C3 사구체병증에서 보체 활성은 프로퍼딘 표적화 도메인이 있거나 없는 IgG-인자 H 융합 단백질에 의해 조절됩니다

연락하다:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim², Matthew C. Pickering

영국 런던 임페리얼 칼리지 염증 질환 센터; and²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 사구체병증사구체 내 보체 C3의 축적이 특징입니다. 원인에는 보체 대체 경로의 주요 음성 조절자인 인자 H의 이상이 포함되지만 이에 국한되지 않습니다. 인자 H-결핍(Cfh-/-) 마우스는 C3를 발달시킵니다.사구체병증혈장 C3 수치의 감소와 함께. 이 모델을 사용하여 우리는 인자 H 대체 경로 조절 도메인(FH{1}})을 포함하는 두 융합 단백질의 효능을 평가했습니다.

비표적화 마우스 면역글로불린(IgG-FH1-5) 또는 항-마우스 프로페딘 항체(Anti-P-FH1-5)에 연결됩니다. 두 단백질 모두 혈장 C3를 증가시키고 사구체 C3 침착을 동등한 정도로 감소시켰으며, 이는 FH가 혈장 또는 사구체에서 C3 활성화를 변경하는 데 프로페딘 표적화가 필요하지 않음을 시사합니다. IgG-FH{13}} 투여 후 혈장 C3 수치는 시간적으로 인자 B 수치의 변화와 상관관계가 있는 반면 혈장 C5 수치는 혈장 프로페딘 수치의 변화와 상관관계가 있었습니다. 특히, 혈장의 증가

C5 및 프로페딘 수준은 C3 및 인자 B의 증가보다 더 오래 지속되었습니다. Cfh-/- 마우스에서 IgG-FH1-5는 가속화된 혈청 신독성 신염 동안 신장 손상을 감소시켰습니다. 따라서 우리의 데이터는 IgG-FH1-5가 Cfh-/- 마우스에서 순환 대체 경로 활성을 회복하고 사구체 C3 침착을 감소시켰으며 혈장 프로피딘 수준이 인자 H 결핍에서 C5 전환효소 활성의 민감한 마커임을 입증합니다. 면역글로불린 접합 FH{12}} 단백질은 상대적으로 긴 혈장 반감기를 통해 C3에 대한 잠재적 치료법이 될 수 있습니다.사구체병증.

Cistanche는 사구체 병증에 도움이 될 수 있습니다

번역문

C3 사구체병증(C3G)는 사구체 내 보체 C3의 비정상적 축적 및 사구체 손상을 특징으로 하는 신장 질환입니다. 이는 보체 대체 경로의 통제되지 않은 활성화 때문입니다. C3G 마우스 모델에서 항체에 연결된 대체 경로 조절자, 인자 H(FH)의 기능적 도메인으로 구성된 융합 단백질은 보체 조절을 회복하고 사구체 C3를 감소시켰습니다. 비표적화 항체 접합은 비교적 긴 융합 단백질 혈장 반감기를 가져왔고, 이 또는 유사한 접합 방법은 C3G 치료에서 FH 기능을 증가시키는 데 사용될 수 있습니다.

C3 사구체병증(C3G)는 사구체 내 C3의 비정상적인 양을 특징으로 하는 보체 매개성 신장 장애입니다.1 이는 신부전으로 진행될 수 있으며 확실한 치료법이 없습니다.2 C3G는 보체 대체 경로(AP)의 비정상적인 활성화와 관련이 있습니다. AP 활성화는 C3를 절단하는 효소인 C3bBb(C3 전환효소)를 생성합니다. 다른 C3b 분자를 추가한 후 생성된 C3bBbC3b 복합체(C5 전환효소)는 보체 C5를 절단할 수 있습니다. 억제 되지 않은

C3G에서 AP 활성화는 순환하는 C3, C5, 인자 B(FB) 및 프로페딘의 감소와 관련될 수 있습니다. 통제되지 않은 AP 활성화의 원인에는 보체 조절기의 기능 변화 상실 및 보체 활성화제의 기능 변화 증가가 포함됩니다.2 주요 음성 AP 조절기는 인자 H(FH)이며 인간, 돼지 및 마우스의 FH 결핍은 C3G와 관련이 있습니다. 3 C3 신염 인자, AP C3 전환효소를 안정화시키는 항체는 C3G에 자주 존재합니다. 종속 C3 신염 인자).5,6

프로페딘 결핍은 혈장 C3 수치를 개선하지 않았지만 C5 수치는 증가하여 프로페딘이 C5의 활성에는 필요하지만 C3 전환효소에는 필요하지 않음을 시사합니다.8,9

Cfh-/- 마우스에 마우스10 또는 인간 FH11,12를 투여하면 사구체 C3 염색이 감소하고 순환 C3 수준이 증가했습니다. FH(mini-FH 분자)의 조절 도메인과 표적화 도메인만 포함하는 구조도 이 모델에서 효과적입니다.13 다른 접근 방식에는 보체 활성화 부위를 표적으로 하는 단백질이 포함됩니다. 여기에는 TT30,14 보체 수용체 2의 보체 결합 도메인에 연결된 FH(FH{9}})의 보체 조절 도메인을 포함하는 단백질 및 동종이량체 FH 분자,15 보체 결합 도메인을 포함하는 미니 FH 분자가 포함됩니다. 인자 H 관련 단백질 1.

보체 C3 활성화를 억제하는 치료적 유용성은 C3G에서 조사 중이기 때문에,2 사구체 C3 침착의 동역학과 사구체 및 순환 내 AP 활성화와의 관계를 이해하는 것이 중요합니다. 면역 복합체 매개 사구체신염 모델에서 사구체 C3c는 보체 활성화를 방지한 후 24시간 이내에 제거된 반면 사구체 C3d는 몇 주 동안 지속되었습니다. , 반면 사구체 C3d는 변하지 않습니다.11

이 연구에서 우리는 C3G의 Cfh-/- 마우스 모델에서 보체 조절 활성을 가진 2개의 새로운 융합 단백질의 효능을 조사했습니다. 단백질은 생물학적 반감기를 연장하기 위해 마우스 Ig에 접합된 마우스 FH(FH1-5)의 조절 도메인을 포함했습니다. IgG-FH1-5로 명명된 융합 단백질 중 하나는 비표적화 마우스 단일클론 항체에 접합되었습니다. 항-P-FH1-5로 명명된 다른 하나는 마우스 프로페딘에 대한 단일클론 항체에 접합되었습니다. 이것은 프로페딘 침착과 상호작용함으로써 보체 활성화 부위에 이 융합 단백질을 표적화하는 것이 조직 보체 조절을 향상시킬 것이라는 가설을 테스트하기 위해 수행되었습니다. 우리의 데이터는 비표적화(IgG-FH{12}}) 및 프로피딘-표적화(항-P-FH{16}}) 단백질이 Cfh–/– 마우스에서 혈장 및 사구체 C3 조절을 회복했음을 보여줍니다. 시간 경과 연구에 따르면 C3 및 FB 수준의 회복은 순환계의 융합 단백질 수준을 반영했습니다. 대조적으로, 융합 단백질이 순환에서 제거된 후에도 혈장 C5의 증가가 지속되었습니다. 우리는 IgG-FH1-5가 Cfh–/– 마우스에서 가속화된 혈청 신독성 신염 동안 사구체 손상을 개선했음을 보여줍니다.

cistanche는 신장 질환을 치료할 수 있습니다 신장 기능을 개선

결과

융합 단백질의 생성 및 활성의 시험관내 및 생체내 평가 융합 단백질은 마우스 FH(FH{1}})의 처음 5개의 짧은 공통 반복(SCR) 도메인을 항-마우스 프로페딘 항체(항 -P-FH1-5) 또는 비표적화 Ig 도메인이 있는 항체(IgG-FH1- 5, 보충 그림 S1). 단백질의 활성은 AP 특정 용혈 분석을 사용하여 평가되었습니다(그림 1a). 항-P-FH{14}} 및 IgG-FH{16}}는 항-P-FH{20}}에 대해 더 큰 효능으로 용량 의존적 방식으로 용혈을 억제했습니다. Anti-properdin(anti-P)도 용량 의존적으로 용혈을 감소시켰지만, IgG-대조군은 효과가 없었습니다. 단백질을 Cfh–/– 마우스에 등몰 주입한 후 IgG-FH{26}} 단백질은 주사 후 최대 11일까지 검출 가능한 반면 항-P-FH{30}}는 주사 후 4일까지 검출 가능했습니다. 주입(보충 그림 S2). IgG-FH{34}} 및 항-P-FH{37}}가 Cfh–/– 마우스에서 혈장 AP 조절을 회복할 수 있는지 확인하기 위해 먼저 융합 단백질 주입 후 혈장 C3 수준을 측정했습니다(그림 1b). . IgG-FH{41}} 또는 항-P-FH{44}}의 투여는 주사 후 24시간에 혈장 C3를 유의하게 증가시켰고, 그보다 적은 정도로 주사 후 96시간에 증가했습니다(그림 1b). 이 데이터는 IgG-FH1-5와 anti-P-FH{53}} 모두 Cfh–/– 마우스에서 혈장 AP 조절을 일시적으로 회복할 수 있음을 보여주었습니다. 다음으로 우리는 혈장 C3뿐만 아니라 혈장 C5 및 대체 경로 단백질인 FB 및 프로페딘의 변화의 시간 경과를 특성화하여 이러한 변화에 대한 자세한 분석을 수행했습니다. Cfh–/– 마우스에서 IgG-FH1-5 및 anti-P-FH1-5를 투여한 후 순환 C5 및 프로페딘 수준의 증가가 C3 및 FB의 증가보다 더 오래 지속됨

IgG-FH1-5 또는 anti-P-FH1-5( 그림 2). IgG-FH 투여 후{10}} C3, C5, FB 및 프로페딘의 피크 상승은 모두 주사 후 1일째에 발생했습니다. 이러한 변화가 치료 전 수준으로 떨어지는 시간은 달랐습니다. 치료 전 수준으로의 복귀는 FB의 경우 1일과 4일 사이, C3의 경우 7일과 11일 사이, 프로페딘과 C5의 경우 14일과 21일 사이에 발생했습니다(그림 2a, c, e 및 g). 항-P-FH1-5 투여 후 1일에 최고 C3 수준이 발생했지만 4일과 7일 사이에 치료 전 수준으로 떨어졌습니다(그림 2b). 피크 C5 수준은 4일에 발생했으며 7일에서 11일 사이에 전처리 수준으로 돌아갔습니다(그림 2d). FB의 피크 상승은 1일에 발생했으며 1일과 4일 사이에 전처리 수준으로 떨어졌습니다(그림 2f). 예상대로 항-P-FH{44}} 또는 항-P 주사 후 유리 혈장 프로페딘이 고갈되었습니다(그림 2h). 유리 혈장 프로페딘 수치는 항-P-FH 투여 후 최대 7일{50}} 및 항-P 투여 후 최대 14일 동안 낮게 유지되었습니다(그림 2h). 두 융합 단백질 모두 일시적으로 혈장 AP 조절을 회복했지만 C3, FB 및 C5 수준의 개선 기간은 항-P-FH의 경우 더 짧은 혈장에서의 검출 기간을 반영했습니다1-5(보충 그림 S2). . 요약하면, 두 단백질 중 하나를 주입한 후 C3 및 FB 수준의 변화는 C5 및 프로페딘보다 짧았습니다. 이러한 데이터는 혈장 FB가 이 설정에서 C3 전환효소 활성의 민감한 마커인 반면, 프로페딘은 C5 전환효소 활성의 마커임을 시사합니다. 특히, 항-P 주사 후 24시간 및 96시간 및 7일째에 C5가 증가했습니다.

그림 1| (a) 대체 경로 의존적 용혈 분석을 보완합니다. 항체는 60 nM에서 0.5 nM까지 2-배 희석으로 적정되었습니다. IgG-FH1-5, 항-P-FH{10}} 및 항-P 시약은 용량 의존적으로 토끼 적혈구 용혈을 감소시켰습니다. 억제되지 않은 IgG-대조군 단백질이 사용되었습니다. 수평 막대는 평균값을 나타내고 오차 막대는 SD를 나타냅니다. (b) 융합 단백질 주입 후 Cfh-/- 마우스에서 혈장 보체 C3. 혈장 C3는 IgG-FH{19}}(빨간색 삼각형, n=5) Anti-P–FH1-5(보라색 삼각형, n=6), Anti -P(녹색 점, n=5) 및 IgG-제어(파란색 점, n=5). 가로 막대는 평균 값을 나타내고 수염은 SD를 나타냅니다. ***P # 0.001 대 전처리 값이며 Bonferroni 다중 비교 테스트를 사용한 2-방법 ANOVA에서 파생됩니다. FH, 인자 H; 피,프로퍼딘.

(그림 2d). 보고된 바와 같이,8,9는 C5 전환효소가 Cfh-/- 마우스에서 프로페딘에 의존적임을 나타냅니다.

IgG-FH1-5 및 항-P-FH1-5는 사구체 C3c를 감소시켰지만 Cfh–/– 마우스에서 C3d 염색을 변경하지 않았습니다.

다음으로 우리는 사구체 C3b/iC3b/C3c, C3d, 프로페딘 및 FH 관련(FHR) 단백질에 대한 IgG-FH1-5 및 항-P-FH1-5의 영향을 평가했습니다. IgG-FH{12}} 주입 후 96시간에 사구체 C3b/iC3b/C3c 염색이 감소했지만 사구체 C3d(그림 3a)와 FHR 염색(그림 3b)은 감소하지 않았습니다. 사구체 C3b/iC3b/C3c는 IgG-대조군 또는 항-P에서 변하지 않은 채로 유지되었습니다. 처리되지 않은 Cfh-/- 마우스9에서 사구체 프로페딘 염색의 비정상적인 선형 패턴은 IgG 제어 후 96시간 동안 유지되었습니다. 항-P 또는 IgG-FH1-5를 주사한 Cfh–/– 마우스에서 사구체 프로페딘 수준은 96시간에 거의 감지할 수 없었습니다(그림 3b). 예기치 않게 항-P-FH1-5 주사는 항-프로퍼딘, 항-FH/FHR 및 항-IgG 항체를 사용하여 과립형 사구체 염색 패턴을 생성했습니다(그림 3b). 이 발견은 항-P-FH{40}} 단백질이 사구체에 침착되었음을 시사했습니다. 항-P-FH1-5 단백질을 야생형 마우스에 주입하면 96시간에 항-프로퍼딘, 항-FH/FHR 및 항-IgG 항체로 사구체 염색이 나타났습니다(보충 그림 S3). 시약은 정상적인 사구체와 상호 작용합니다. 그러나 우리는 항-P-FH{52}} 단백질이 Cfh–/– 생쥐의 기존 사구체 프로페딘과 상호작용할 수도 있다고 추측했습니다. 사구체 프로퍼딘을 제거하기 위해 항-P로 전처리된 Cfh-/- 마우스에 시약을 주입했을 때, 항-프로퍼딘, 항-FH/FHR 및 항-IgG 항체를 사용하는 과립 염색 패턴이 감소했습니다. 보충 그림 S4). 이러한 관찰은 Cfh–/– 마우스에서 항-P-FH{61}} 단백질의 사구체 상호작용이 부분적으로 사구체 프로페딘에 의존함을 나타냅니다.

IgG-FH1-5는 Cfh–/– 마우스에서 가속화된 혈청 신독성 신염 동안 신장 손상을 개선했습니다.

C3G 환자의 경우, 동시 감염의 맥락에서 급성 신장 손상이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, FHR5 신병증에서 신기능 소실은 synpharyngitic macroscopic hematuria의 에피소드와 관련이 있습니다. 이를 모델링하기 위해 우리는 면역 복합체인 가속 혈청 신독성 신염을 유도했습니다.

그림 2| IgG-FH1-5 및 항-P-FH1-5를 주입한 Cfh–/– 마우스의 혈장 보체 프로필 시간 경과. 혈장 C3(a,b), C5(c,d), FB(e,f) 및 프로페딘(P; g,h)은 실험 시작부터 IgG-FH의 단일 주입 후 27일까지{{1{{21 }}}}(a,c,e,g; 빨간색 삼각형, n=5) 또는 anti-P-FH1-5(b,d,f,h, 보라색 삼각형, n=6). 대조군에는 항-P(녹색 점, n=5) 및 이소타입 일치 단클론 항체(IgG-대조군, 파란색 점, n=5)가 포함되었습니다. 가로 막대는 평균 값을 나타내고 수염은 SD를 나타냅니다. *P # 0.05, **P # 0.01, ***P # 0.001 대 전처리 값이며 Bonferroni 다중 비교 테스트를 사용한 분산의 2-방식 분석에서 파생되었습니다. FB, 인자 B; FH, 요인 H.

Cfh-/- 마우스에서 보체 및 Fc 수용체 매개 경로를 포함하는 사구체 신염 모델, 18,19. 우리는 이전에 Cfh–/– 마우스가 이 설정에서 신장 손상에 과민하다는 것을 보여주었고 FH1-5 단백질이 AP 조절을 강화함으로써 이 모델에서 보체 매개 신장 손상을 개선할 수 있다고 가정했습니다. 데이터에 따르면 항-P-FH1-5 단백질이 정상 사구체에 침착되었음을 나타내므로 가속 혈청 신독성 신염 동안 IgG-FH{11}}를 사용했습니다. 양 신독성 혈청을 주사하기 24시간 전에 마우스에 IgG 대조군(n=7) 또는 IgG-FH{16}}(n=8)를 복강내 주사했습니다. 실험 프로토콜은 그림 4a에 나와 있습니다. 양 신독성 혈청을 투여한지 6일 후에 마우스를 도태시켰다. 사구체 병리의 3가지 조직학적 측정값(심각도 점수, 총 세포 수, 대식세포 수)은 모두 IgG-FH{22}} 그룹에서 유의하게 낮았습니다(그림 4b). 세뇨관 간질 손상도 IgG-FH{25}} 그룹에서 더 낮았습니다(그림 4b). 혈청 요소는

그림 3| IgG-FH1-5 또는 항-P-FH1-5 주입 후 96시간 후에 Cfh–/– 마우스에서 사구체 보체 면역염색. (a) 4개의 실험군에서 사구체 C3b/iC3b/C3c 및 C3d의 정량화와 함께 대표적인 이미지: IgG-FH{13}}(빨간색 삼각형, n=5), anti-P-FH{17}} (보라색 삼각형, n=6), anti-P(녹색 점, n=5) 및 IgG-control(파란색 점, n=5). 그림 1에 표시된 컬러 시간의 PlasmaC3 수준. (b) 데이터 포인트는 중앙값을 나타내고 수염은 사분위수 범위를 나타냅니다. Dunn 다중 비교 테스트와 함께 Kruskal-Wallis 테스트에서 파생된 P 값. (b) 4개의 실험 그룹에서 사구체 IgG, FHR 및 염색의 대표 이미지. Bar=100 mm.AFU, 임의 형광 단위; FH, 인자 H; 피,프로퍼딘. 이 이미지의 보기를 최적화하려면 이 문서의 온라인 버전을 참조하십시오.www.kidney-international.org.

IgG 대조군, 그러나 혈청 알부민 및 소변 알부민 대 크레아티닌 비율의 변화는 다르지 않았습니다(그림 4b). 예상대로 사구체 C3b/iC3b/C3c는 IgG-FH1-5 그룹에서 유의하게 감소했지만(그림 4b), 사구체 마우스 IgG(그림 4b)와 양 IgG(데이터는 표시되지 않음)는 그룹 간에 차이가 없었습니다. .

그림 4| IgG-FH1-5로 전처리하면 Cfh–/– 마우스에서 가속화된 혈청 신독성 신염 동안 신장 손상이 개선되었습니다. (a) 가속 혈청 신독성 신염 프로토콜의 개략도. 양 IgG로 사전 면역화된 마우스는 양 신독성 혈청을 투여하기 24시간 전에 IgG-FH1-5(처리군, n=8) 또는 IgG-대조군(대조군, n=7)을 받았습니다. (b) IgG-FH1-5(치료, 빨간색 삼각형, n=8) 또는 IgG-대조군(대조군, 파란색 원, n)으로 처리된 마우스에서 가속 혈청 신독성 신염 유도 6일 후 신장 기능 및 조직학 ¼ 7). 가로 막대는 중앙값을 나타내고 수염은 사분위수 범위를 나타냅니다. *P # 0.{18}}5, **P # 0.01, ***P # 0.001 대 대조군이며 Mann-Whitney 테스트에서 파생되었습니다. FH, 인자 H; 피,프로퍼딘.

논의

IgG-FH1-5 및 항-P-FH1-5 모두 Cfh–/– 마우스에서 C3, FB 및 C5 수준을 정상화했습니다. 이 발견은 마우스 FH의 보체 조절 도메인이 SCR 도메인 1에서 5(C3b 결합 부위 및 C3b의 인자 I 매개 절단에 대한 보조인자 활성) 내에 위치한다는 사실과 일치합니다.20 표면 인식 도메인, 헤파린 및 내피 세포에 대한 결합에 영향을 미치고 두 번째 C3b 결합 부위를 포함하는 SCR 도메인 18

20(FH{1}}) 따라서 융합 단백질에는 존재하지 않습니다.20 그럼에도 불구하고 두 단백질 모두 사구체 iC3b/C3b/C3c를 감소시켰으며, 이는 이 설정에서 FH{6}}가 필요하지 않음을 나타냅니다. 이 발견은 SCR 도메인 1에서 15(Cfh–/– .FHD16-20)로 구성된 돌연변이 FH 단백질을 발현하는 Cfh–/– 마우스가 비정상적인 사구체 C3 침착을 일으키지 않았음을 보여주는 이전 데이터와 일치합니다.21,22 그러나 Cfh–/–.FH D{13}} 동물은 신장 내피를 따라 C3 활성화를 조절할 수 없었고 혈전성 미세혈관병증이 발생했습니다. FH{15}} 도메인을 표적으로 하는 표면의 부족으로 인해 FH 결핍에서 FH{16}}를 포함하는 융합 단백질의 투여는 혈전성 미세혈관병증에 대한 감수성을 초래할 수 있습니다. 융합 단백질의 이량체 구조 하에서 C3b 결합에 대한 증가된 결합력이 FH{18}} 도메인을 표적으로 하는 표면의 부재를 보완하기에 충분할 수도 있습니다. 그러나 C3b의 표면 인식은 또한 FH.23 A Streptococcus pneumoniae FH 결합 단백질(SCR 도메인 9에 결합하는 PspCN)의 구조적 변화에 의해 영향을 받고, FH 구조적 변화를 촉발하며, FH-PspCN 복합체는 C3b 결합이 증가하고 강화된 붕괴 촉진 활동. FH20 C3d 결합 부위는 FH에서 노출되지 않지만 FH-PspCN 복합체에서 노출됩니다. 이것은 FH{30}}가 표면 C3d와 상호작용하지만 FH는 그렇지 않은 이유를 설명할 수 있습니다. 24,25 우리는 우리 에이전트가 구조적 변화를 통해 유동상 및 표면 C3b와 효율적으로 상호작용할 수 있다고 추측합니다. 특히, IgG-FH{37}} 및 항-P-FH{40}}는 AP 의존적 용혈 분석에서 적혈구를 용해로부터 보호했습니다.

어떤 융합 단백질도 사구체 C3d 염색을 감소시키지 않았는데, 이는 아마도 사구체 C3d의 지속적인 특성 때문일 것입니다. 실험적 면역복합 신염에서 사구체 C3c는 보체 활성화가 중단된 후 24시간 이내에 해결되지만 C3d는 몇 주 동안 지속됩니다. 또한, 사구체 C3d는 루푸스 신염에서 지속됩니다.26 이는 사구체 표면과의 공유 상호작용을 반영하는 것 같습니다. Cfh–/– 마우스에 인간 FH를 반복적으로 주사하면 10일 동안 사구체 C3d가 감소하는 것으로 나타났습니다.11 이 모델에서 IgG-FH를 반복적으로 투여하면{13}} 사구체 C3d가 감소할 수 있습니다. 사구체 FHR 염색에서도 변화가 없었다. 마우스 FHR 단백질의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없지만 C3b27,28 및 C3d와 상호작용할 수 있습니다.27 사실, C3d에 대한 FHR-A와 FHR-B의 겉보기 친화력은 FH.27보다 더 강력합니다. 우리는 사구체 FHR 단백질이 C3d가 제거되었을 때에만 사구체에서 제거될 가능성이 있다고 추측합니다. 이러한 맥락에서, 인간 C3G에서 인자 H 관련 단백질 5가 사구체 C3d와 연관된다는 점은 주목할 만합니다.29

항-P-FH1-5 단백질은 이 융합 단백질의 항-프로퍼딘 부분이 단일 주사 후 8일 동안 AP 활성(프로퍼딘 고갈으로 인해)을 차단할 수 있기 때문에 예상대로 유리 혈장 프로퍼딘 수준을 고갈시켰습니다.30 그러나, 우리의 데이터는 혈장 C3 수치를 증가시키고 사구체 C3b/iC3b/C3c 염색을 감소시키는 FH{6}}의 효능이 2개의 융합 단백질 간에 유사하다는 것을 보여주었습니다(즉, 프로페딘 표적화와 무관함). 또한 anti-P 또는 IgG-FH를 투여한 후 비정상적인 사구체 프로페딘 염색이 유의하게 감소했습니다{14}}. 분명히, C3d 및 FHR 단백질과 대조적으로, 사구체 프로페딘은 C3 조절이 회복된 후에 쉽게 제거됩니다. 사구체 프로피딘은 항-P-FH{19}} 단백질 투여 후 패턴이 변경되었지만 Cfh–/– 및 야생형 사구체 모두에서 이 융합 단백질의 침착을 감지한 관찰로 인해 이는 복잡해졌습니다. 이것은 부분적으로 사구체 프로피딘과의 상호작용 때문이었지만, 야생형 사구체의 침착은 이것이 부분적으로 사구체 보체에 완전히 독립적이고 융합 단백질의 물리화학적 특성과 관련되었을 가능성이 있음을 나타냅니다.

우리의 운동 데이터는 융합 단백질 주입 후 Cfh-/- 마우스에서 C3의 증가를 수반하는 FB, C5 및 프로페딘의 시간적 변화에 관한 새로운 발견을 입증했습니다. FB 수치는 주사 후 빠르게 상승했습니다.

C5와 프로페딘 수치가 모두 상승한 상태로 유지되었을 때 기준선 수준으로 돌아갔습니다. Cfh–/– 마우스의 프로퍼딘 수준은 기준선에서 감소하고 IgG-FH 주사 후 정상 수준(20mg/ml30)으로 증가했으며{4}} 최소 14일 동안 이 수준을 유지했습니다. 혈장 C5 수준의 상승에 대해서도 유사한 시간 경과가 관찰되었습니다. 놀랍게도, IgG-FH1-5는 11일째에 대부분 순환에 없었으며, 이는 Cfh–/- 마우스에서 C5 전환효소의 형성이 C3 전환효소의 형성보다 느리다는 것을 나타냅니다(C3 수치가 7일과 11일). 혈장 C5는 항-P 치료 후 증가했으며 항-P-FH{19}} 단백질로 더 증가했습니다. 따라서 프로페딘 표적화와 FH{20}}의 효과는 모두 C5 수준 증가에 기여했으며 C5 전환효소가 Cfh–/– 마우스에서 부분적으로 프로페딘 의존적임을 나타냅니다. 이 발견은 FH와 프로페딘의 결핍이 결합된 마우스에서 C5 조절 장애의 개선과 일치합니다. {30}}.31,32 우리 데이터는 프로페딘 수준과 C5 전환효소 활성 사이의 긴밀한 연관성을 지지하고 진행 중인 사구체 C5 활성화의 바이오마커로서 프로페딘 수준의 사용을 뒷받침합니다.

특히, IgG-FH{1}} 단백질은 단일 주사 후 최대 11일까지 순환계에서 여전히 검출 가능했습니다. 이것은 24시간 이내에 순환에서 제거된 비접합 마우스 FH{4}} 단백질에 대해 우리가 이전에 보고한 것보다 훨씬 더 깁니다.14 이 발견은 IgG-FH의 혈장 반감기가 더 길다는 것을 나타냅니다1-5 {9}} 단백질은 항체 접합에서 파생됩니다. IgG-FH{12}} 단백질의 혈장 반감기는 전장 FH에 대해 이전에 관찰된 것보다 더 길었습니다.10,11 예를 들어 인간 FH는 단일 주사 후 96시간이 지나면 순환계에서 제거되었습니다. Cfh–/– 마우스에서.11 보체 조절에서 IgG-FH{19}} 단백질의 효능을 입증하는 데이터와 결합하여, 약동학 프로필을 연장하기 위한 FH{20}} 단백질의 접합이 잠재적인 치료 효과가 있다고 생각합니다. C3G의 유틸리티.

요약하면, 우리는 표면 인식 도메인이 부족함에도 불구하고 FH{0}} 융합 단백질이 사구체 C3 활성화를 감소시키고 FH 결핍에서 혈장 보체 조절을 회복시키는 데 효과적임을 보여줍니다. FH1-5 도메인을 anti-properdin에 접합하는 데에는 뚜렷한 이점이 없었고, IgG-FH1-5 단백질은 실험적 신염에서 신장 손상을 감소시켰습니다. 치료용 FH의 대규모 제제 생산의 어려움과 달리 항체 기반 치료제의 대규모 생산은 잘 확립되어 있어 IgG-FH{10}}를 C3G에 대한 매력적인 잠재적 치료제로 만듭니다.

행동 양식

융합 단백질

IgG-FH1-5. 처음 5개의 마우스 FH SCR 도메인(mFH1-5)이 연결됨

비표적화 IgG1 마우스 Ig(마우스 단일클론 항체에 대해 발생하는 항-이디오타입 항체).

안티 P-FH1-5. 마우스 항프로퍼딘 항체(항-P)에 연결된 뮤린 FH1-5,30 펜실베니아 대학교 W. Song이 Alexion에 제공).

통제 수단. 대조군은 이소타입 일치 비표적화 마우스 Ig(IgG-대조군) 및 마우스 항프로퍼딘(항-P)이었습니다(보충 그림 S1). 단백질은 pVEK 벡터와 Expi293 세포(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 생성되었으며, 단백질 A(MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA)를 사용하여 정제되었습니다.

AP 특정 용혈 분석

6{1}}nM에서 0.5nM으로 적정된 20% 정상 마우스 혈청을 37C에서 30분 동안 토끼 적혈구(1.{4}} cells/ml)와 함께 배양했습니다. 헴 방출은 분광광도계로 정량화되었습니다(광학 밀도 415nm). 100% 용해는 억제제가 없는 혈청이었습니다.

플라즈마 FB 및 FH

에틸렌디아민 테트라아세트산(Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Germany)을 포함하는 튜브에 수집된 혈액을 원심분리한 후 혈장을 얻었다. 단백질은 모세관 전기영동 면역분석법(WES, ProteinSimple, San Jose, CA)에 의해 측정되었습니다. 사용된 항체는 폴리클로날 항-마우스 FH 항체(Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) 및 항-마우스 FB 항체(Abcam, Cambridge, UK); WES anti-rabbit 검출 모듈(ProteinSimple, San Jose, CA)을 사용하였다. 화학발광 신호를 Compass for SW 소프트웨어(ProteinSimple, 버전 5.{6}}.1)로 분석하고 피크 면적으로 정량화하고 분석 대조군으로 정규화했습니다.

쥐

모든 마우스는 특정 병원균이 없는 조건에 수용되었습니다. 절차는 기관 지침에 따라 수행되었으며 영국 내무부의 승인을 받았습니다. C57BL/6 야생형 마우스는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입했으며 Cfh–/– 마우스는 이전에 설명한 대로 생성되었습니다. 등몰 용량의 단백질을 복강내 주사(항프로퍼딘 및 IgG 대조군의 경우 1mg, IgG-FH{11}} 및 항-P-FH{14}}의 경우 1.4mg)를 통해 투여했습니다. 가속화된 혈청 신독성 신염은 양 IgG로 사전 면역화된 마우스에 양 신독성 혈청을 정맥내 주사하여 유도되었습니다. 융합 단백질의 투여는 양 신독성 혈청 유도 24시간 전에 수행되었습니다(그림 4a).

C3, C5 및 유리 프로페르딘 혈장 C3은 효소 결합 면역흡착 분석법으로 측정되었습니다.14 혈장 "유리" 프로퍼딘 및 C5 수준은 항생물질과 함께 전기화학발광 면역분석법(Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD)을 사용하여 측정되었습니다. - 고결합 MSD 플레이트에 코팅된 프로페딘 또는 맞춤형 항-뮤린 C5. 결합된 "유리" 프로퍼딘 및 C5는 스트렙타비딘-SULFO(MSD, Meso Scale Diagnostics)와 결합된 항프로퍼딘(W. Song) 또는 비오틴화된 단일클론 항-C5(Alexion)로 검출되었습니다. 화학 발광 신호는 SECTOR S 6000 이미저(MSD, Meso Scale Diagnostics)를 사용하여 획득하고 MSD Discovery Workbench 소프트웨어(Meso Scale

진단, 버전 4.0.12.1). 재조합 뮤린 프로페딘 및 C5를 표준으로 사용하였다.

신장 기능 및 조직학

Hema-Combistix(Bayer, Reading, UK)를 사용하여 혈뇨 및 단백뇨를 평가했습니다. 이전에 설명한 대로 혈장 요소를 측정하고 신장 조직을 처리했습니다. 9 Creatinine Companion Protocol assay(#1{7}}12; Excell, Philadelphia, PA)를 사용하여 소변 샘플에서 소변 크레아티닌을 측정했습니다. 혈장 알부민은 효소 결합 면역흡착 분석법(#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)에 의해 측정되었습니다. 과요오드산-Schiff 염색 신장 절편을 맹검 방식으로 평가하고 사구체 및 세뇨관 간질 손상의 중증도에 따라 순위를 매겼습니다(0[없음], 1[경증], 2[중등도]). 평균 사구체 세포 수를 결정하기 위해 섹션당 10개의 사구체를 평가했습니다. 면역형광 염색은 DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA)가 포함된 Vectashield 배지를 사용하여 장착된 5-mm cryosection에서 수행되었습니다. 사용된 항체는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 다클론 염소 항-마우스 C3b/C3c/iC3b(1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Fig-chain-specific FITC-conjugated polyclonal goat anti-mouse IgG (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); FITC-컨쥬게이션된 모노클로날 마우스 항염소/양 IgG(1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); 또는 FITC-컨쥬게이션된 염소 항-인간 프로피딘(1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immuno logic Laboratories, Copenhagen, Denmark).9 Biotinylated 염소 항-마우스 C3d(1:10; # BAF2655; R&D Systems) , Minneapolis, MN) streptavidin AF488 이차 항체(1:200; #S{49}}; Thermo Fisher Scientific)와 함께 비오틴 차단 섹션(Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA)에 사용되었습니다. FH는 염소 항인간 FH(1:1000; #A312; Quidel, San Diego)를 사용하여 정제된 쥐 항마우스 CD16/CD 차단 섹션(1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에서 시각화되었습니다 , CA) 및 단일클론 항염소 IgG-FITC 2차 항체(1:100; 클론 GT{63}}; F4891; Sigma-Aldrich). 사구체 대식세포는 FITC 결합 쥐 항마우스 CD68(FA{69}} 클론 GTX43518; GeneTex, Irvine, CA)을 사용하여 식별되었습니다. 정량적 면역형광 분석은 Leica DFC700T 디지털 카메라(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) 및 Image-Pro Plus 소프트웨어(Media Cybernetics, Rockville, MD, 버전 7)와 결합된 Leica DM4B 광학 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 섹션당 10개의 사구체가 검사되었고 평균 강도는 임의의 형광 과학 단위로 표현되었습니다.

통계 분석

GraphPad Prism, 버전 8.{1}}(GraphPad, San Diego, CA)를 통계 분석에 사용했습니다. 시간 경과 분석에는 Bonferroni 다중 비교 테스트(요인은 시간 및 치료임)를 사용한 반복 측정{3}} 분산 분석이 사용되었습니다. 여러 그룹을 비교할 때는 Kruskal-Wallis with Dunn 다중 비교 검정을 사용하고 2개 그룹에 대해서는 Mann-Whitney 검정을 사용했습니다.

폭로

MCP는 Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope 및 Achillion Pharmaceuticals로부터 컨설팅 비용을 받았습니다. HTC는 Alexion, Novartis, Aurinia 및 Achillion Pharmaceuticals로부터 컨설팅 비용을 받았습니다. YZ, YW, KKJ 및 SK-K는 Alexion Pharmaceuticals의 직원입니다. SK는 Alexion Pharmaceuticals의 전 직원이며 현재 Gemini Pharmaceuticals에 고용되어 있습니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않았습니다.

감사의 말

MCP는 임상 과학의 Wellcome Trust 선임 펠로우(보조금 참조 212252/Z/18/Z)이며 ACG 및 DPL은 이 펠로우십의 지원을 받습니다. YZ, SK, YW, KKJ 및 SK-K는 Alexion Pharmaceuticals에서 자금을 지원했습니다.

보충 자료

보충 파일(PDF)

그림 S1. 이 연구에 사용된 융합 단백질.IgG-FH1-5는 비표적 마우스 Ig에 연결된 마우스 인자 H(FH1-5)의 처음 5개 도메인을 포함합니다. 항-P-FH1-5는 중화 마우스 항-마우스 프로페딘 항체(항-P, Miwa et al.30 참조)에 연결된 mFH1-5로 구성됩니다. 대조군 단백질에는 이소타입 일치 비표적화 마우스 Ig(IgG-대조군) 및 중화 마우스 항-마우스 프로페딘 항체(Anti-P)가 포함되었습니다. 그림 S2. (A) IgG-FH{22}} 또는 (B) Anti-P-FH1-5를 주사한 FH 결핍 마우스의 혈장 샘플에서 FH{19}}를 검출하기 위한 WES 오점 분석. 94-kDaIgG-FH1-5(HC-FH{29}}) 단백질은 IgG-FH1-5 주입 후 최대 11일, anti-P-FH1-5 단백질(빨간색 상자) 주입 후 최대 4일까지 검출 가능합니다. ). 대조군에는 전장 인자 H 단백질이 검출되는 야생형 마우스(FH, 블랙 박스, 레인 C1) 및 FH가 명백하지 않은 주사되지 않은 FH 결핍 마우스(블랙 박스, 레인 C2)의 혈장이 포함됩니다. 예상대로 FHnorFH1-5는 Anti-P 또는 IgG-대조군이 주사된 마우스의 혈장 샘플에서 검출되지 않습니다.

그림 S3. 야생형 마우스에 IgG-control 또는 anti-P-FH1-5를 주사한 지 96시간 후 사구체 보체 면역염색. 대표적인 사구체 이미지가 표시됩니다(막대=100mm).

그림 S4. FH 결핍 마우스의 사구체에서 항-P-FH1-5 침착에 대한 프로피딘의 역할. Cfh–/– 마우스에 IgG-대조군 또는 항-P(치료제 1)를 주사한 후 24-시간 후에 IgG-대조군 또는 항-P-FH1-5(치료제 2)를 주입했습니다. 동물을 처리 1 후 120시간에 도태하고 IgG, 프로페딘 및 FH/FHR에 대한 사구체 염색을 평가하였다. 대표 이미지가 표시됩니다. 항-P 주사는 프로페딘(1행, 2열)을 현저하게 감소시켰지만 FH/FHR(변경되지 않은 채로 남아 있음) 또는 IgG(존재하지 않음) 염색을 감소시키지 않았습니다. IgG 대조군{20}시간 후에 항-P-FH를 투여하면 항-P-FH 주사 후 볼 수 있는 항-IgG, 항-FH/FHR 및 항-P 항체로 과립 염색이 나타납니다. 1-5 단독(그림 3b 참조). 항-P-FH{31}} 주사가 순환(그림 1h 참조)과 사구체(그림 3b 참조)를 모두 고갈시키는 항-P 주사가 선행되었을 때 이 과립 염색이 감소했습니다. 항-IgG에 의한 사구체 염색은 항-P-FH{38}}(3행, 3열 및 4열)를 주사한 마우스에서만 분명했으며 항-P-FH를 투여받은 마우스에서는 현저히 낮았습니다{44}} 안티 P가 선행됩니다. 우리는 Cfh–/– 생쥐의 사구체에 항-P-FH{48}} 침착이 부분적으로 프로페딘에 의존한다고 결론지었습니다. 가로 막대는 중앙값을 나타내고 수염은 사분위수 범위를 나타냅니다. P-값은 Mann-Whitney 검정에서 파생되었습니다. 바 ¼ 100mm.

참조

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH, et al C 사구체병증∶ 새로운 dassification. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripathy - 희귀 보체 기반 실제 질병 이해. 냇 레이네프롤.201915129-143

3. Pickering MC, Cook HT. 보체 인자 H에 대한 번역 미니 리뷰 시리즈: 보체 인자 H와 관련된 신장 질환, 인간과 동물의 새로운 통찰력. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, C3nechritic factor(C3NeF)∶액상 및 세포 결합 대체 경로 전환효소의 안정화. J Immunol 1976;116:1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, C3 및 생체 내 및 시험관 내 보체의 말단 경로에 대한 신염 인자의 외 효과. Oin Exp Immunol. 1986;65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. G3 신염 인자(C3NeF): 대체 경로 C3 전환효소의 세포 결합 및 유체 상 안정화의 해리. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J, et al Uncontrolled C3 활성화는 보체 인자 H. Nat Genert.2002:31;{4}}이 결핍된 마우스에서 막증식성 사구체신염을 유발합니다.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, et al. 인자 H 돌연변이와 프로페딘 결핍의 조합은 심각한 C3 사구체신염을 유발합니다. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM, et al. 프로페딘의 손실은 인자 H 결핍으로 인한 C3 사구체병증을 악화시킵니다. J Am Soc Nephrol. 2013;24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, et al. 인자 H는 유체상에서 C3 활성화를 조절함으로써 GBM 결합 iC3b의 제거를 촉진합니다. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F, et al 인간 보체 인자 H를 사용한 치료는 인자 H 결핍 마우스에서 신장 보체 침착을 빠르게 역전시킵니다. 신장 Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll, et al. 보체 장애 치료를 위한 이끼 생성, 글리코실화 최적화 인간 인자 H. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y, et al 확장된 미니 보체 인자 H 분자는 실험적 C3 사구체 병증을 개선합니다. 신장 국제 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA 등 실험적 C3 사구체 병증에서 표적 보체 억제의 효능. J Am Soc Nephrol. 2016;27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR, et al. C3 사구체병증 치료를 위한 조작된 보체 인자 H 구조. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et alL 사구체 C3clocalization은 실험적 사구체신염에서 진행 중인 면역 침착 형성 및 보체 활성화를 나타냅니다. J Pathol입니다. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP, 외 16개 가계에서 91명의 환자의 CFHRS 돌연변이 임상적 특징과 관련된 가족성 C3 사구체 병증. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP, et al 신독성 신염의 병리학 및 보호는 특정 Fc 수용체의 선택적 참여에 의해 결정됩니다. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC 등. 항사구체 기저막에 대한 보호(C3-및 C{4}}결핍 마우스의 GBM 매개 신염. C Exp Immunol. 1997;110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H et al. 마우스와 인간 보체 인자의 표면 인식 및 C3b 결합 특성 비교 H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp 알 EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al 전형적인 용혈성 요독 증후군의 발병은 보체 C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:{5}}에 따라 다릅니다.

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry et al 표면 인식 도메인이 결여된 보체 인자 H에 의해 유발된 자발적 용혈성 요독 증후군. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23허버트 AP. Mike E, Chen ZAet aL 포획된 인자 H의 강화에 의해 매개되는 보체 회피: 보체로부터 자체 표면 보호에 대한 의미.J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et al. 보체 인자 H 관련 단백질의 이량체화는 보체 활성화를 조절합니다. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z, et al. 독특한 삼중 표적 특성을 가진 최소화된 면역 억제제의 합리적 공학. J Immunol. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, et al. 사구체막 공격 복합체는 루푸스 신염에서 진행 중인 C5 활성화의 신뢰할 수 있는 마커가 아닙니다. 신장 국제 2019.95655-665.

27. Antonioli AH White J, Crawford F 등 뮤린 인자 H 관련 단백질에 의한 보체의 대체 경로 조절. J Immunol. 2018;200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, et al. 뮤린 인자 H 관련 단백질 FHR-B는 보체 활성화를 촉진합니다. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ et al 사구체 보체 인자 H 관련 단백질 5(FHR5)는 C3 사구체병증에서 매우 널리 퍼져 있으며 신장 손상과 관련이 있습니다.Kdney Int Ren. 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, et al. 블록킹 프로퍼딘, 대체 경로 및 아나필라톡신 수용체는 부패 촉진 인자 및 CD59 이중 녹아웃 마우스에서 신장 허혈 재관류 손상을 개선합니다. J Immunol. 2013;190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P, et al C3 사구체병증에서 C5 전환효소 조절장애의 바이오마커로서의 혈청 프로페딘 소비. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, et al. 인자 H 돌연변이와 프로페딘 결핍의 조합은 심각한 C3 사구체신염을 유발합니다.JAm Soc Nephrol.2013;{10}}.

32. Zhang Y, Nester OM Martin B.et al C3 사구체병증의 보체 바이오마커 프로파일 정의. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.