천연 안티에이징 화장품의 생명공학 성분인 남조류 2차 대사체 2
Aug 24, 2022
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2.3.생물학적 활동
2.3.1.라디칼 소거 활동
슈퍼옥사이드 음이온 라디칼은 인체에 매우 중요한 생리학적 자유 라디칼입니다. 호기성 호흡 동안 이 ROS가 과도하게 생성되거나 내인성 해독 메커니즘이 실패하거나 불충분할 때 심각한 유해 효과와 함께 산화 손상의 위험이 증가합니다. 이런 의미에서 오즈*의 유해한 영향을 억제하는 메커니즘을 찾는 것은 화장품 분야뿐만 아니라 다양한 질병의 개선 및 예방을 고려하는 데 매우 중요합니다. 시아노박테리아 추출물의 O2" 소거 거동은 그림 1에 표시되고 IC 값은 표 6에 요약되어 있습니다.
수성 추출물은 아세톤 추출물(표 6)보다 Oz* 소거에 훨씬 더 효과적이었고 용량 의존적 활성을 나타내었으며(그림 1), 담수 균주가 해양 균주에서 두드러졌습니다. Cephalothorax lacustris LEGE 15493은 가장 효과적인 균주로 ICso 값이 가장 낮았습니다(65.5 ug 건조 추출물/mL, p<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">
다른 시아노박테리아 간의 항산화 능력 비교는 적용된 다른 방법으로 인해 어렵습니다. Morone과 동료들은 다른 시아노박테리아 균주의 에탄올(70% v/v) 추출물의 라디칼 소거 능력을 평가했으며[26], 가장 낮은 ICso 값은 Phormidium sp.LEGE 02 05292에 대해 822.70ug/mL인 반면, Nodosilinea nodulosa LEGE 06102에 대한 활성이 검출되었습니다. Lopes와 동료들은 Nodosilinea (Leptolynbbya) Antarctica LEGE13457 및 Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 아세톤 추출물에 대한 O2 소거 활성을 보고했습니다. sp.LEGE 13412 [27]처럼. 저자는 또한 에탄올 추출물과 비교할 때 아세톤 추출물에서 더 높은 효과를 보고했습니다. Amaro와 동료들이 수행한 또 다른 연구에서는 Gloeothece sp. 및 Scenedesmus obliquus(M2-1), 각각 [37]. 아세톤 추출물에 대해 여기에서 얻은 결과는 비록 크기의 순서가 같더라도 이전에 보고된 것보다 덜 유망해 보입니다. 다른 한편으로, 수성 추출물은 피부 노화 분야의 화장품 응용 분야에서 추가로 활용될 가치가 있는 엄청난 잠재력을 보여주었습니다.
2.3.2.효소 억제
MMP는 세포외 아연 의존성 효소군으로, 주요 기능은 세포를 결합하고 영양소와 산소의 경로를 제공하는 데 필수적인 젤과 같은 물질인 ECM[38]을 리모델링하고 분해하는 것입니다[39]. MMP에 의해 유발되는 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 ECM 구성 요소의 변화는 피부 손상 및 주름 형성의 기초입니다[40]. 피부 구조 및 주름 형성과 관련된 이러한 효소와 함께 또 다른 효소는 멜라닌 생성 활성으로 인해 노화 과정에서 중요한 역할을 합니다: 티로시나제. 다른 요인들 중에서 UVR 노출은 ROS 생성 증가로 인해 비정상적인 양의 멜라닌 축적을 유발합니다. 이러한 반응성 종은 멜라닌 세포의 활성에 영향을 미치며, 산화에 의해 티로신이 멜라닌으로 전환되는 것을 증가시켜 과다색소 침착 및 불규칙한 피부 패치를 유발합니다[41].
Cistanche 캔 안티 에이징
상업적인 노화 방지 성분에 대한 천연 대안을 찾기 위해 위에서 언급한 효소를 중심으로 시아노박테리아 추출물의 활성을 조사했습니다(그림 2). HAase와 관련하여 용량 의존적 방식으로 작용하는 이 효소를 억제할 수 있는 균주는 세 가지뿐입니다. ectocarpiLEGE 11479(IC{4}} ug/mL) 및 Cephalothrix lacustris LEGE 15493 및 Nodosilinea nodulosa LEGE 06104의 아세톤 추출물은 IC25(각각 832 및 995ug/mL)에만 도달합니다. 이 값이 높아 보이지만 활성 범위는 대조약인 di-sodium cromoglicate(DSCG)(IC{11}} ug/mL)와 유사했습니다. 또한 테스트된 최고 농도에 대해 언급할 가치가 있습니다. (1 mg/mL), Leptolyngbya 참조. ectocarpi LEGE 11479는 이 효소를 80% 억제했습니다(그림 2). 이 추출물은 화장품 성분으로 유망합니다.
시아노박테리아 화합물과 추출물이 히알루로니다제 활성에 미치는 잠재적 영향에 대한 연구는 거의 없었으며 추출물의 생물학적 잠재력에 대한 모든 비교는 시아노박테리아 대사가 배양 조건에 따라 상당한 변화를 겪으며 추출물의 화학적 조성에 영향을 미친다는 점을 고려해야 합니다. Morone과 동료[26]는 Tychonema sp.의 에탄올 추출물의 효과를 평가했습니다. LEGE 07196 및 Cyanobium sp. LEGE 07175는 hyaluronidase에 대해 182.74 및 208.36 ug/mL의 IC 값으로 더 강력한 억제 활성을 발견했습니다. 에탄올 추출물의 활성은 Spirulina platensis의 불용성 분획에서도 보고되었으며 IC50은 150ug/mL입니다[42]. Yamaguchi와 Koketsu[19]에 의해 수행된 또 다른 연구에서는 Nostochopsis lobatus MAC0804NAN이 높은 억제 효과(IC{13}}.18 ug/mL)를 갖는 다량의 다당류를 생산하는 것으로 나타났습니다. Arthrospira- 파생된 펩타이드는 hyaluronidase 억제에 관여할 수 있습니다[4]. 함께, 이러한 결과는 시아노박테리아 화합물 및 추출물이 코스메슈티컬 애플리케이션을 위한 노화 방지 성분으로서의 잠재력을 뒷받침합니다.
엘라스타제를 고려할 때, 아세톤 추출물만이 흥미로운 생리활성을 나타냈다. Leptoling-bya cf. ectocarpi LEGE 11479는 391ug/mL의 값으로 ICso에 도달한 유일한 균주로서 다시 가장 활동적이었습니다(그림 2). Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 및 Leptolyngbya boryana LEGE 15486는 각각 126,86 및 99ug/mL의 값으로 IC25에만 도달했습니다. hyaluronidase의 경우 해양 균주가 가장 유망한 것으로 나타났습니다.
우리가 아는 한, 여기에서 조사된 균주에 대한 엘라스타제 억제 활성에 대한 이전 보고서는 없습니다. 다른 균주와 관련하여 Nostoc minutum은 ICso =1.3 및 11.{4}} ug/mL[44,45]로 마이크로비리딘형 펩타이드와 노스토펩틴을 생산하는 것으로 밝혀졌습니다. Microviridins B와 Contained from Microcystis aeruginosa는 ICso 값이 0인 것으로 엘라스타제를 효과적으로 억제했습니다.{9}}44 및 0.084 ug/mL[46]. 엘라스타제 억제와 관련된 대부분의 데이터는 분리된 화합물에 초점을 맞추고 있습니다. 그래서 우리 균주의 추출물과 비교하기가 어렵습니다.
노화 및 UV 노출과 관련된 고르지 못한 피부 색소 침착은 고령화 인구 및 화장품 산업의 주요 관심사로 남아 있습니다. 이용 가능한 연구의 대부분은 사소한 것으로 버섯 티로시나제를 효소 모델로 사용하여 결과를 인간 환경으로 번역하기가 어렵지만 이 효소는 인간 티로시나제와 높은 유사성과 상동성을 가지고 있습니다[47]. 따라서 동일한 효소 모델을 사용하여 티로시나제 억제에서 시아노박테리아 추출물의 잠재력을 조사했습니다. 엘라스타제는 아세톤 추출물만이 티로시나제를 억제할 수 있었다. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104는 IC#N(989.26±4.3 ug/mL)에 도달한 유일한 균주로서 가장 효과적이었습니다(그림 2). 그 아래에는 IC25=784 78±4.33 ug/가 있는 Leptolyngbya boryana LEGE 15486이 있었습니다. mL, 그리고 마지막으로 Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479, 해양 균주에 대해 가장 유망한 결과가 발견되었습니다.
Morone과 동료들은 이전에 동일한 모델에서 시아노박테리아 에탄올 추출물의 활성을 조사했지만 활성을 찾지 못했습니다. 이것의 흥미로운 측면 중 하나는 연구된 균주 중 하나가 Nodosilinea nodulosa LEGE 06102라는 것입니다. 이 균주는 여기에서 최상의 결과를 보여 표적 생리활성 추출물을 얻는 데 있어 추출 용매의 중요성을 다시 한 번 강조합니다. 탐색된 다른 효소에 관해서는 시아노박테리아에 초점을 맞춘 조사도 티로시나아제에 대해 부족합니다. Yabuta와 그의 팀이 수행한 연구[48]에 따르면 Nostochopsis spp. tyrosinase 활성(IC{4}} ug/mL)을 유의하게 억제했습니다. 이는 본 연구에서 활성이 발견되지 않은 수성 추출물의 결과라는 점을 고려할 때 매우 흥미로운 결과입니다. 저자들은 그 결과가 열처리에 의해 PBP에서 방출된 저분자량 화합물, 즉 강력한 퍼옥실 라디칼 제거제 역할을 하는 이중린 부분 때문이라고 생각합니다. 또 다른 연구에서는 Arthrospira platensis 에탄올(IC50=14,000 ug/mL)과 물(IC50 =72,000 ug/mL) 추출물의 억제 활성을 평가했습니다. 값은 에탄올 추출물에 ferulic 및 caffeic acid와 같은 페놀 화합물의 존재에 기인합니다[49].
2.3.3.자외선 차단
점점 더 많은 화장품 회사가 제품에 자외선 차단제를 포함하고 있지만, 조기 피부 노화를 늦추는 데 매일 사용하는 것이 이점에 대해 소비자를 설득하는 것은 여전히 어렵습니다. 한편으로 자외선 차단제를 매일 바르는 것이 약간의 뿌리 깊은 습관이라면, 다른 한편으로는 합성 물질의 원치 않는 관련 위험 때문에 사용에 대한 두려움이 있습니다[50]. 이에 따라 자연 광보호에 대한 연구는 생물 분해성 및 낮은 독성 가능성을 고려하여 지난 몇 년 동안 상당히 증가하여 인간과 환경에 더 유익합니다. 이 분야에서 남조류 추출물을 조사하기 위해 자외선 차단제 역할을 하는 그들의 능력이 가장 해로운 방사선이기 때문에 UVR-B에 대해 시험관 내에서 평가되었습니다. 시아노박테리아 수성 및 아세톤 추출물에 대해 발견된 결과가 표 7에 제시되어 있다.
아세톤 추출물과 관련하여 가장 유망한 값(19.2)은 Leptolyngbya boryana LEGE 15486에서 발견되었으며, Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479(10.7)가 뒤를 이었습니다. 둘 다 테스트된 가장 낮은 농도인 200ug/mL에서 나타났습니다. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104는 아세톤 추출물 중에서 가장 유망한 추출물이었습니다. 수성 추출물에서는 시험된 최고 농도에서 가장 유망한 결과를 얻었으며, Leptolyngbya boryana LEGE 15486 및 Cephalothrix lacustris LEGE 15493은 시험관 내 SPF 값이 각각 17.1 및 14.9로 두드러졌습니다(표 7).시스탄체 수명 연장이 분야의 이전 연구를 논의하면서 Hossain과 그의 팀은 [51] Cephalothrix komarekiana 추출물의 SPF 값이 2.37이라고 보고했습니다. 또 다른 그룹은 Aphanizomenon flos-aquae의 메탄올 추출물의 SPF가 4임을 발견했습니다[52]. 그러나 저자가 사용한 추출물의 농도에 대한 정보가 없어 비교가 어려웠다.
특히 SPF와 관련하여 화장품 분야에서 탐구되는 남조류 균주의 수는 이러한 자원의 잠재력을 고려할 때 매우 부족합니다. 여기에 제시된 결과는 연구 중인 종들이 생물학적 광 보호제로서 좋은 선택이 될 수 있으며 현재 시판되는 다른 선스크린에 대한 부스터 역할을 할 수 있음을 보여주어 공식에서 합성 선스크린의 농도를 감소시킬 수 있습니다. 따라서 이러한 유기체, 특히 생리활성 추출물에 대한 연구를 늘리는 것이 중요합니다. 분리된 화합물보다 훨씬 더 낮은 비용, 더 높은 수율 및 더 빠른 획득이 환경 친화적이며 경제적으로 더 매력적입니다.
2.4. PCA 분석에 의한 남조류 추출물의 판별
최근 몇 년 동안 화장품 분야의 성분으로 사용할 가능성이 있는 천연 공급원에서 생리 활성 화합물에 대한 검색이 증가했습니다. 시아노박테리아 유래 화합물은 잠재적으로 독성이 덜하고 완전히 생분해될 수 있을 뿐만 아니라 재생 가능한 공급원에서 구할 수 있으며 통제된 환경에서 저렴한 비용으로 얻을 수 있습니다.시스탄체 NZ화학적 조성과 생물학적 활성에 따른 생리활성 추출물의 분류는 잠재적인 관계를 지적하는 데 유용할 수 있습니다. 이와 관련하여 시아노박테리아 추출물의 화학적 조성과 각 분석에서 테스트한 최고 농도의 생체 활성을 고려하여 주성분 분석(PCA)을 적용했습니다(그림 3). 관찰할 수 있듯이 변동성의 72.99%는 처음 두 차원으로 설명할 수 있습니다. PC1은 분산의 5{22}}.41%를 설명하고 PC2는 22.58%를 설명합니다. 세 그룹이 구별되었습니다(그림 3A ): Gl, Leptolyngbya cf.exocarp LEGE 11479 물 추출물 포함; Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryama LEGE 15486 및 Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 물 추출물을 포함하는 G2; 및 모든 아세톤 추출물을 포함하는 G3. 도 3B에 따르면, G1은 PE 함량으로 인해 다른 샘플과 화학적으로 구별됩니다. Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryana LEGE 15486 및 Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 물 추출물은 PC, APC 및 총 단백질(G2)의 함량에 따라 그룹화되지만 모든 아세톤 추출물(G3)은 동일한 그룹에서 발견됩니다. 카로티노이드, 엽록소 및 그 유도체의 함량. 효소 활성을 넘어 화합물은 PCl 양의 축으로 형성된 평면과 함께 표시됩니다(그림 3B). 엽록소 a와 카로티노이드의 함량이 높은 샘플은 엘라스타제 a 및 티로시나제 억제와 밀접한 관련이 있음을 관찰할 수 있습니다. 이것은 카로티노이드와 엘라스타제 사이의 강한 양의 상관관계에 의해 입증됩니다(0.725,p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05).일반적으로 PCA 분석을 통해 피부 노화 분야에서 나타나는 생물학적 활성에 따라 추출물을 그룹화하여 아세톤 추출물이 분해를 담당하는 효소를 억제하는 데 더 효과적이라는 결론을 내렸습니다. 수성 추출물은 자유 라디칼을 제거하고 자외선의 해로운 영향으로부터 피부를 보호하는 데 더 효과적입니다.
우리가 아는 한, 이러한 남조류 균주 추출물의 화학적 조성과 생물학적 활성 사이의 관계가 확립된 것은 이번이 처음입니다.
3. 재료 및 방법
3.1. 남조류 바이오매스 생산
브라질 민물 생태계의 4가지 사상 시아노박테리아 균주 Cephalothrix lacustris LEGE 15493 및 Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486, Leptolyngbya cf. 이 연구에서는 포르투갈 해양 생태계의 ectocarpi LEGE 11479와 Nodosilinea nodulosa LEGE 06104를 사용했습니다. 균주는 해양 및 환경 연구의 학제 간 센터(CIIMAR)의 Blue Biotechnology 및 Ecotoxicology Culture Collection(LEGE CC)에서 유지되었습니다. 통제된 조건, 4L까지 순차적으로 확장되었습니다. 균주는 해양 균주에 대해 10ug/L 비타민 B12 및 25g/LNaCl이 보충된 Z8 배지[53]에서 성장했습니다. 배양은 25도, 10umol 광자 m{16}} s{17}}의 광도 및 14h 광:10h 어두움의 광주기로 유지되었습니다. 여과를 통해 생장 120일 또는 150일 후에 신선한 바이오매스를 수집하고(균주에 따라 다름) 동결, 동결 건조하고 추출물이 준비될 때까지 -20도에서 보관했습니다.
3.2.추출물 준비
아세톤과 수용액의 두 가지 다른 추출물이 각 균주에서 순차적으로 준비되었습니다. 먼저 건조 바이오매스 2g을 이용하여 아세톤 추출물을 제조하였다. 바이오매스를 아세톤에 현탁시키고 초음파 수조(Fisherbrand[FB15053, Loughborough, UK)에서 10분 동안 추출하였다. 아세톤 추출 후 생성된 펠렛을 흄 후드에서 건조시킨 후 동일한 절차에 따라 증류수 70mL로 추출하였다. HERAEUS MegafugeTM 16R 마이크로원심분리기(Thermo ScientificTM, Waltham, MA, USA)에서 4도에서 5분 동안 10,{5}} × × g Gs에서 원심분리하여 세포 파편을 제거했습니다. 압력(BUCHIR-210 회전 증발기)(아세톤 추출물) 또는 냉동 및 동결건조(수성 추출물). 상응하는 상층액으로 추출을 3회 반복하였다. 건조 추출물은 추가 화학적 및 생물학적 분석이 있을 때까지 -20도에서 유지되었습니다.
3.3.세포 분석
3.3.1.세포 배양
인간 각질세포 HaCAT(ATCC), 마우스 섬유아세포 3L1(ATCC) 및 인간 내피 세포 hCMEC(Dr. POCouraud(INSERM) 제공)를 세포독성 평가에 사용하였다. 세포주는 10%(v) 소태아혈청(Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep 100 IU)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM GlutaMAXTM, Gibco, Glasgow, UK)에서 배양되었습니다. /mL 및 10mg/mL)(Gibco) 및 0.1% Amphotericin B(Gibco). 세포 유지 및 분석은 5% CO2 가습 분위기에서 37도에서 수행되었으며 배양 배지는 2일마다 교체되었습니다. 80-90% 세포 합류에서, 부착 세포를 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco)로 세척하고, TrypLEX 발현 효소(1x)(Gibco)로 분리하고, 유지 관리를 위해 통과시키고, 계획된 분석을 위해 시딩했습니다.
3.3.2.세포독성 - MTT 분석
세포 생존력은 {0}(4,5-디메틸티아졸{3}}일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTI, Sigma-Aldrich, Germany) 분석, 이전에 보고된 대로 [26]. 모든 세포주(내피 세포, 섬유아세포 및 각질세포)를 96-웰 플레이트에 각각 1.0 x 10 cells/mL, 3.3 x 104 cells/mL 및 2.5 x 104cells/mL의 밀도로 시딩했습니다.cistanche 남근 크기세포 부착 24시간 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 24시간 및 48시간 동안 12.5에서 200ug/mL까지의 5가지 연속 농도로 다른 시아노박테리아 추출물을 함유하는 새로운 배지에 노출시켰다. 아세톤 추출물의 경우 원액을 DMSO(dimethyl sulfoxide)(Gibco)로 제조하고 최대 DMSO 농도가 1%를 초과하지 않도록 세포 노출 전에 DMEM으로 희석하였다. 수성 추출물을 PBS에서 제조하고 세포 노출 전에 DMEM으로 희석하였다. 음성대조군은 PBS, 세포사멸대조군은 DMSO 20%였다. 배양 후, MIT 세포독성 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, 20 μL의 MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 37도에서 3시간 동안 인큐베이션했습니다. 인큐베이션 후 배지를 조심스럽게 제거하고 보라색의 포르마잔 염을 DMSO에 용해시켰다. 흡광도는 GEN51M 소프트웨어에 의해 작동되는 Synergy HT 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(Biorek, Bad Friedrichshall, Germany)로 550 nm에서 판독되었습니다. 검정을 4회 수행하고 평균을 냈다. 재현성을 위해 각 분석은 독립적으로 최소 3회 반복되었습니다. 세포독성은 용매 대조군에서 100% 생존을 고려하여 세포 생존율의 백분율로 표현하였다.
3.4. 남조류 추출물의 화학적 프로파일링
3.4.1.총 페놀 함량(TPC)
추출물의 TPC를 결정하기 위해 약간 수정된 Folin-Ciocalteu 방법론[54]을 기반으로 하는 비색 분석이 사용되었습니다. 아세톤 추출물을 DMSO에 용해시키고 수성 추출물을 물에 용해시켰다. 간단히 말해서, 25μL의 각 추출물(1{14}}mg/mL)을 25μL의 Folin-Ciocalteu 시약(Sigma-Aldrich)20{{20}}과 완전히 혼합했습니다. NagCO3 용액 μL 및 탈이온수 500 μL. 블랭크의 경우 Folin-Ciocalteu 시약을 탈이온수로 대체했습니다. 형성된 착색 생성물의 흡광도는 GEN51M 소프트웨어를 통해 작동되는 Synergy HT 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(Biotek, Bad Friedrichshall, Germany)를 사용하여 725 nm에서 측정되었습니다. TPC 정량을 위한 표준 곡선은 7가지 농도의 갈산(GA)(0.025 ~ 0.5mg/mL)을 사용하여 얻었으며, 테스트할 추출물과 동일한 용매(y{18}}.097x+0.01560 R²{{ 22}}.9989, 아세톤 및 y=2.204x＋0.01401, R2=0.9982, 물의 경우, 여기서 "y"는 흡광도를 나타내고 "x"는 농도를 나타냄) . 3개의 독립적인 측정을 이중으로 수행했습니다. 총 페놀 함량은 건조 추출물 mg당 ug GA 당량(GAE)으로 표시되었습니다.
3.4.2.총 단백질
총 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(#23227,Thermo-Scientific)를 사용하여 결정되었습니다. 수성 추출물은 물에서 제조하고 아세톤 추출물은 DMSO에서 제조했습니다. 간단히 96-웰 플레이트에서, 25 uL의 각 추출물(1 mg/mL)을 200 μL의 작업 시약과 혼합했습니다. 흡광도는 GEN5IM 소프트웨어를 통해 작동되는 Synergy HT 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(Biotek, Bad Friedrichshall, Germany)를 사용하여 562 nm에서 측정되었습니다. 표준 곡선(y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R2=0.999 및 y=162.87x3-248.51x²＋932.13x) -11.715;R2=0.99, 여기서 "y"는 흡광도를 나타내고 "x"는 농도를 나타냄) 9가지 농도의 알부민(BSA)을 사용하여 각 추출물에 대해 얻었습니다(25~ 2000 ug/mL)를 사용하여 단백질을 정량화합니다. 세 번의 독립적인 실험을 세 번 수행했습니다. 총 단백질 함량은 건조 추출물 mg당 소 혈청 알부민(BSA) 등가물의 ug으로 표시되었습니다.
3.4.3.안료
수성 추출물과 아세톤 추출물 모두에 존재하는 색소를 분광광도법으로 정량화했습니다. 엽록소 a 및 그 유도체는 상용 표준(Sigma-Aldrich)으로 얻은 보정 곡선을 사용하여 정량화되었습니다. y=8.{12}}791x-0.{17}}{{19} }22(R2=0.996), 여기서 "y"는 흡광도를 나타내고 "x"는 농도를 나타냅니다. 총 카로티노이드는 검량선(y{10}}.133x＋0.0099; R²=0.990, 여기서 "y"는 흡광도를 나타내고 "x"는 농도를 나타냅니다. 총 카로티노이드 농도는 건조 추출물 mg당 ㎍의 카로틴으로 표시되었습니다. 5가지 농도(0.001 ~ 0.025mg/mL)를 사용하여 두 표준 모두에 대한 보정 곡선을 얻었습니다. 분광광도 측정은 웰 플레이트에서 α-카로틴의 경우 450nm 및 엽록소 a의 경우 663nm에서 수행되었습니다. GEN5TM 소프트웨어를 통해 작동되는 Synergy HT 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(Biotek, Bad Friedrichshall, Germany).
PBP 함량은 다른 파장(562, 615 및 645 nm)에서 수성 추출물의 흡광도를 측정하고 이전에 Pagels et al. [34]: 수성 추출물을 0.5 mg/mL의 최종 농도로 재현탁했습니다. 실험은 3회 수행하였으며, 결과는 ug/mg 건조 추출물로 표시하였다. 3.5.생물학적 활동
3.5.1.과산화물 음이온 라디칼(O2*-) 소거
Barbosa와 동료[55]에 따르면 약간의 변형을 가한 시아노박테리아 추출물의 항산화 잠재력을 평가하기 위해 Oz*-의 자유 라디칼 소거 분석을 수행했습니다. 수성 추출물은 물에서 제조하고, 아세톤 추출물은 DMSO에서 제조하였다. 추출물의 거동과 IC 값을 평가하기 위해 각 추출물에 대해 5가지 연속 희석액을 준비하고 테스트했습니다. 모든 시약은 인산염 완충액(19 uM, pH 7.4)에 용해되었습니다. 96-웰 플레이트에서 각 희석액 50μL를 166μM -니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형(NADH) 용액 50μL 및 43μM NBT(nitrotetrazolium blue chloride) 용액 150μL와 혼합했습니다. 50 μL의 2.7 μM 페나진 메토설페이트(PMS)를 첨가한 후, GEN51M 소프트웨어를 통해 작동되는 Synergy HT 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(Biotek, Bad Friedrichshall, Germany)를 사용하여 운동 함수에서 샘플의 라디칼 소거 활성을 모니터링했습니다. 실온에서 562 nm에서 2분 동안. 3개의 독립적인 분석을 3회 수행하였다. GA를 양성 대조군으로 사용하였다. 결과는 미처리 대조군과 비교하여 라디칼 소거의 백분율로 표현하였다. 계산된 IC 값에 대한 결과는 이중으로 수행된 3개 이상의 독립적인 분석의 평균 ± SD(ug/mL)로 표시되었습니다. IC 값 및 해당 용량-반응 곡선은 Graphpad Prism@ 소프트웨어(미국 캘리포니아주 샌디에고; MacOS용 버전 9)를 사용하여 계산되었습니다.
3.5.2.히알루로니다제 억제
hyaluronidase 억제 분석은 Ferreres et al.[56]이 제안한 것에서 약간 수정되었습니다. 간단히 말해서, 각 추출물 25μL(9mg/mL), 175μL 히알루론산(HA)(0.7 mg/mL), 25μL 히알루로니다제(HAase)(90{{ 14}} NaCl 0.9% 중 U/mL)를 반응 튜브에서 혼합하였다. 수성 추출물은 물에서 제조하고, 아세톤 추출물은 DMSO에서 제조하였다. 37도에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 25 μL의 사붕산이나트륨(0.8 M in water)을 첨가하여 반응을 중지한 다음 수조에서 90도에서 3분 동안 인큐베이션했습니다. 375 uL의 DMAB[{19}}(디메틸아미노)벤즈알데히드] 용액을 첨가하기 전에 반응 튜브를 실온으로 냉각시켰다. 37도에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 형성된 착색 생성물의 흡광도를 GEN5IM 소프트웨어를 통해 작동되는 Synergy, HT Multi-detection 마이크로플레이트 판독기(Biotek, Bad Friedrichshall, Germany)에서 560 nm에서 측정했습니다. 음성 대조군은 추출물 없이 수행하였다. 크로모글리산이나트륨(DSCG)을 양성 대조군으로 사용했습니다.
3개의 독립적인 분석을 3회 수행하였고, 결과는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 효소 억제의 백분율로 표현하였다.
3.5.3.엘라스타제 억제
돼지 췌장 엘라스타제 억제 분석은 약간의 수정을 가하여 Mota와 동료[57]에 따라 수행되었습니다. 수성 추출물은 물에서 제조하고 아세톤 추출물은 DMSO에서 제조했습니다. 간단히 말해서, 96-웰 플레이트에서 50 ㎕의 추출물을 90 uL의 HEPES 완충액(0.1 M)과 혼합하고, N-succinyl-Ala-Ala-Ala p-nitroanilide 기질(100 uM) 10 uL, 아세테이트 완충액(200 mM) 70 uL, 엘라스타제 30 uL(1 U/mL) 플레이트를 37도에서 인큐베이션했습니다. 10분, 반응 생성물의 흡광도는 GEN51M을 통해 작동되는 Synergy HT 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(Biotek, Bad Friedrichshall, Germany)에서 405 nm에서 측정되었습니다. 음성대조군은 추출물 없이 시행하였고, 양성대조군은 아스코르빈산을 사용하였다.시스탄체 파우더3개의 독립적인 분석을 3회 수행하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 효소 억제의 백분율로 표현되었다.
3.5.4.티로시나제 억제
Tyrosinase 억제 분석은 Adhikari et al.[58]에 따라 수행되었습니다. 약간의 수정으로. 간단히 말해서, {{1}웰 플레이트에서 2{13}} μL의 각 추출물을 100 μL의 티로시나제(인산염 완충액 중 30 U/mL)와 혼합했습니다. 수성 추출물은 물에서 준비하고 아세톤 추출물은 DMSO에서 준비했습니다. 혼합물을 30도에서 8분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 80 μL의 L-DOPA(L-3,{10}}디하이드록시페닐알라닌) 용액(인산염 완충액 중 2.5mM)을 첨가하고, 흡수(T0, 시간 "0"에서의 흡광도)는 즉시 475 nm에서 GEN5TM 소프트웨어를 통해 작동되는 Synergy HT 다중 검출 마이크로플레이트 판독기(Biotek, Bad Friedrichshall, Germany)로 측정했습니다. T0(반응 생성물이 형성되기 전)에서의 흡광도 측정을 통해 연구 중인 추출물의 자연 색상으로 인한 간섭 가능성을 제거할 수 있었습니다. 30도에서 8분 동안 인큐베이션한 후, 흡광도를 다시 측정했습니다(T8). 시아노박테리아 추출물의 존재 하에 티로시나제 억제 백분율을 미처리(음성) 대조군과 비교하여 계산했으며, 여기서 흡광도 차이(T{ {21}}T0)은 효소 활성의 100%에 해당합니다. 음성대조군은 추출물 없이 시행하였고, 양성대조군은 코직산을 사용하였다. 3개의 독립적인 분석을 3회 수행하였다. 결과는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 효소 억제의 백분율로 표현되었다.
3.5.5.자외선 차단 지수(SPF)
체외 자외선 차단 지수는 Rohr과 동료들[59]에 따라 약간의 수정을 거쳐 결정되었습니다. 수성 추출물은 물에서 제조하고 아세톤 추출물은 아세톤에서 제조했습니다. 간단히 말해서, 2mL의 각 추출물(20 및 1000ug/mL)의 흡광도를 분광광도계(290에서 320 nm, 5에서 5 nm)에서 측정했습니다. SPF는 Mansur[60]가 제안한 공식을 사용하여 계산되었습니다. 여기서 EE(A)는 홍반 효과 스펙트럼, I(A)는 태양 강도 스펙트럼, Abs(λ)는 추출물의 흡광도, CF는 보정 계수 (28)은 알려진 SFP 값이 30인 상업용 자외선 차단제를 사용하여 결정되었습니다.
3.6.통계분석
통계 분석은 IBM SPSS 통계 소프트웨어(macOS용 버전 23.{1}}, IBM Corporation, New York,NY, USA, 2015)를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 Kolmogorov-Smirnov 및 Leven's에 의해 분산의 정규성과 동질성에 대해 분석되었습니다. 테스트를 마친 다음 Tukey의 HSD(솔직히 유의미한 차이)를 박사후 테스트로 사용하는 일원 분산 분석에 제출하거나 쌍을 이루지 않은 t-검정에 제출했습니다. 시아노박테리아 추출물의 화학적 프로파일과 생물학적 활성 사이의 정규화된 발현 데이터를 비교하기 위해 피어슨 상관 관계 테스트가 사용되었습니다.
3.7.주성분분석(PCA)
PCA는 잠재적으로 상관관계가 있는 여러 변수를 전체 데이터 세트의 변동을 설명하는 데 기여한 정도에 따라 순위를 매길 수 있는 비교적 독립적인 여러 변수로 변환하는 데 사용되었습니다[61]. 고차원 패턴의 상대적으로 중요한 구성 요소를 성공적으로 식별할 수 있습니다. 원래의 고차원 데이터를 저차원 공간에 매핑할 수 있으므로 고차원 패턴 분류 문제의 복잡성이 크게 줄어듭니다[62]. 본 연구에서는 IBM SPSS 통계 소프트웨어(macOS용 버전 23.0, IBM Corporation, New York, NY, USA, 2015)를 사용하여 PCA 기반 패턴 인식을 수행했습니다. 데이터 매트릭스는 4가지 시아노박테리아 균주의 수성 및 아세톤 추출물에 존재하는 대사 산물과 테스트된 최고 농도에서의 활성으로 구성되었습니다.
4. 결론
여기에서 분석된 시아노박테리아 추출물이 나타내는 생물학적 활성은 분명히 상관관계가 있는 것으로 판명되었습니다. 생리 활성 PBP의 존재에 따라 수성 추출물은 자외선 차단에 가장 효과적이며 라디칼 소거 능력과 함께 외부 요인에 의해 악화되는 피부 노화를 예방하기 위한 안티에이징 제형에 사용되는 유망한 성분으로 제안됩니다. 반면, 아세톤 추출물은 진피 기질의 분해 및 피부 구조 손실을 담당하는 효소의 활성을 억제하는 데 더 효과적임이 입증되어 노화와 관련된 피부 노화에 더 적합합니다.시스탄체 살사 추출물우리가 제안하는 순차적 추출 계획은 시아노박테리아 바이오매스의 수익화를 통해 화학적으로 다른 생리활성 추출물을 얻을 수 있어 프로세스를 보다 지속 가능하고 경제적으로 매력적으로 만드는 이점이 있음을 증명할 수 있습니다. 전체적으로 시아노박테리아 추출물은 화장품 제형을 위한 자연스럽고 안전하며 지속 가능한 성분을 찾는 것을 목표로 피부 노화 분야에서 더 많은 개발 가치가 있음이 입증되었습니다.
이 기사는 Mar. Drugs 2022, 20, 183에서 발췌했습니다. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs
