고차 조절 조합을 발견하고 신경 분화를 위한 유전자 동인을 엔지니어링하기 위한 조합 유전학 방법

효과적인 세포 분화 인자 탐색에 뛰어들기

연구자들은 여전히 ​​파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병과 같은 신경 장애의 진행을 되돌리거나 늦추기 위한 더 나은 치료법을 찾기 위해 노력하고 있습니다. 이러한 장애는 뇌의 다른 부분에서 신경세포 사멸의 결과입니다. 환자의 증상을 완화시키는 데 사용되는 약물이나 치료법은 잘 확립되어 있지 않습니다.

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그들은 손상된 신경 조직을 복구하지 않으며 원치 않는 부작용을 초래할 수 있습니다. 따라서 점점 더 많은 연구가 줄기 세포를 유망한 치료제로 보고 있는데, 이는 줄기 세포의 자가 재생 능력과 손실된 신경 조직을 복구하기 위해 환자에게 생착하기 위해 원하는 세포 계통으로 분화하는 유연성 때문입니다.

그러나 줄기 세포가 신경 장애 치료에 임상적으로 사용되기 전에 잠재력을 최대한 발휘하기 위해 더 나은 이해가 필요한 영역이 여전히 있습니다. 줄기 세포는 분화를 유도하는 요인의 올바른 조합이 주어지면 모든 세포 유형이 되는 경향이 있는 재생성 및 가단성입니다. 그러나 대규모 요인 네트워크에는 복잡성의 깊이가 있습니다.

배아줄기세포(ESC), 유도만능줄기세포 등 줄기세포를 가장 빠른 속도로 분화하기 위해서는 전사인자(TF), 소분자, 성장인자 등의 조합을 결정하는 것이 중요합니다. 뉴런 계통의 가장 순수한 집단에서. 그러나 보다 비용 효율적이고 시간 효율적인 방식으로 이러한 요소를 선별하는 전략적 방법이 있을 수 있습니다.

이것은 여전히 ​​힘든 이미 확립된 프로토콜을 최적화하거나 중간 가시 뉴런, 감각 뉴런 및 세로토닌 뉴런과 같은 신경 하위 유형의 추가 특성화를 위해 최적화하는 데 도움이 될 것입니다. 신경 운명의 드라이버를 포괄적으로 프로파일링하고 이러한 요소가 규제 네트워크에서 서로 어떻게 상호 작용하는지 정의하는 것은 여전히 ​​도전입니다.

몇몇 그룹은 세포 운명의 규제 네트워크를 밝히고 신경 전환 및 생존을 유도하는 요인에 대한 유익한 통찰력을 제공하기 위해 새로운 고처리량 스크리닝 접근법을 사용했습니다. Liu et al. (2018)은 CRISPR 활성화(CRISPRa)를 사용하여 ESC의 신경 운명을 촉진하는 TF 또는 DNA 결합 인자를 검색했습니다. 그러나 작업은 단일 요인 또는 쌍별 조합을 연구하는 것으로 제한되었습니다.

또 다른 체계적인 스크리닝은 Tsunemoto et al. (2018), TF 간의 관계를 조사했습니다. 그들이 선택한 단일 TF의 대부분은 연구에서 효과를 나타내지 않았지만 마우스 섬유아세포의 유도 뉴런으로의 분화를 촉진하는 76개의 쌍별 TF 조합을 확인했습니다.

특히, 그들의 결과는 유도된 뉴런에서 도파민 활성 수송체 Slc6a3를 감지하지 못하는 것과 같은 이전 연구와의 일관성이 부족했습니다. 또 다른 연구는 CRISPR 간섭(CRISPRi) 기반 스크리닝을 수행하여 뉴런의 생존을 유지하거나 향상시키는 필수 유전자를 결정했습니다(Tian et al., 2019). 그리고 다시, 그들은 단일 sgRNA의 스크리닝으로 제한되었습니다.

다른 유전적 요인에 대한 편향되지 않은 스크리닝과 요인 조합의 수를 늘리기 위해 추가 연구가 필요합니다. 차별화 및 리프로그래밍을 효율적으로 추진하기 위해 서로 다른 맥락에서 두 가지 이상의 요인의 칵테일이 필요할 수 있음이 밝혀졌기 때문입니다.

좋은 예는 Oct4, Sox2, Klf4 및 ESC의 다능성에 대한 발달 신호 네트워크를 조절하는 데 필요한 c-Myc의 조합입니다(Takahashi 및 Yamanaka, 2006). 이러한 복잡한 시스템에서는 고차 유전자 조합의 기능을 높은 처리량 방식으로 포괄적으로 특성화할 필요가 있으며 Combinatorial Genetics En Masse(CombiGEM) 방법이 바로 이를 수행할 수 있습니다.

요인 조합의 높은 처리량, 높은 차수 및 체계적인 화면을 위한 CombiGEM 방법

CombiGEM은 대규모 풀 스크린을 수행하는 체계적인 방법을 제공할 뿐만 아니라 고차 조합 유전자 라이브러리의 확장 가능한 조립 기능도 제공합니다(Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). 원팟 프로세스를 통해 사용자는 다수의 유전자 조합을 스크리닝할 수 있습니다. 1-way, 2-way, 3-way, 이론상 n-way 라이브러리.

이는 관심 있는 개별 후보 조합을 ​​구축하고 테스트하는 기존 프로세스에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 여러 다른 조합 CRISPR 스크리닝 전략도 쌍별 유전자 조합을 연구하기 위해 개발되었지만(Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020 ), CombiGEM은 3개 이상의 유전자 조합 간의 상호 작용을 평가할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다.

예를 들어, 사용자가 각각 후보 TF 조합 목록을 과발현 또는 억제하기 위해 CRISPRa 또는 CRISPRi를 사용하려는 경우 CombiGEM-CRISPR v2를 사용하여 TF 표적화 sgRNA 조합의 바코드 라이브러리를 스크리닝할 수 있습니다.0 ( Wong et al., 2016; Zhou et al., 2020) 그림 1과 같다.

원팟 연결 단계를 사용하여 sgRNA 라이브러리 및 해당 바코드는 튜불린 1과 같은 뉴런 세포 유형별 프로모터의 활성화 시 형광 단백질의 발현을 보고하는 렌티바이러스 대상 벡터에 통합됩니다. 라이브러리 sgRNA 및 전사 활성인자 또는 억제인자와 융합된 효소적으로 결핍된 Cas9를 포함하는 별도의 렌티바이러스 벡터는 원하는 시작 세포로 전달될 수 있습니다.

시간이 지남에 따라 세포가 분화되기 시작하면 유도된 뉴런 유사 세포만 형광을 발현하며, 이러한 세포는 바코드 시퀀싱을 통해 은닉 TF 조합을 검색하기 위해 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분리할 수 있습니다.

특정 세포 계통을 유도하는 조합을 더 잘 이해하기 위해 사용자가 연구하기로 선택한 분화 단계의 기본 설정을 기반으로 알려진 세포 계통 리포터 또는 마커에 대해 이러한 세포를 조사할 수도 있습니다. 자기 활성화 세포 분류는 세포 표면 마커 발현에 따라 관심 있는 세포를 분리하는 데 사용될 수 있습니다.

단일 세포 RNA 시퀀싱은 유전자 상향 또는 하향 조절의 유형 및 수준을 프로파일링하기 위한 판독값으로서 조합 CRISPR 스크리닝에 결합될 수 있으며 표적 TF의 조합은 바코드 판독을 통해 결정될 수 있습니다(Replogle et al., 2020). 고함량 이미징은 뉴런 발달의 초기 단계에서 후기 단계로의 세포 형태 변화를 모니터링하는 데 사용될 수 있습니다.

유도된 뉴런 유사 세포의 생리학적 관련성 또는 기능은 NeuN, TUJ1 및 MAP2와 같은 뉴런 성숙에 특이적인 면역세포화학적 라벨링 및 전기생리학적 측정에 의해 결정될 수 있습니다. 앞서 언급한 바와 같이 연구에서는 세포 운명을 조작하기 위해 TF와 소분자를 결합했습니다.

CombiGEM은 또한 줄기 세포의 자가 재생을 유지하거나, 세포 계통 분화를 유도하거나, 효율을 높이고 잠재적으로 유전적 요인을 대체함으로써 재프로그래밍을 용이하게 할 수 있는 소분자 조합을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. CombiGEM은 신호 경로, 후생유전학적 또는 세포 과정 인자의 소분자 표적을 먼저 결정하여 적용할 수도 있습니다.

그런 다음 sgRNA 라이브러리를 설계하여 약물화 가능한 표적을 활성화 또는 비활성화함으로써 분화 또는 재프로그래밍을 강화하기 위한 소분자의 효과적인 조합을 식별할 수 있습니다. 이 개념은 암과 파킨슨병에 대한 약물 표적 조합을 발견하기 위해 이전에 수행한 연구에 잘 반영되어 있습니다(Zhou et al., 2020).

CombiGEM의 사용은 CRISPR 기반 섭동에만 국한되지 않고 다른 DNA 또는 RNA 조절 요인에도 적용하여 RNA 간섭이 있는 기능 상실 스크린을 연구할 수 있습니다. microRNA(Wong et al., 2015) 및 인간 TFome 라이브러리(Ng et al., 2020)에서 보고된 것과 같은 서열 검증 인간 오픈 리딩 프레임.

전사 인자의 고처리량 엔지니어링을 위한 CombiSEAL 방법

자연적으로 발생하는 유전적 요인의 이상적인 조합을 찾는 것은 분화에서의 발현 및 역할에 대한 사전 지식이 있는 게놈의 특성화된 TF로 제한되는 것과 같은 여전히 ​​문제를 제기할 수 있습니다. 연구에 따르면 TF를 조작하거나 인공 전사 인자를 생성하면 대체 경로를 통해 분화 속도를 높이고 유전자 조절 네트워크 내에서 다른 내인성 보조 인자의 전제 조건 발현 의존성을 능가하거나 완전히 대체할 수 있는 새로운 옵션이 열렸습니다. 더 효율적인 자연 TF(Jauch, 2018).

이를 통해 연구원은 실험 요구에 따라 필요한 요소를 조정할 수 있습니다. 다른 도메인을 구성하는 TF에 대해 여러 사이트에서 높은 처리량 돌연변이 유발을 수행하는 것을 목표로 하는 경우 CombiSEAL이 유용한 플랫폼이 될 수 있음을 제안합니다(Choi et al., 2019). CombiSEAL 방법은 바코드로 조합 태그가 지정된 아미노산 코딩 DNA 조각을 조립합니다(그림 1).

그림 1 ｜ CombiGEM 및 CombiSEAL 방법으로 분화의 효과적인 유전 동인을 스크리닝합니다. CombiGEM 방법의 예는 동일한 구조에서 발현된 여러 sgRNA의 조립이며 sgRNA 조합은 연결된 바코드로 표시됩니다. CombiSEAL 방법은 P1, P2, P(n) 및 P(n 플러스 1)로 표시된 전사 인자와 같은 단백질의 다양한 부분에 도입된 돌연변이를 포함합니다. 그리고 돌연변이의 조합은 해당 연결된 바코드에 반영됩니다. 사용자는 다른 DNA 전달 시스템에 설정을 적용할 수 있으며 이 표현에서는 렌티바이러스 벡터가 사용됩니다. 스크리닝 전략은 풀링된 형식으로 수행할 수 있으며, 이 예에서 특정 뉴런 계통으로 분화하는 세포 집단을 식별하는 것은 다이어그램에서 X-형광으로 표시된 형광 단백질 발현을 위한 프로모터의 활성화에 의해 감지됩니다. 세포 풀에서 바코드의 차세대 시퀀싱(NGS)은 DNA 표적 또는 전사 변이체를 해독합니다. 서로 다른 뉴런 유형의 분화를 유도하는 요인에 대한 엄격한 분석은 세포 계통 마커로 세포를 탐색한 다음 다중 웰 플레이트로의 자기 활성화 세포 분류(MACS)와 같은 어레이 기반 방법을 사용할 수 있습니다. 고함량 이미징. 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 통해 사용자는 원하는 표현형으로 세포의 유전자 발현을 프로파일링할 수 있으며 바코드를 검색하여 주요 변형의 sgRNA 조합 또는 돌연변이 조합을 식별할 수 있습니다. FACS: 형광 활성 세포 분류.

CombiSEAL은 돌연변이 유발이 필요한 단백질의 첫 번째 절편 부분으로 시작합니다. 사용자는 각 섹션에 대해 원하는 수의 변형을 생성한 다음 바코드로 태그를 지정하여 돌연변이의 위치와 조합을 식별할 수 있습니다. 섹션의 각 풀은 의도된 돌연변이 유발 영역에서 플랭킹 유형 IIS 효소로 변형된 야생형 단백질 서열을 포함하는 대상 벡터에 섹션을 삽입하여 순차적으로 조립됩니다.

단백질의 여러 부분을 연결하는 흉터 없는 융합 방식은 원치 않는 아미노산이 단백질에 추가되는 것을 방지하는 데 중요합니다. CombiSEAL 방법을 사용하면 선택한 변이체 풀의 아미노산 서열을 보다 효율적이고 비용 효율적으로 결정할 수 있으므로 전체 단백질에 대한 긴 판독 시퀀싱이 필요하지 않아 돌연변이 유형과 돌연변이 유형을 식별할 수 있습니다. 단백질.

이 체계적 설정은 아미노산 돌연변이의 유형과 위치의 조합 또는 도메인 교환, 삽입 및 삭제와 같은 기타 원하는 변형을 추론하는 짧은 연결된 바코드 풀의 높은 처리량 시퀀싱을 수행하여 보다 쉬운 분석을 허용합니다. 초기 설계 및 TF에 설치

결론

시행 착오 방법과 비교하여, 하나의 세포 유형을 뉴런 계통으로 변환하는 데 필요한 필수 요소 또는 조합을 결정하기 위해 보다 체계적인 접근법을 사용하는 데 발전이 이루어졌습니다. 그러나 고차 조합을 식별하는 기능이 부족했으며 여기에서 CombiGEM 방법이 이러한 제한 사항을 해결할 수 있다고 제안합니다.

CombiGEM은 바코드가 있는 원팟 결찰 시스템을 사용하여 DNA 결합 인자의 고차 조합을 결합하여 한 번에 DNA를 표적으로 삼고 여러 라운드의 스크리닝 프로세스를 우회하여 다운스트림 검증을 위해 적중 수를 관리 가능한 크기로 좁힙니다. . 또한, 덜 효율적인 천연 TF는 유전자 발현을 더 잘 조절하기 위해 인공 또는 조작된 TF로 대체될 수 있습니다. 우리는 사용자가 단백질 및 다른 도메인 내에서 바코드로 태그가 지정된 여러 사이트 돌연변이를 직접 조합하여 대규모 전사 인자 변형 풀을 생성할 수 있는 단백질 돌연변이 유발 방법인 CombiSEAL을 설명합니다.

이는 관심 있는 변이체의 돌연변이 유형에 대한 정보를 검색하기 위한 스크리닝 절차의 속도를 높이고 비용을 낮출 것입니다. 우리는 제안된 방법이 신경 재생을 촉진하는 가능성을 더 이해하고 확장하는 데 도움이 될 수 있고 다른 연구 영역에 널리 적용될 수 있기를 바랍니다.

Cistanche 신경 보호 효과의 메커니즘

Cistanche는 여러 메커니즘을 통해 신경 보호 효과가 있는 것으로 나타났습니다.

1. 항염증 효과: Cistanche에는 뇌의 여러 부분에서 염증을 억제하는 것으로 밝혀진 화합물이 포함되어 있어 손상으로부터 뉴런을 보호할 수 있습니다.

2. 항산화 효과: Cistanche에는 강력한 항산화 특성을 가진 화합물이 포함되어 있습니다. 항산화제는 자유 라디칼과 산화 스트레스로 인한 손상으로부터 뉴런을 보호하는 데 도움이 됩니다.

3. 신경 전달 물질의 조절: Cistanche는 세로토닌과 도파민과 같은 특정 신경 전달 물질을 조절하여 뉴런을 보호하고 인지 기능을 향상시키는 것으로 나타났습니다.

4. 신경 영양 인자 자극: Cistanche는 신경 세포의 성장과 생존을 촉진할 수 있는 뇌 유도 신경 영양 인자(BDNF)와 같은 신경 영양 인자의 생산을 자극하는 것으로 나타났습니다.

전반적으로 이러한 메커니즘은 뉴런을 손상으로부터 보호하고 성장과 생존을 촉진하며 인지 기능을 향상시키기 위해 함께 작동합니다.

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