수산 산업 잔류 물에서 추출한 코스메슈티컬 잠재력: 정어리 폐기물 및 대구 프레임 1부

추상적인: 어업은 많은 양의 폐기물을 발생시킵니다(어획한 총 물고기 중량의 20–75%(w/w)). 잔류물에서 생물 활성 화합물을 회수하고 화장품에 통합하는 것은 유망한 시장 기회를 나타내며 해당 부문의 지속 가능한 가치 창출에 기여할 수 있습니다. 이 작업에서 정어리(Sardina pilchardus) 폐기물 및 대구(Gadus morhua) 프레임에서 고압 기술(초임계 CO2 및 아임계수)로 얻은 단백질이 풍부한 추출물은 코스메슈티컬 잠재력과 관련하여 특성화되었습니다. 항산화, 항염증 및 항균 활성은 화학적(ORAC assay), 효소적(elastase 및 tyrosinase 억제), 항균 감수성(Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus 및 Cutibacterium acnes) 및 세포 기반(keratinocytes-HaCaT) 분석을 통해 평가되었습니다. . 정어리 추출물이 가장 높은 항균 활성을 나타냈고, 더 높은 추출 온도(250 ◦C)를 사용하고 탈지 단계를 거치지 않은 섹션에서 가장 낮은 최소 억제 농도(MIC) 값(1.17; 4.6; {{24} } K. pneumoniae, S. aureus 및 C. acnes에 대해 각각 .59 mg/mL). 낮은 온도(90ºC)에서 추출한 대구 샘플은 가장 효과적인 항염증제였습니다(농도 0.75mg/mL는 IL-8 및 IL-6 수준을 각각 58% 및 47% 감소시켰습니다. , 양성 대조군에 비해). 추출물의 트레오닌, 발린, 류신, 아르기닌 및 총 단백질 함량은 보고된 생체 활성과 높은 상관관계가 있는 것으로 강조되었습니다(R2 0.7 이상). 이러한 결과는 수산 산업 폐기물에서 추출한 추출물이 생리활성 활성을 가진 코스메슈티컬 제품에 잠재적으로 적용될 수 있음을 뒷받침합니다.

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA의 함량을 감소시키며 정자 막 기능에 대한 특정 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력이 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼로 인한 콜라겐 분해를 방지하는 능력이 있으며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.

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키워드: 어류폐기물 가치화; 항산화활성; 항염증 활성; 항균활성; 노화 방지; 항과다색소침착; 화장품

1. 소개

혁신, 특히 활성 성분에 대한 끊임없는 탐색으로 화장품 산업은 성장하고 있으며 천연 화합물을 향해 나아가는 석유 유래 성분을 대체하려는 의도를 보여주었습니다[1]. 천연 활성 성분의 항산화 특성은 산화 스트레스와 노화로 인한 여러 피부 문제를 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다[2,3]. 피부 노화는 내인성(염증 또는 텔로미어 단축 등) 및 외인성(환경) 요인 모두에 의해 유발될 수 있습니다[4]. 피부 노화는 성숙한 콜라겐의 손실과 장벽 기능을 손상시키는 세포외 기질(ECM)의 변화로 이어져 건조한 외관과 외부 공격자에 대한 민감성을 초래하여 피부 질환의 위험을 증가시킵니다[5]. 이 과정은 엘라스타제, 매트릭스 메탈로프로티나제(MMP) 및 ECM 분해를 유도할 수 있는 히알루로니다제[6]와 같은 여러 효소에 의해 가속화되거나 정상적인 세포 기능을 손상시킬 수 있는 과도한 반응성 산소 종(ROS)의 축적에 의해 가속화될 수 있습니다. [7]. UV 방사선에 대한 노출과 같은 환경적 요인은 본질적인 노화와 동일한 분자 및 세포 반응을 유도하지만 증폭된 효과를 갖는 다량의 ROS 생성을 유도합니다. 중요한 것은 ROS가 피부 노화 또는 피부 색소 침착 과정과 관련된 효소의 활성을 강화할 수 있으므로[8,9], 따라서 항산화제의 존재는 화장품 분야에서 중요한 역할을 합니다.

2018년 FAO는 세계 어류 소비량이 피타당 20.5kg으로 추산했으며[10], 이로 인해 대부분 껍질과 뼈와 같은 많은 부산물이 발생했습니다. 생성된 잔류물은 전체 어획량의 20-75%(w/w)에 해당하며 잠재적으로 환경 문제를 일으킬 수 있습니다[11,12]. 그러나 이러한 잔류물에는 여전히 상당한 양의 지질, 단백질 및 미네랄이 포함되어 있으므로 적절하게 평가되어야 합니다. 최근 수산업에서 발생하는 폐기물 추출물은 항고혈압, 항산화, 항균, 신경보호, 항고혈당, 노화방지 및 항염증과 같은 활성 특성을 나타냈습니다[13–19]. 대서양 대구(Gadus rhea)와 정어리(Sardina pilchardus)는 포르투갈에서 가장 많이 소비되는 어류 중 하나이며 그 잔류물에서 파생된 기관은 항산화, 항증식 또는 항염증 활동과 같은 유망한 기능 식품 잠재력을 보여주었습니다[11,20-22]. 그러나 어업 폐기물의 활용 및 가치화는 아직 초기 단계이기 때문에 산업계가 이 폐기물을 화장품 성분을 포함한 고부가가치 시장 바이오제품으로 전환할 수 있는 기회를 탐색할 여지가 충분합니다.

이전 작업에서 우리는 정어리 폐기물 및 대구 프레임에서 유망한 건강상의 이점이 있는 생체 활성 분획을 분리하기 위해 고압 기술(초임계 CO2 및 아임계수)의 사용을 조사했습니다[11,22]. 정어리 폐기물의 경우 초임계 탄소(ScCO2)(지질 분획 제거)를 사용한 첫 번째 단계를 적용한 다음 아임계수(SW)를 사용한 추출 공정을 적용하여 대장암 세포[22]. 아임계수 추출/가수분해 우리는 또한 대구 프레임에서 단백질, 펩타이드 및 아미노산이 풍부한 추출물을 얻기 위해 적용했으며 낮은 처리 온도(90ºC)가 인간 장 상피 세포에서 항염증 가능성이 있는 화합물 추출에 유리함을 보여주었습니다. 모델 [11]. 대구 프레임 추출물에 존재하는 대부분의 단백질은 콜라겐과 콜라겐 조각입니다. 다른 화합물에는 소량의 지질, 회분 및 일부 당이 포함됩니다. 정어리 추출물은 펩타이드와 아미노산이 풍부하고 지질, 회분 및 당도 존재합니다. 어류 유래 단백질 및 펩타이드는 화장품 산업의 중요한 자원이 될 수 있기 때문에, 본 연구는 어류 가공 폐기물 및 부산물에서 유래한 이들 추출물의 화장품 잠재력 평가를 통해 활성 가능성을 추가로 평가하는 것을 목표로 합니다[23]. . 이를 위해 추출된 샘플의 항산화, 항노화, 항과색소침착, 항염증 및 항균 효과를 탐색하기 위해 다양한 화학적, 효소 및 세포 기반 분석법을 적용했습니다. 화장품 잠재력을 가진 주요 생리 활성 성분을 확인하기 위해 상관 관계 연구도 수행되었습니다.

2. 재료 및 방법

2.1. 시약

3,4-디하이드록시-l-페닐알라닌(L-DOPA), 버섯 티로시나제, 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) III형, N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드(AAAPVN), 트리스({ {11}}아미노- 2-하이드록시메틸-프로판-1,3-디올), 2,20 -아조비스(2-메틸프로피온아미딘)디하이드로클로라이드(AAPH) 및 20 ,70 -dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. Calcium-adjusted Mueller Hinton broth (CAMHB)는 BD (Sparks, MD, USA)에서 구입했습니다. Brain-heart infusion (BHI)은 Avantor (Radnor, PA, USA)에서 구입했습니다. AnaeroGen™ Compact 향낭은 Oxoid(Hampshire, UK)에서 구입했습니다. PrestoBlue™, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), FBS(heat-inactivated Fetal Bovine Serum) 및 Penicillin-Streptomycin은 Invitrogen(San Diego, CA, USA)에서 구입했습니다. Human immortalized non-tumorigenic keratinocyte cell line HaCaT는 Cell Line Service (Eppelheim, Germany)에서 구입했습니다. Human IL-8 및 IL-6 Mini TMB ELISA 개발 키트는 Peprotech(영국 런던)에서 구입했습니다. 본 연구에 사용된 다른 모든 시약 및 용매는 분석 등급이었으며 사용 가능한 공급업체에서 구입했습니다.

2.2. 견본

이 작업에 사용된 추출물은 프로세스 최적화에 초점을 맞춘 이전 연구에서 개발된 추출물입니다[11,22]. 간단히 말해서, 대구 프레임은 Pascoal과 Filhos SA(Gafanha da Nazaré, Portugal)에서 공급했으며 물고기 등뼈와 부착된 근육으로 구성되었습니다. 머리, 등뼈 및 내장으로 만든 정어리 폐기물은 Conservas A Poveira SA(포르투갈 Póvoa de Varzim)에서 공급했습니다. 사용된 원료의 대략적인 구성은 이전 작업에서 제시되었습니다[11,22]. 단백질(47wt%)과 회분(39wt%)은 소량의 지질과 탄수화물(각각 2wt% 및 0.3wt%)과 함께 대구 프레임의 주요 구성 요소였습니다. 콜라겐은 대구 프레임의 주요 단백질로 밝혀졌으며, 이 경우 ca. 원래 폐기물의 총 단백질 함량의 65%. 대조적으로 정어리는 기름진 생선이므로 그 폐기물은 대구 프레임보다 지질이 훨씬 풍부합니다. 정어리 폐기물은 지질 함량이 26wt%, 단백질 함량이 52wt%였으며 나머지는 회분(17wt%)과 탄수화물(3wt%)이었다.

이 작업을 위해 선택된 대구 프레임(Cf1, Cf2, Cf3 및 Cf4) 및 정어리 폐기물(S1, S2 및 S3)의 추출물은 이전에 설명한 바와 같이 실험실 규모 장치에서 고압 기술로 얻었습니다[11,22 ,24] 표 1에 요약된 조건을 사용하여. 간략하게, 60g의 갈은 대구 프레임 또는 정어리 폐기물(탈지 또는 비탈지)을 오븐 내부에 놓인 고압 반응기에 넣었다. 물 펌프를 원하는 유속(약 10mL/분)으로 켜고 압력을 100bar로 설정했습니다. 압력이 그 값에 도달하자마자 전기 오븐을 켜고 실험을 시작했습니다. 다양한 추출물을 다양한 온도(90~250ºC)에서 30분 동안 수집했습니다. S1 및 S3 추출물은 SW 추출 전 ScCO2에 의한 정어리 폐기물의 탈지 공정 후에 얻어졌다. 아임계 물 추출 실험이 반복되었습니다. 각각의 추출된 샘플에 대해 25 mL를 3회 취하여 동결건조하고 칭량하여 상응하는 추출 수율을 계산하였다. 분석 데이터(단백질 함량)는 3중의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현됩니다. 단백질 함량, 아미노산 프로필, 주요 미네랄 화합물 또는 독성 및 중금속 측면에서 이러한 추출물의 특성화에 관한 정보는 이전 연구[11,22]에 설명되어 있습니다.

Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 및 S2의 원액을 Milli-Q H2O에서 100 mg/mL 농도로 준비했습니다. 다른 샘플, 즉 S1 및 S3은 물에 대한 용해도가 낮기 때문에 DMSO(각각 300 및 550 mg/mL)에 용해되었습니다. 샘플을 냉동하고 추가 사용까지 -20 ºC에서 보관했습니다. 세포 분석을 위해 샘플은 사전에 오토클레이브(Tuttnauer 3870 el, Breda, Netherlands)에서 열(121oC, 15분)로 멸균되었습니다.

2.3. 산소 라디칼 흡수능(ORAC) 분석

ORAC assay는 Huang 등이 개발한 방법에 따라 peroxyl 라디칼(ROO•)에 대한 샘플의 항산화 능력을 평가하기 위해 수행되었습니다. [25], 이전에 보고된 [26]과 같이 약간의 조정이 있습니다. 간단히 말해서 검은색 96-웰 마이크로플레이트에서 150 μL 디소듐 플루오레세인(0.3 μM)을 25 μL의 샘플 희석액에 첨가하고 37 ºC에서 10분 동안 배양했습니다. 그 후, 25 μL의 2,20 - Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH, 153 mM) 및 형광(Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20)을 첨가하여 반응을 개시하였다. nm)는 FLx800 형광 마이크로플레이트 판독기(FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)에서 37°C에서 40분 동안 측정되었습니다. 5, 10, 20, 30 및 40 μM의 (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid(Trolox )). 모든 용액은 인산염 완충 식염수(PBS), 75mM, pH 7.4에서 준비되었습니다. 결과는 추출물 1g당 트롤록스 등가 항산화 능력의 마이크로몰(μmol TEAC/g 추출물)로 표시됩니다.

2.4. 효소 분석

2.4.1. 엘라스타제 억제 분석

이 분석은 Wittenauer 등의 작업을 기반으로 합니다. [27] 이전에 설명한 [6]과 같은 일부 수정 사항이 있습니다. 엘라스타제 억제 활성은 41{ {19}}nm. PPE를 100 mM Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol)-HCl 완충액(pH=8.0) 1 mg/mL의 농도로 만들고 20 ºC에서 분취량으로 보관합니다. 분석 당일, 분취액을 취하여 완충액에 0.03 U/mL의 농도로 희석하고, 10 μL를 Tris-HCl 완충액 100 μL와 함께 마이크로타이터 플레이트의 웰에 로딩하고, 30 μL 각 샘플의. 25°C에서 20분간 사전 배양한 후 기질 AAAPVN(0.55mM) 40μL를 첨가하여 반응을 시작했습니다. BioTek Instruments EPOCH 2 분광 광도계 마이크로플레이트 판독기에서 AAAPVN을 첨가한 후 20분 동안 흡광도를 측정했습니다. 계산은 방정식 (1)에 설명된 대로 수행되었으며, 여기서 A 대조군과 A샘플은 각각 샘플이 없을 때와 있을 때 410nm에서의 흡광도를 나타냅니다. DMSO를 사용하여 샘플 S1 및 S3을 용해시켰기 때문에 이 용매도 테스트하여 이들 샘플에 대한 대조군으로 사용했습니다. 엘라스타제를 억제하는 추출물의 가능성은 농도 의존적 ​​관계를 결정하고 최대 억제 농도의 절반(IC50) 값을 설정하기 위해 농도를 증가시키면서 평가되었으며, 이는 각 샘플의 효소 활성 억제 능력을 50% 정도로 나타냅니다.

모든 결과는 최소 3번의 독립적인 실험에서 얻은 95% 신뢰 구간의 하한 및 상한과 함께 IC50 평균값으로 표현됩니다.

2.4.2. 티로시나제 억제 분석

추출물의 티로시나아제 억제 가능성은 버섯 티로시나아제와 L-DOPA를 기질로 사용하여 분광광도계로 평가되었습니다[28]. 티로시나아제는 L-DOPA를 도파퀴논으로 변환하며, 이는 순차적으로 고리화되어 도파크롬을 형성합니다. 도파크롬 형성은 475 nm에서 흡광도를 측정하여 관찰할 수 있습니다. 기질은 30 U/mL 티로시나제 및 2.5mM L-DOPA의 최종 농도로 샘플 희석물의 존재 하에 효소에 첨가되었습니다. DMSO를 사용하여 샘플 S1 및 S3을 용해시켰기 때문에 이 용매도 테스트하여 이들 샘플에 대한 대조군으로 사용했습니다. 37℃에서 30분 동안 배양한 후 BioTek Instruments EPOCH 2 마이크로플레이트 분광 광도계에서 475nm에서 흡광도를 측정했습니다. 모든 시약은 인산나트륨완충액(SPB; 0.1 M, pH 6.8)에 인산나트륨이염기2수화물과 인산나트륨일염기일수화물을 혼합하여 준비하였으며, 계산은 식(1)과 같이 하였다. 모든 결과는 최소 3번의 독립적인 실험에서 얻은 95% 신뢰 구간의 하한 및 상한과 함께 IC50 평균값으로 표현됩니다.

2.5. 항균 감수성 테스트

항균 활성 분석을 위해 선택된 표적 미생물은 그람 음성균 Klebsiella pneumoniae CECT 8453과 그람 양성균 Staphylococcus aureus ATCC 6538 및 Cutibacterium acnes ATCC 6919T였습니다. K. pneumoniae CECT 8453 및 S. aureus ATCC 6538의 경우, 이전에 Rodrigues et al. [29]. 요컨대, 추출물 원액을 둥근 바닥 마이크로타이터96-웰 플레이트에 분배하고 2-칼슘 조정된 Mueller Hinton broth(CAMHB; BD, Sparks, MD, USA)에 연속적으로 희석하여 솔루션의 농도 범위. 식염수에서 균질한 현탁액을 얻기 위해 성장 방법을 사용하여 접종물을 준비했습니다. 조정된 접종물을 추가로 CAMHB로 희석하여 접종 후 각 웰에 약 5 x 104 CFU가 포함되도록 했습니다. 플레이트를 37℃의 호기성 조건에서 16~20시간 동안 배양하였다. C. acnes의 경우 CAMHB 대신 BHI(brain-heart infusion)(Avantor, Radnor, PA, USA) 국물을 사용하고 마이크로타이터 플레이트를 37°에서 70-74시간 동안 배양하여 이전에 설명한 대로 분석을 수행했습니다. 대기 생성 시스템 AnaeroGen™ Compact(Oxoid, Hampshire, UK)를 포함하는 혐기성 용기의 C.

분석된 각 원액에 대해 양성 대조군(CAMHB 또는 BHI 및 희석된 접종물), 중간 멸균 대조군(접종되지 않은 CAMHB 또는 BHI) 및 추출물 멸균 대조군(CAMHB 또는 BHI에 접종되지 않은 2-배 추출물 원액) 그에 따라 수행되었습니다. 최소 억제 농도(MIC) 값은 배양 후 미생물 성장을 눈에 띄게 억제하는 샘플의 최저 농도였습니다. 필요한 경우 제조업체의 지침에 따라 세포 생존 시약 PrestoBlue™(Invitrogen, San Diego, CA USA)를 사용하여 MIC 값을 확인했습니다. MIC*로 지정된 추가 MIC 값도 설정되었고 박테리아 성장이 양성 대조군과 비교하여 시각적으로 차별적으로 영향을 받는 샘플의 최저 농도로 정의되었습니다. 최소 살균 농도(Minimum bactericidal concentration, MBC) 값은 초기 접종액과 동일한 배양 시간에 비해 생존 가능한 박테리아 수를 최소 99.9% 감소시키는 샘플의 최저 농도로 보고되었습니다. 결과는 세 번의 생물학적 복제 후 얻은 값의 중앙값으로 표현되었습니다. 샘플 S1 및 S3을 용해하는 데 DMSO가 사용되었기 때문에 이 용매도 테스트하여 사용된 최종 농도가 표적 미생물을 방해하지 않는지 확인하여 분석을 수행했습니다.

2.6. 세포 기반 분석

2.6.1. 세포 배양

인간 케라티노사이트 세포주 HaCaT(CLS, 독일)를 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS) 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 표준 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 배양했습니다. 세포는 일상적으로 75 cm2 배양 플라스크에서 단층으로 유지되었고 가습 대기에서 5% CO2, 37 °C에서 배양되었습니다.

2.6.2. 체외 세포 독성

세포 독성 분석은 이전 연구[6]에 따라 수행되었습니다. 간략하게, HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 1.4 × 105 세포/cm2의 밀도로 시딩하였다. 3일 후, 세포를 각 샘플(Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2—50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, {{30} }.78, 0.39; S1—3, 1.5, 0.75, 0.38, {{40}}.19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3—5.5, 2.75, 1.38, 0.69, 0.34, 0.17, 0.09, 0.04 mg/mL) 배양 배지(0.5% FBS를 함유하는 DMEM 배지)에 희석. 0.5%(v/v) FBS가 보충된 배양 배지로만 배양된 세포를 포함하는 웰을 대조군으로 사용했습니다. 용매 독성을 배제하기 위해 배양 배지에서 50% 물 또는 1% DMSO를 사용한 용매 제어도 수행되었습니다. 24시간 배양 후, 제조업체의 지침에 따라 PrestoBlue®(배양 배지에서 5% v/v)를 사용하여 37°C, 5% CO2에서 2시간 동안 세포 생존력을 평가했습니다. 그 후, FLx800 형광 마이크로플레이트 판독기(BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)에서 각 웰의 형광을 측정하였다(Ex./Em. 560 ± 20/590 ± 20 nm). 세포 생존력은 대조군에 대한 생존 세포의 백분율로 표현하였다. 3개의 독립적인 실험을 3중으로 수행하였다.

2.6.3. 세포 항산화 활동

세포 항산화 활성은 이전에 설명한 방법[6,30]에 따라 평가되었으며 일부 수정되었습니다. 요약하면, HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 1.4 × 105 cells/cm2의 밀도로 시딩하고 세포 내 ROS의 형성을 20,70 -dichlorofluorescein diacetate( DCFH-DA)를 형광 프로브로 사용합니다. 파종 72시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 비독성 농도의 샘플(0.1875 mg/mL; 0.375 mg/mL; 0.75 mg/mL) + PBS에서 25 μM DCFH-DA와 함께 1시간 동안 배양했습니다. 이어서, 세포를 다시 PBS로 세척하고 스트레스 유도제(PBS 중 600 μM AAPH)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 FL800 마이크로플레이트 형광 판독기(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)에서 형광을 측정하였다(Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm). 결과는 처리되지 않은 대조군(DCFH-DA 및 AAPH로 처리된 세포)에 대한 ROS 백분율로 표시됩니다. 3개의 독립적인 실험을 3중으로 수행하였다.

2.6.4. IL-6 및 IL-8 분비 평가

실험은 이전에 설명한 대로[31], 몇 가지 수정 사항을 적용하여 수행되었습니다. 간략하게, HaCaT 세포를 12개의 웰 플레이트에 1 × 105개 세포/cm2의 밀도로 시딩하였다. 3일 후, 세포를 15 µg/mL의 대장균 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극하고 각 추출물({{10}}.1875 mg/mL; {{ 14}}.375 mg/mL; 0.75 mg/mL) 배양 배지(0.5% FBS를 함유하는 DMEM 배지)에 희석. LPS만 배양한 세포와 ​​배양액만 배양한 세포를 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로 사용하였다. 24시간 후, 상등액을 수집하고 2000g에서 10분 동안 원심분리한 다음 추가 분석까지 -80ºC에서 보관했습니다. IL-6 및 IL-8 수준은 상업적으로 이용 가능한 키트(PeproTech; London, UK)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 450 nm에서 흡광도를 측정하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 평가했습니다. 마이크로플레이트 분광광도계(EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)에서 파장 보정을 620 nm로 설정했습니다. 결과는 양성 대조군(LPS로 자극된 세포)에 대한 IL-6 또는 IL-8 백분율로 표시됩니다. 3개의 독립적인 실험을 3중으로 수행하였다.

2.7. 통계 분석

ORAC 및 세포 기반 분석 결과는 최소 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균값 ± SD로 표현됩니다. 효소 및 세포독성 분석의 경우 IC50 값은 GraphPad Prism 8.4.3을 사용하여 log10 플롯을 통해 용량-반응 곡선에서 결정되었습니다. 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). 결과는 95% 신뢰 구간의 IC50으로 표시됩니다. 결과의 통계 분석은 이전 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 데이터의 균질분산 및 정규분포가 확인되면 일원분산분석(ANOVA)으로 결과를 분석한 후 다중비교를 위한 Tukey 검정을 수행하였다. 분산이 이질적이거나 데이터가 정규 분포를 따르지 않는 경우, 평균이 유의하게 다른지 여부를 확인하기 위해 적절한 짝이 없는 스튜던트 t-테스트를 ​​수행했습니다. 0.05 이하의 p-값은 모든 경우에 통계적으로 유의한 것으로 인정되었습니다. 항균제 감수성 검사 결과는 최소 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 중앙값으로 표시됩니다.

3. 결과 및 논의

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>45.7g/100g)을 선택했습니다. 각 추출물의 총 단백질 함량에 대한 결과는 표 1에 제시되어 있다.

3.1. 항산화, 노화 방지 및 과다 색소 침착 방지 활동

추출물의 잠재적 코스메슈티컬 효과는 초기에 항산화, 노화 방지 및 과색소침착 방지 효과를 평가하기 위해 화학적 및 효소 분석을 사용하여 스크리닝되었습니다. 항산화 능력의 경우, 피부 노화의 주요 원인 중 하나로 간주되는 생물학적으로 관련된 ROS, 즉 퍼옥실 라디칼을 소거하는 샘플의 능력을 측정하는 ORAC 분석이 선택되었습니다[2,32]. 이 효소가 엘라스틴 및 기타 ECM 단백질의 분해를 담당하는 것으로 보고되어 있기 때문에 엘라스타제 억제를 통해서도 노화 방지 효과를 평가하였다[6]. 항과색소침착 효과를 위해 티로시나제 분석법을 사용하여 샘플의 멜라닌 생성 억제 능력을 평가했습니다. 표 2는 모든 추출물의 ORAC 및 IC50 값을 요약한 것입니다.

우리의 결과는 정어리와 대구 추출물이 항산화 활성과 elastase 및 tyrosinase 효소 활성에 대한 억제 효과를 나타냄을 보여줍니다. 정어리 시료 중 S1이 가장 높은 ORAC 값(1.94 ± 0.08 µmol TEAC/mg extract)을 보였고 S3과 S2가 그 뒤를 이었습니다. 이러한 결과는 대체 방법(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl-DPPH 분석)을 통한 이전의 항산화 평가에 의한 것으로 추출물 S1이 가장 낮은 IC50 값을 나타냈습니다[22]. S1 샘플의 퍼옥실 라디칼에 대한 더 높은 소거 능력은 추출물에 존재하는 서로 다른 아미노산 서열을 가진 펩타이드에서 파생될 수 있는데, 그 이유는 그들 사이의 상호 작용이 라디칼 소거 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다[33]. 또한 Maillard 또는 기타 열 산화 반응에서 생성된 화합물은 샘플의 항산화 활성에 영향을 줄 수 있습니다[34]. 가장 낮은 ORAC 값에도 불구하고 샘플 S2 및 S3은 각각 티로시나제 및 엘라스타제 활성을 억제하는 능력이 가장 높았습니다.

대구 추출물 중 Cf4는 가장 높은 항산화 및 항 색소 침착 활성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 추출물에 대한 SEC-GPC 분석 결과, 추출 온도를 250℃까지 증가시키면 분자량이 감소하는 펩타이드가 얻어지는 것으로 나타났다[11]. 이 샘플의 엘라스타제 억제 능력은 다른 Cf 추출물, 즉 Cf1 및 Cf3에서 발견된 값 범위 내에 있습니다. 그러나, 테스트된 농도에서 이 두 추출물은 티로시나아제에 대한 억제 활성을 나타내지 않았습니다.

문헌에서 일부 보고서는 해양 부산물 추출물이 관련 항산화 활성 및 티로시나아제 억제를 나타냄을 보여줍니다. 예를 들어, 알칼리성 가수분해에 의해 해양(Scophthalmus maximus) 부산물에서 추출한 추출물은 다양한 화학 분석을 통해 항산화 활성을 입증했습니다. 대조군에 대해 36.12%), ABTS(2,20 -azinobis-(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulphonic acid) 방법(12.81 µg BHT/mL) 및 크로신 표백 분석(8.{ {28}}3 µg Trolox/mL) [35] 또 다른 연구에서, 명반 소금에 절인 해파리(Lobonema smithii)의 효소 추출은 항산화 활성이 높은 가수분해물을 생성하는 것으로 나타났습니다(IC{{20}}}. ABTS e DPPH 분석의 경우 9 mg/mL) 및 티로시나제 억제 가능성, IC50 값 범위는 14.1~24.5 mg/mL [36], 이 작업에서 얻은 것과 동일한 크기입니다. 또한 유사한 항산화 수치(ORAC 수치 – 0.4 ~ 3.5 µmol TEAC/mg 추출물)를 가진 추출물은 다른 유형의 식품 산업 잔류물, 즉 포도주 양조 폐기물 흐름[6]에서 얻었습니다. 그러나 이러한 와이너리 잔류물 추출물은 아마도 페놀 화합물의 존재로 인해 이 작업에서 얻은 것보다 더 높은 티로시나제(4.0~0.14mg 추출물/mL) 및 엘라스타제(IC50 3.4~0.1mg 추출물/mL) 억제 능력을 나타냈습니다. 여러 가지 생리활성이 있는 것으로 알려져 있습니다. 우리 연구에서 버섯 티로시나아제를 사용하여 추출물의 항-과색소침착 효과를 스크리닝했다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 이 효소는 높은 처리량 분석에 널리 사용되었기 때문입니다[37]. 그럼에도 불구하고, 이 효소와 포유류/인간 티로시나제와의 유사성 및 상동성에 대해 약간의 논란이 있기 때문에[38-40], 정어리 및 대구 추출물의 잠재적인 항-과색소침착 효과를 평가하기 위해 포유류 세포주를 포함하는 향후 연구가 고려되어야 합니다.

어떤 화합물이 추출물의 생체 활성 반응을 담당할 수 있는지 확인하기 위해 생체 활성 데이터와 이전에 보고된 추출물의 아미노산 조성 사이의 상관 관계 연구를 수행했습니다[11,22](표 S1). 항산화 활성의 경우, 모든 추출물에 대해 ORAC 값과 총 트레오닌, 유리 발린, 유리 및 총 류신 간에 가장 높은 상관관계(0.7보다 크거나 같음)가 얻어졌습니다. 정어리 샘플의 경우, 유리 및 총 트립토판 함량에 대해 높은 상관관계(0.94 이상 R2)도 얻어졌습니다. 따라서 이러한 모든 아미노산은 이전에 여러 모델 시스템에서 항산화 특성을 갖는 것으로 보고되었습니다[41-43]. 엘라스타제 및 티로시나제 억제 활성의 경우, 총 단백질 함량 및 유리 아르기닌에 대해 각각 가장 높은 상관 계수(R2 0.8 이상)가 얻어졌는데, 이는 이들 화합물이 잠재력에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 어업폐기물추출물의 항노화 및 항과색소침착 효과.

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