Clr-f 발현은 신장 면역 및 대사 항상성을 조절합니다 III
Nov 24, 2023
논의
염증 및 면역 세포 매개손상은 신장 손상 및 기능 장애의 발생 및 진행에 주도적인 역할을 합니다. 본 연구에서는 유지 관리에 Clr-f에 대한 요구 사항을 보고합니다.신장 건강그리고 기능에 대한 본질적인 항상성 조절로서면역 및 대사 매개 신장 손상. 우리의 연구 결과는 Clr-f 결핍 마우스의 신장에서 면역 세포 침윤, 면역 글로불린 및 보체 단백질 침착을 보여줍니다. Clr-f가 결핍된 생쥐의 이러한 면역 특징은 나이와 관련된 관형 및 사구체 병변의 출현, 이소성 지질 축적 및 수많은 전사 과정의 조절 장애와 짝을 이룹니다.
유전적으로 연결된 NKR-P1 수용체 중 NKC 내에서 암호화된 Clr 단백질은 NKR-P1 발현 면역 세포에 의한 자기 상실 인식의 중복되지 않는 MHC 클래스 I 독립적 중재자로서 연구의 초점이 되어 왔습니다. 세포 스트레스에 반응하여 선택된 Clr 단백질의 발현 증가는 조직 상주 면역 세포의 면역 반응을 기능적으로 억제하는 것으로 보고되었습니다. 따라서, 장내 Clr-f는 억제성 NKR-P1G 수용체 발현 상피내 림프구와의 상호작용을 통해 면역원성이 높은 장내 환경 내에서 면역 관용에 기여하는 것으로 가정되었습니다7. Leibelt 등이 수행한 작업 폴리(I:C)로 공격받은 마우스는 Clr-f 발현이 증가했으며 시험관 내에서 Clr-f/NKR-P1G 상호 작용은 NKR-P1G 발현 세포에 대해 강력하게 억제된다는 것을 보여주었습니다. 함께 이러한 발견은 Clr-f가 미생물 자극에 의해 지속적으로 유발되는 상피 장벽을 향한 장내 상피 NKR-P1G 양성 하위 집합의 반응성을 방지할 수 있는 잠재적인 메커니즘으로 해석될 수 있습니다.
Clr-f 결핍 마우스의 생성은 우리에게 다음을 평가할 수 있는 첫 번째 기회를 제공했습니다.기능적 의미생체 내에서 Clr-f 발현에 대한 연구를 통해 신장에서 Clr-f의 잠재적인 면역 항상성 역할을 조사할 수 있었습니다. Clr-f-/- 마우스에서 관찰된 신장 손상은 Clr-f의 하향 조절이 NKR-P1G 발현 이펙터 세포에 대한 제약을 해제하는 세포 스트레스 및 손상의 지표 역할을 한다는 모델과 일치합니다. Clr-f-/- 마우스 신장의 T 세포에서 NKR-P1G의 증가는 Clr-f가 없을 때 신장 상주 T 세포 중에서 NKR-P1G 발현이 증가하거나 Clr- f-/- 마우스에 NKR-P1G 발현 T 세포가 침투되었습니다. Clr-f-/-마우스의 내장에서 NKR-P1G 발현 세포의 존재 또는 분포에 감지 가능한 변화가 없다는 것은 NKR-P1G의 기능적 결과를 나타낼 수 있습니다. 내장에서의 Clr-f 상호 작용은 제한적입니다. 면역 관용보다는 감염의 맥락에서 면역 반응성을 조절하는 것입니다. 대안적으로, 중복된 상호작용은 NKR-P1G 발현 세포의 활성을 제어할 수도 있습니다. 이는 NKR-P1G가 Clr-f뿐만 아니라 Clr-d 및 Clr-g33에도 결합한다는 사실이 뒷받침되며, 후자는 신장과 내장 조직 모두에서 적당히 발현됩니다6. 우리의 연구 결과는 자가 면역 신장 손상으로부터 보호하기 위해 Clr-f가 필요하다는 것을 보여 주지만 Clr-f-/-마우스의자가 면역 신장 병리에서 NKR-P1G 매개 역할은 불완전합니다. 특히 Clr-f-/-마우스의 신장에서 NKR-P1G 발현 T 세포가 증가했지만 그 차이는 압도적입니다. 대체 수용체가 신장에서 Clr-f의 감시에 참여할 가능성이 있습니다. 신장 항상성의 제어 축을 완전히 다루기 위해서는 추가 조사가 필요합니다.
면역 매개 신장 손상은 염증 세포가 간질 공간이나 사구체로 침윤되는 것으로 대표됩니다34. Clr-f-/- 생쥐의 단핵구, B 및 T 세포, 항사구체 항체, 상승된 IL-12 및 IFN 사이토카인, 다양한 사구체 병리의 신장 축적은 LN 생쥐 모델의 자가면역 환경과 매우 유사합니다. 즉, MRL-Faslpr)35-37. Clr-f-/- 신장은 관련 IgM 및 IgG 침착과 Clr-f-/- 및 IgAN 전사 프로파일의 클러스터링과 함께 IgA 우세한 메산지움 침착물을 나타내지만 이러한 표현형이 일종의 IgAN38을 사용한 CKD. 오히려 이러한 손상은 Clr-f-/- 신장의 혈관간질 용해, GBM 비후 및 족세포 사멸뿐만 아니라 세뇨관간질 변화, 지방 축적 및 대사 경로의 심각한 조절 장애와 함께 다양한 병리학에 공통된 요소입니다. 면역체계37,39,40에 의해 악화된 대사 결함으로 인해 발생합니다. Clr-f-/- 마우스 신장 기능 장애의 근본 원인이나 질병 유형에 관계없이 Clr-f는 명확한 사구체신염 관련 병리를 동반한 자가면역 발달을 완화시키는 역할을 하는 것으로 보입니다.
Rag1-/-Clr-f-/-마우스에 대한 우리의 조사는 Clr-f-/-마우스의자가 면역 반응에 대한 T 및 B 세포 독립적 중재자의 두드러진 기여를 나타냅니다. 특히, 사구체 주위 CD11c+ 세포, F4/80+ 세포 및 NKp46+ 세포의 축적은 T 및 B 세포가 없는 경우 더욱 두드러졌으며 사구체 손상의 유의미한 존재와 상관관계가 있었습니다. 이는 T 및 B 세포가 신장 손상 염증 및 자가항체 복합체에 기여할 수 있지만 Clr-f-/- 마우스에서는 이것이 병리학의 중심 결정 요인이 아닐 수 있지만 다른 면역 세포의 염증 활성에 대한 이차 기여자이거나 잠재적으로 Clr-f가 결핍된 생쥐에서 면역조절 역할을 합니다. 이는 IFN 생성 T 세포가 나이가 들고 사구체 손상이 진행됨에 따라 증가하는 강한 T1 극성 반응을 보이는 IgAN의 ddY 마우스 모델의 증거와 대조됩니다41. Clr-f 결핍 마우스에서 B 세포의 신장 침윤은 SLE42의 마우스 모델에서도 나타났습니다. 현재까지 신장의 B 세포가 CKD의 염증 손상에 기여하는지, 아니면 더 많은 조절 역할을 하는지는 불분명합니다43. 노인 환자의 CKD에 대한 최근 증거에 따르면 B 세포 집단의 감소는 신장 질환의 진행과 관련이 있는 것으로 나타났습니다44. T 세포와 B 세포 모두 자가면역 신장 질환에서 면역 억제 활성을 갖는 것으로 나타났으므로 Clr-f-/- 마우스의 병리 현상에 기여하거나 조절하는 정도에 대해서는 추가 조사가 필요합니다.
우리의 연구 결과는 근위 세뇨관, 족세포 및/또는 장 상피의 세뇨관 상피에서 Clr-f 발현에 대한 요구 사항을 함께 보여줍니다. Clr-f 발현의 상실은 뚜렷한 자가면역 및 염증성 연쇄반응을 유발하여 신장 손상 및 관련 비만증을 유발합니다. Clr-f의 손실로 인한 면역 반응은 T 세포와 B 세포에 독립적인 것으로 보입니다. 전반적으로, 신장에서 Clr-f의 기능적 역할은 장에 존재하는 신장의 감시 이펙터 면역 세포에 대한 억제 분자 또는관형 세포 기능의 내재적 조절인자.
재료 및 방법 마우스.
모든 생쥐는 병원균이 없는 전용 환경에서 유지되었습니다. C57BL/6(WT) 및 B6.129S7- Rag1tm1Mom /J(Rag1−/−) 마우스는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)에서 구입했습니다. Rag1 및 Clr-f (Rag1-/-; Clr-f-/-)에 결합된 null 돌연변이를 보유하는 마우스는 Clr-f-결핍 (Clr f-/-) 마우스를 (Rag1-/-) 마우스와 교배하여 생성되었습니다. . 동물에 대해 수행된 모든 번식 및 조작은 대학 지침에 따라 이루어졌으며 Dalhousie University 동물 윤리 위원회와 University of Ottawa의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 연구 설계, 실험 및 보고는 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다.
Clr-f-결핍 마우스의 생성. Clr-f-결핍(Clr-f -/-) 마우스는 여우형 포스포글리세레이트 키나제(PGK)-네오마이신 카세트와 엑손 3, 4 및 엑손 5의 일부에 걸친 게놈 서열을 포함하는 표적 구조물의 상동 재조합에 의해 생성되었습니다. Clr-f 유전자. C57BL/6 브루스{9}} 배아 줄기(ES) 세포에 전기천공하기 전에 오타와 병원 연구소(OHRI)에서 서열분석을 통해 완전한 표적화 구성을 확인했습니다. G{{10}} 저항성에 의한 ES 클론 선택은 IRCM(몬트리올 임상 연구소) 형질전환 핵심 시설(캐나다 퀘벡주 몬트리올)에 의해 수행되었습니다. 한편, 5' 및 3' Clr-f 프로브는 각각 BamHI 및 PstI로 소화된 WT B6 마우스의 흉선 게놈 DNA를 사용하여 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석에서 테스트되었습니다. 소화된 DNA 단편을 1% 아가로스 겔에서 분리하고 나일론 막 블롯으로 옮겼습니다. Clr-f cDNA 프로브는 NEB 로트 키트(New England Biolabs, USA)를 사용하여 방사성 32P-dCTP(Perkin Elmer, Guelph, ON, Canada)로 표지되었습니다. 블롯은 혼성화 용액(10% (w/v) 덱스트란 설페이트; 1 M NaCl; 1% SDS)에서 32P-표지된 Clr-f cDNA 프로브로 프로빙되었습니다. 혼성화는 65도에서 밤새 수행되었으며, 혼성화 후 세척은 65도까지 예열된 2x SSC 및 1% SDS를 함유한 용액으로 수행되었습니다. 혼성화 신호를 나타내기 위해 Te 블롯을 사진 필름에 노출시켰습니다(그림 S1A, S3B). 서로 다른 혼성화 사이에 85도에서 30분 동안 0.2% SSC/0.2% SDS를 사용하여 막을 벗겨냈습니다. 네오마이신 내성 클론은 서던 블롯 분석으로 스크리닝되었으며 ~15%의 표적화 효율이 관찰되었습니다. 선택된 ES 클론을 IRCM 미세주입 서비스 시설에서 배반포에 미세주입하여 키메라 Clr-flox 창립 마우스를 생성했습니다. 마우스를 서던 블롯 분석으로 스크리닝한 후 B6 암컷과 교배시켜 Clr-fwt/lox 이형접합 마우스를 생산했습니다. Clr-flox/lox 마우스를 얻기 위해 이형접합성 마우스를 교배시켰습니다. 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 Clr-flox/lox 마우스를 B6 배경(Jackson Laboratory)에서 동형접합성 CMV-cre 형질전환 마우스와 사육했습니다. 생성된 이중 이형접합성 CMV-CreTg/0; Clr-f-/+ 마우스를 교배하여 CMV-cre 이식유전자가 결여된 Clr-f-/- 마우스를 생산했습니다. 특정 프라이머를 사용하여 마우스의 유전자형을 분석했습니다 (표 1, 그림 S1B, C 및 그림 S3C, D). AccuStart II Taq DNA 중합효소(Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 PCR 증폭을 수행했습니다. PCR 혼합물은 제조업체의 지침에 따라 준비되었습니다. 페놀/클로로포름 추출된 귀 DNA를 주형으로 사용했습니다. 다음 PCR 사이클링 매개변수가 사용되었습니다: 40초 동안 94도, 45초 동안 60도, 60초 동안 72도의 30회 증폭 주기. WT 및 Clr-f -/- 한배새끼는 달리 명시하지 않는 한 모든 실험에 사용되었습니다.
현장 혼성화.
Clr-f의 현장 혼성화 분석은 이전에 설명한 대로 전체 길이 센스 가닥 CDS 및 Clr-f 스패닝 안티센스 가닥을 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝하여 달성되었습니다. Digoxi genin-표지된 안티센스 및 센스 RNA 프로브는 DIG RNA 표지 믹스(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 T7 폴리머라제를 사용하여 Clr-f 유전자를 코딩하는 선형화된 플라스미드로부터 전사되었습니다. 조직을 성체 B6 마우스로부터 수집하고 실온에서 10% 포르말린 또는 최대 24시간 동안 가볍게 흔들면서 4도에서 4% 파라포름알데히드에 고정했습니다. 그런 다음 조직을 파라핀에 삽입하고 4μm 섹션을 유리 슬라이드에 준비했습니다. 조직 슬라이드를 0.2 N HCl로 15분 동안 처리하고 30 µg/mL의 단백질분해효소 K를 37도에서 20분 동안 처리하여 탄산을 제거했습니다. 조직을 4% PFA에 10분간 고정한 후 0.1M 트리에탄올아민에 용해된 0.25% 무수 아세트산으로 각각 5분간 2회 처리했습니다. 그런 다음 슬라이드를 하이브리드화 용액(50%(v/v) 포름아미드/5×SSC, pH 4.5; 2%(w/v) 차단 분말(Roche); 0.05%(w/v) CHAPS; 5mM로 사전 하이브리드화했습니다. EDTA, 50 μg/mL 헤파린, 1 μg/mL 효모 RNA)를 58도 오븐에서 최소 1시간 동안 넣은 다음 500 ng/mL 디곡시게닌 표지 프로브를 함유한 혼성화 용액과 함께 밤새 58도에서 배양했습니다. 혼성화 후 세척은 50% 포름아미드/2x SSC, pH 4.5, 55도에서 3x로 각각 20분 동안 수행되었으며 슬라이드는 차단 용액에서 1:1000 희석된 양 항 디곡시게닌 알칼리성 포스파타제 결합 항체로 염색되었습니다( 로슈). 발색은 슬라이드에 니트로블루테트라졸륨/5-브로모, 4-클로로, 3-인도일포스페이트(NBT/BCIP, Roche) 기질을 첨가하여 진행하였다. 최적의 신호가 나타날 때까지 슬라이드를 실온에서 어둠 속에 보관했습니다. 대조 표지화는 센스 가닥 프로브와 특이성이 확인된 센스 및 안티센스 프로브를 이용한 경쟁적 결합 연구를 사용하여 수행되었습니다. 그런 다음 슬라이드를 연한 녹색 또는 메틸 녹색으로 대비염색하고 광학 현미경으로 시각화했습니다.
RT-PCR. 연령 및 성별이 일치하는 WT 및 Clr-f -/- 마우스의 신장 조직을 절제하고 PBS로 헹구고 -80도에서 동결시켰습니다. 제조업체의 지침에 따라 RiboZol RNA 추출 시약(AMRESCO Inc., West Chester, PA, USA)을 사용하여 냉동 조직에서 RNA를 분리했습니다. Verso cDNA 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 약 1ug의 RNA를 cDNA로 전사했습니다. 특정 프라이머를 사용하여 1 μL의 cDNA 생성물에 대해 PCR 증폭을 수행했습니다 (표 1). 사용된 PCR 조건은 94도 30초, 58도 30초, 72도 60초, 증폭 주기는 35회였습니다. PCR 산물은 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 1% 아가로스 젤에서 시각화되었습니다(그림 1C, 그림 S3A).
면역조직화학.
연령 및 성별이 일치하는 WT 및 Clr-f -/- 마우스의 신장 조직을 자일렌에서 3회 5분 인큐베이션, 100% 에탄올에서 2회 5분 인큐베이션, 이어서 90분간 인큐베이션하여 탈파라핀화했습니다. % 에탄올, 그다음 80% 에탄올, 마지막으로 70% 에탄올입니다. 슬라이드를 증류수(20회 담그기)로 세척하여 재수화시키고, 구연산염 완충액(pH 6.0)에서 압력솥을 사용하여 열 유도 에피토프 검색을 수행했습니다. 내인성 퍼옥시다제는 멸균수에 용해된 3% 과산화수소로 10분 동안 차단하였고, 단백질은 Background Sniper(Biocare Medical, Pacheco, CA, USA)를 사용하여 차단하였다. 그런 다음 섹션을 쥐 항-마우스 단일클론 항-Clr-f 항체와 함께 4도에서 밤새 배양했습니다. 다음날, 슬라이드를 0.1 M PBS로 헹구고 2차 항체에서 1시간 동안 배양했습니다. 염색은 Goat-on-Rodent HRP-Polymer 키트(Biocare Medical) 및 Betazoid DAB Bufer(Biocare Medical)를 사용하여 개발한 후 헤마톡실린 대조염색을 수행했습니다. 항-NKp46(eBioscience, Santa Clara, CA, USA, clone 29A1.4, CAT#)을 사용하여 NKp46+ 및 CD3+ 세포의 IHC 라벨링을 위해 신장 조직 절편을 염색하는 데에도 동일한 과정을 사용했습니다. 48-3351-82) 및 항-CD3(BioLegend CAT#100,327)을 각각 1차 항체로 사용합니다. F4/80의 IHC 라벨링은 항-F4/80 쥐 단일클론 BM8 항체를 사용하여 냉동 신장 절편에서 수행되었습니다. 위와 같이 염소 항-랫트 IgG H&L HRP 결합 2차 항체(Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057)를 사용하였고, IHC는 HRP(horse radish peroxydase) 기질을 사용하여 개발하였습니다. DAB Substrate Kit(Abcam, CAT# ab64238).
면역형광.
연령 및 성별이 일치하는 WT 및 Clr-f -/- 마우스의 신장 및/또는 장 조직을 Tissue-Tek 최적 절단 온도 화합물(Fisher Scientific, 미국 펜실베니아주 피츠버그). 20 μm 저온 유지 장치 섹션을 흄 후드에서 16분 동안 실온에서 아세톤으로 고정하고 0.01 M PBS, pH 7.4로 세척한 후 최소 30분 동안 공기 건조했습니다. 비특이적 결합은 10% 당나귀 혈청으로 차단되었습니다. 섹션을 1차 항체인 항-Clr-f7, 항-NKR-P1G(이전에 설명한 쥐 항-마우스 단클론 항체7), 항-IgA(염소 항-마우스 IgA 알파 사슬(Abcam, Cambridge)와 함께 4도에서 밤새 배양했습니다. , UK CAT#ab97235), 항-IgG-PE(BioLegend, San Diego, CA, USA CAT#405324, 항-IgM-FITC(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA CAT#A21042), Complement C3 항체(11H9) ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA Cat# NB200-540), 항-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA CAT#554411), 항-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), 항CD45-FITC(BioLegend CAT#103108), 항CD11c-FITC(eBioscience CAT#11-0114-85), 항F4/80- 가습 챔버 내 5% 정상 혈청 내 1:100 농도의 APC(BioLegend CAT#123116) 및 항-NKp46-eFluor 450(eBioscience, CAT#48-3351-82). 항의 2차 항체 라벨링 -FITC 결합 다클론 항체를 사용한 Clr-f 및 항-NKR-P1G 항체는 실온에서 1시간 동안 배양되었습니다. 샘플은 실온에서 5분간 DAPI 핵 염색되고 PBS로 세척된 후 VECTASHIELD 한 방울과 함께 유리 슬라이드에 올려졌습니다. PLUS 안티페이드 장착 매체(Vector Laboratories, San Francisco, CA, USA) 및 유리 커버슬립으로 덮여 있습니다. Zeiss LSM 510 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사했습니다.
조직학 및 병리학 점수.
연령 및 성별이 일치하는 WT, Clr-f -/-, Rag1-/- 및 Rag1-/-Clr-f -/- 마우스(3μm)의 신장 절편은 PAS(Periodic acid-Schif)로 염색되었습니다. 신장 조직은 혈관사이 세포성(혈관사이 부위당 4개 이상의 핵으로 정의됨), 모세혈관내 증식, 초승달 및 사구체 경화증에 대해 평가되었습니다. 세뇨관병증, 간질성 섬유증, 세뇨관 위축 및 세뇨관간질 세포 침윤의 존재 여부에 대해서도 절편을 평가했습니다. 사구체 병리학의 경우 반정량 점수를 사용하여 사구체 손상 정도를 평가했습니다. 각 그룹에서 최소 5개의 0 사구체가 검사되었으며 병변의 심각도는 0에서 +3까지 등급이 매겨졌습니다. +1 병변은 30% 이하의 침범을 나타냅니다. 사구체의+2 30~60%인 반면, +3 병변은 사구체의 60% 이상이 관련되었음을 나타냅니다. GBM 두께의 측정은 Image J V1.53a47을 사용하여 WT 및 Clr-f -/-의 사구체 전자 현미경 사진에서 수행되었습니다. 두 마리의 Rag1-/- 및 두 마리의 Rag1-/-Clr-f -/- 마우스의 PAS 염색 신장 조직을 추가로 위의 병리학적 특징의 존재에 대해 맹목적으로 채점하고 정량화된 특징을 평균 4개의 신장 절편에서 계산했습니다. 생쥐.
전자현미경.
투과 전자 현미경 검사법을 위한 조직 처리는 발표된 프로토콜을 따랐습니다. 간단히 말하면, 12-주령 WT 및 Clr-f -/- 마우스의 신장 조직의 작은 조각을 2.5% 글루타르알데히드 용액에 고정한 다음 1% 사산화오스뮴/우라닐 아세테이트 방법을 사용하여 처리했습니다. Reichert-Jung ultra cut E ultramicrotome을 사용하여 절단하기 전에 샘플을 Epon Araldite 수지에 매립했습니다. JEOL JEM 1230 투과 전자 현미경으로 샘플을 시각화하고 Hamamatsu ORCA-HR 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처했습니다.
소변 및 혈장 화학 폐기물 및 전해질 측정.
12-주령 수컷 WT 및 Clr-f -/- 마우스로부터 연속 5일 동안 하루 중 같은 시간에 약 150 μL의 소변을 매일 수집했습니다. 소변을 10000rpm으로 원심분리하여 잔해물을 제거한 후 -80도에 보관했습니다. 동일한 마우스로부터 헤파린 처리된 튜브에 안면 정맥 혈액을 수집하고 3000g에서 5분간 원심분리하여 분리하고 -80도에서 보관했습니다. 단백질, 크레아티닌 및 전해질 농도 측정을 위해 소변 및 혈장 샘플을 Idexx Laboratories(온타리오주 마크햄)로 보냈습니다.
12주 및 24주령 생쥐의 혈압 측정. 수축기 및 확장기 혈압(BP)은 BP2000 Visitech 모델을 사용하여 항정 상태에서 12주 및 24-주령 수컷 WT 및 Clr-f −/− 마우스에 대한 꼬리 커프 혈량측정법으로 측정했습니다. 혈압은 5일 연속 같은 방에서 같은 시간에 매일 측정되었습니다. 첫 2일은 생쥐 적응에 필수적인 것으로 간주되었으므로 마지막 3회 연속 측정의 혈압 값을 사용하여 평균 혈압 값을 계산했습니다.
Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>샘플당 30× 106 읽기 깊이.
RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 및 로그 접기 변경 컷오프는 1.5입니다. 모든 시점 및 샘플에 대한 FPKM 값이 제공됩니다(보충 데이터 세트 파일 1). 기능 강화 분석. 유전자 온톨로지 및 기능 강화 분석은 g: 프로파일러(버전 e102_예49_p15_7a9b4d6)와 g: SCS 다중 테스트 수정 방법(유의성 임계값 0.05를 적용함)을 사용하여 수행되었습니다(https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 및 Fisher의 정확한 테스트 및 FDR 임계값을 갖춘 PANTHER 분류 시스템<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53.
Mus Musculus(GRCm38.p6) BioMart 릴리스: g: Profiler(https://biit.cs.ut.ee에서 다운로드됨)에 대한 GO 생물학적 프로세스(GO: BP)의 유전자 세트를 사용하여 기능 강화 네트워크가 생성되었습니다. /gprofiler/gost). 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 FDR 기반 네트워크 농축을 사용하여 GSEA V4.0354,55를 사용하여 수행되었습니다.<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).
복부 및 이소성 지질 분석. 지방 축적은 개별 마우스로부터 해부된 복부 지방의 무게에 의해 결정되었습니다. 체중 측정은 지방 추출 전에 이루어졌습니다. ORO(Oil Red O) 염색을 위해 냉동 신장 절편을 저온 유지 장치를 사용하여 10μm로 절단한 후 30분 동안 공기 건조했습니다. ORO 염색은 절편을 60% 이소프로판올로 3회 세척하여 고정하고 작업 농도(66%)의 ORO 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 염색과 함께 15분 동안 배양하여 수행되었습니다. 그런 다음 슬라이드를 60% 이소프로판올로 빠르게 세척하고 Mayer의 헤마톡실린으로 빠르게 염색하여 핵을 강조한 다음 VectaMount AQ Aqueous Mounting Media(Vector Laboratories)를 사용하여 장착했습니다.
병원형 분석. 병원형 분석은 q와 함께 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 사용하여 수행되었습니다.<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation.
소화된 조직을 70-μm 나일론 필터에 통과시킨 후 PBS로 세척하고 남은 적혈구를 ACK 용해 완충액으로 얼음 위에서 5분간 용해시켰다. 신장 면역 세포를 40% Percoll에서 30분 동안 2000rpm에서 RT 원심분리하여 분리했습니다. 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시키고 혈구계산기로 세포 수를 측정했습니다. 세포 표면 단백질 발현을 확인하기 위해 다양한 mAb가 사용되었고, 세포는 형광색소 표지된 마우스 항체를 사용한 유세포 분석을 위해 염색되었습니다: 항-CD45(eBioscience, 클론 30-F11), 항-TCR(eBioscience, 클론 H{ {12}}), 항-NK1.1(eBioscience, 클론 PK136), 항-CD19(BioLegend, 클론 1D3/CD19), 항-CD11b(BioLegend, 클론 M1/70), 항-F4/80(BioLegend, 클론 BM8), 항-MHCII(IA/IE)(BioLegend, 클론 M5/114.15.2), 항-Ly6G(BioLegend, 클론 1A8), 항-NKp46(eBioscience, 클론 29A1.4) 및 이소형 대조군. 세포 생존가능성은 Fixable Viability Dye(eBioscience, Cat# 65-0865-14)를 사용하여 결정되었습니다. WT 및 Clr-f -/- 신장에서 면역 세포 집단을 확인하고 정량화하기 위해 세포 특이적 마커에 대한 항체를 사용한 다중 매개변수 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 호중구(CD11b+Ly6G+), 대식세포(CD11b+Ly6G-F4/{ {57}}MHCII+), NK 세포(CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+) 및 NKp46+ 세포(CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), T 세포(Ly6G−NK1 .1−TCR +) 및 B 세포(CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). 모든 샘플은 BD-Fortessa 유세포 분석기에서 수집되었습니다.
참고자료
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