사한 다음 0일에 400 Rads를 조사했습니다. 마지막 조사 후 4시간 후, 수용 마우스를 이소플루란 마취하에 놓고 100uL의 분리된 멸균 PBS(1 x 108 세포/mL)에 현탁된 골수 세포를 28.5 게이지 바늘을 통해 안와후 공간으로 전달했습니다. 우리는 미생물군에 관심이 있었기 때문에 동물에게 항생제를 투여하지 않았고, 8주 후에 미생물군을 GF 동물로 옮기기 위해 배설물 펠릿을 수집했습니다.
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