De Novo Transcriptome Assembly 및 Cistanche Deserticola Fleshy Stem-II의 유전자 발견

유전자 온톨로지 및 KEGG 데이터베이스를 기반으로 모든 표현된 성적표의 기능 분류

Gene Ontology(GO) 주석은 UniProt 주석 및 ID 연관 파일에서 얻었습니다. 전체적으로, 전체 발현 서열의 32.69%를 차지하는 20,907개의 전사체가 1,745개의 기능적 용어에 할당되었습니다. 전체 기능적 GO 용어 중 생물학적 과정에 대한 할당이 대다수(1,116, 63.95%)를 차지했고, 세포 구성 요소(329, 18.85%)와 분자 기능(300, 17.20%)이 그 뒤를 이었습니다. 표현된 성적표에 할당된 기능은 광범위한 GO 범주를 다루며 가장 주석이 달린 성적표가 있는 상위 10개 GO 용어가 표 3에 나열되어 있습니다. 우리는 세 가지 유전자 온톨로지 범주(분자 기능, 세포 구성 요소 및 생물학적 과정)을 보충 파일(S3 데이터 세트)에 저장합니다. 결합 기능 및 트랜스퍼라제 활성과 관련된 GO 용어는 분자 기능 범주에서 주로 표현되었습니다. 결합 기능과 관련하여 양이온 결합(4,394개 전사체)이 가장 많았고, 뉴클레오티드/뉴클레오시드 결합(평균 3,404개 전사체), 단백질 결합(2,422개 전사체)이 그 뒤를 이었습니다. 트랜스퍼라제 활성 그룹에 있는 동안, 인을 함유하는 그룹을 전달하는 그룹이 가장 많습니다(2,256개 전사체, 65.77%). 세포 구성 요소 범주 중 전사체는 세포 내(평균 10,581개 전사체)에 더 많이 위치하는 반면, 생물학적 과정 범주 중에서 전사체는 생체고분자 대사 과정(평균 6,683개 전사체)에 더 많이 관여했으며, 그 다음으로 세포 과정 조절(4,841개 전사체)이 뒤따랐습니다. ), 유전자 발현(4,678개 전사체) 및 수송(3,512개 전사체).

알츠하이머병 예방을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

리그닌과 PhG의 생합성에 관여하는 유전자를 채굴하기 위해 KEGG 데이터베이스에 있는 13개 식물 유기체의 유전자 서열에 대해 21,358개의 중복되지 않는 잠재적 단백질 서열을 검색하고 최소 5개의 적중을 가진 275개의 KEGG 경로에 할당했습니다. 가장 많이 정렬된 서열을 가진 상위 10개 경로가 표 4에 나열되어 있습니다. 대부분의 경로는 아미노산 또는 단백질 대사(ko01230, ko04141 및 ko04120), 탄수화물 대사(ko01200 및 ko00500), 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드와 같은 1차 대사 과정에 관여했습니다. 뉴클레오시드 대사(ko03018, ko00230 및 ko00240). 게다가 테르페노이드 백본 생합성, 페닐프로파노이드 생합성, 카로티노이드 생합성, 이소퀴놀린 알칼로이드 생합성, 트로판, 피페리딘 및 피리딘 알칼로이드 생합성과 같은 27개의 2차 대사 관련 경로(그림 2)가 있습니다. 이러한 결과는 활성 대사 과정이 진행되고 있음을 추가로 나타냅니다.C.데데티콜라줄기 조직. KEGG 경로와 관련된 모든 표현된 성적표는 보충 파일(S4 데이터 세트)에 나열되어 있습니다. C. Deserticola와 벼(S5 데이터 세트)와 같은 다른 식물 사이에는 몇 가지 크게 변경된 경로가 있지만, 이 연구의 주요 목표는 C. Deserticola 줄기의 전체 전사체 프로파일을 밝히고 PhGs 생합성의 관련 경로를 그림으로 그리는 것입니다. 재배를 안내하는 데 유용할 수 있습니다.

리그닌 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 후보 유전자

리그닌은 식물계에서 두 번째로 풍부한 천연 육상 고분자로, 식물 세포벽에서 발견되는 물질의 최대 1/3을 구성합니다. 세포벽의 중요한 구성 요소인 리그닌은 물 수송을 돕고 기계적 지지와 구조적 완전성을 제공하며 병원균과 초식 동물로부터 방어합니다. 리그닌의 이러한 역할은 사막에서 C. Deserticola의 지하 직립 성장을 지원하는 데 매우 중요합니다. 이 연구에서 우리는 리그닌 단량체가 수산화, 메틸화, 환원 및 산화 중합 과정을 포함한 일련의 효소 반응을 통해 페닐알라닌으로부터 생합성되는 C. Deserticola의 리그닌 생합성 경로에 대한 완전한 그림을 제시했습니다(그림 3). 리그닌 생합성 관련 효소는 혈관 조직에서 주로 합성된 세 가지 형태(p-hydroxyl-phenyl(H), guaiacyl(G) 및 syringyl(S) 리그닌)과 5-hydroxyl-guaiacyl 리그닌에서만 검출되었습니다. COMT(카페산 3-O-메틸트랜스퍼라제, EC 2.1.1.68) 결핍(예: 녹다운) 식물에서.

페닐알라닌 암모니아 분해효소(PAL, EC 4.3.1.24)는 비산화성 탈아민화에 의해 페닐알라닌을 계피산으로 변환하는 리그닌 생합성 경로(그림 3)의 첫 번째 핵심 효소입니다. 총 6,297개의 PAL 판독이 서열화되었고 7개의 PAL 전사체가 C. Deserticola에서 조립되었습니다(표 5). 서열 유사성 비교를 통해 그 중 4개(comp28550_c1_seq1/2/3/5)가 C. Deserticola의 알려진 mRNA 서열(gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), comp28550_c1_seq4와 comp25940_c0_seq1은 각각 77%와 82% 유사성을 보였습니다. ORF 예측은 5개의 전사체가 단백질을 코딩할 가능성이 있고 방향족 아미노산 분해효소 도메인(PF00221.14)과 함께 운반되는 것으로 나타났습니다. 그 중에서 comp28550_c1_seq4 전사체만이 718개 아미노산 잔기로 구성된 완전한 단백질 서열을 암호화할 수 있었습니다. PAL은 Arabidopsis thaliana 4개, Populus trichocarpa 5개, Scutellaria baicalensis 3개, Cucumis sativus 7개 등 대부분의 식물 종에서 작은 다중 유전자 계열에 의해 암호화되는 것으로 보고되었습니다. 우리의 계통발생 분석에서는 4개가 있는 것으로 나타났습니다. C.의 PAL 코딩 유전자.

Deserticola를 사용하여 각각 CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 및 CdPAL4로 명명했습니다(S2 그림). 4-쿠마레이트-CoA 리가제(4CL, EC 6.2.1.12) 및 트랜스-신나메이트 4-모노옥시게나제(CYP73A, EC 1.14.13.11)는 두 가지 역방향으로 신남산을 디쿠마롤-CoA로 변환하는 두 가지 효소입니다. 명령. 그들은 또한 백본에 있으며 그들의 표현 FPKM 값은 각각 39.57과 51.93입니다.

네 가지 유형의 리그닌은 세 가지 주요 효소인 신나모일-CoA 환원효소(CCR, EC 1.2.1.44), 시키메이트 o-히드록시신나모일전이효소(HCT, EC 2.3.1.133) 및 페룰레이트에 의해 제어되는 다양한 경로에 의해 생합성되었습니다.{1{ {56}}}}하이드록실라제(F5H, EC 1.14.-.-). CCR은 X-CoA(디쿠마롤, 카페오일, 페룰로일, 5-하이드록실-페룰로일 및 시나포일을 포함하는 X)를 Y-알데히드(p를 포함하는 Y)로 촉매작용하는 리그닌 경로[50, 51]의 제어점으로 보고되었습니다. -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl 및 snap), 반면 HCT는 p-coumaroyl-CoA를 p-coumaroyl shikimic acid/p-coumaroyl quinic acid로 촉매했습니다. 스위치와 마찬가지로 두 효소는 P-히드록실-페닐 리그닌 또는 다른 세 가지 유형의 리그닌의 생합성을 조절했습니다. F5H는 syringyl 리그닌과 5-hydroxyl-guaiacyl 리그닌을 조절하는 또 다른 가지 스위치였습니다. 카페인산 3-O-메틸트랜스퍼라제(COMT, EC 2.1.1.68), 카페오일-CoA O-메틸트랜스퍼라제(CCoAOMT, EC 2.1.1.104) 및 신나밀-알코올 탈수소효소(CAD, EC 1.1.1.195)를 포함한 기타 중요한 효소 )도 표현된 것으로 나타났다. 자세한 발현 정보는 표 6에 나열되어 있습니다. 이 연구에서 확인된 이러한 효소 유전자는 이 중요한 약용 식물의 기능적 게놈 연구를 위한 귀중한 자원을 제공할 것입니다. 표 6의 리그닌 생합성 경로와 관련된 10개의 유전자를 RT-qPCR 검증을 위해 선택하여 RNAseq 결과를 확인했으며(그림 4), 높은 상관 관계(Pearson 상관 계수: 0.90343)는 전사체 분석의 높은 정확도와 재현성을 나타냅니다. S1 데이터세트에는 이 분석에 사용된 프라이머 서열이 나열되어 있습니다.

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

PhG의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 후보 유전자

페닐에타노이드 배당체(PhGs)는 성기능 개선, 자유 라디칼 제거 및 노화 방지 활동을 하는 C. Deserticola의 주요 활성 성분으로 알려져 있습니다. PhG의 세 가지 화학 성분은 유기산, 당류 및 페닐에탄올 아글리콘입니다(그림 3). 카페인산, 페룰산, 쿠말산을 포함한 유기산은 페닐프로파노이드 생합성 경로의 산물입니다. 포도당과 람노스를 포함한 당류의 성분은 전분과 자당 대사, 아미노당과 뉴클레오티드당 대사, 과당과 만노스 대사 등 탄수화물 대사 경로의 산물이다. 그러나 페닐에탄올 부분의 ​​생합성 경로는 아직 명확하지 않다. 여기에서 우리는 서열 데이터를 기반으로 두 가지 가능한 페닐에탄올 생합성 경로를 제안했습니다. 하나는 리그닌 생합성 백본 경로와 유사한 신남산 경로로도 알려진 보고된 카페인산 또는 페룰산 경로입니다. 또 다른 하나는 페닐알라닌 대사 경로(그림 3)를 기반으로 하며, 페닐알라닌에서 페닐에탄올로의 전환은 1세기 전 효모에서 처음 발견되고 피튜니아 꽃, 토마토 및 장미에서 검증된 알려진 'Enrlich 경로'에 의해 달성되었습니다. 페닐알라닌을 페닐에탄올로 전환시키는 역할을 하는 아스파르테이트/티로신 아미노트랜스퍼라제, 히스티딘-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 및 1차 아민 산화효소를 코딩하는 4가지 효소 유전자가 C. Deserticola의 줄기에서 발현되는 것으로 검출되었습니다. 페닐 에탄올의 생성물은 모노옥시게나제에 의해 추가로 산화되거나 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화되어 PhG 생합성에 참여하는 유도체(페닐 에탄올 아글리콘)가 될 수 있습니다. 요약하면, 페닐에탄올 아글리콘의 두 가지 추정 생합성 경로가 제안되었습니다.C.데데티콜라하지만 아직 더 많은 연구가 필요합니다.

토론

최근 차세대 염기서열 분석 기술의 적용으로 식물 유전체학이 급속히 발전하고 있는 반면, 사막 약용 식물의 유전체학에 초점을 맞춘 연구는 거의 없었다. 가뭄과 염분 환경에 대한 적응과 주요 생리 활성 성분의 생합성 경로를 이해하기 위해 게놈 또는 전사체 연구를 수행하는 것이 시급히 필요합니다. 일부 의료 식물에 대한 새로운 전사체 발견,

Panax 인삼, 은행나무 및 Glycyrrhiza uralensis와 같은 식물은 긴 읽기 길이 때문에 Roche 454 플랫폼을 사용하여 처음으로 활용되었습니다. 짧은 읽기, 특히 페어드 엔드 읽기의 장점을 갖춘 효과적인 조립 능력으로 인해 Illumina 기반 전사체 시퀀싱 및 조립은 모델 및 비모델 유기체에도 광범위하게 사용되었습니다. 현재 연구에서 우리는 약 8G의 101bp 쌍방향 읽기를 생성하고 평균 길이가 725bp인 더 긴 고유 유전자 서열을 생성했습니다. 대규모 줄기 특이적 전사체 데이터는 유용한 참조 데이터를 제공할 수 있으며 C. Deserticola의 생리활성 성분의 2차 대사를 채굴하는 데 사용될 수 있습니다. 어셈블리 전에 엄격한 품질 필터(어댑터 트리밍 및 저품질 읽기 폐기 포함)를 통과한 총 원시 읽기의 81.62%가 있어 시퀀싱 데이터의 품질이 높음을 시사하며 고품질 읽기의 82.08%가 어셈블리에 유용했습니다. 어셈블리에 사용되지 못한 다른 읽기는 시퀀싱 오류, 어셈블리 매개변수 등으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 사용되지 않은 고품질 읽기는 향후 다른 플랫폼(예: Roche 454)의 더 긴 읽기와 결합하여 de novo 어셈블리를 개선하는 데 여전히 도움이 되었습니다.

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

다수의 조립된 전사체(30,098개)는 공개 데이터베이스에 있는 알려진 유전자와 높은 서열 유사성을 나타냈으며, 이는 우리의 Illumina 기반 페어드 엔드 데이터가 C. Deserticola 전사체의 상당 부분을 다루었음을 시사합니다. BLAST 히트가 없는 성적표는 3' 또는 5' 번역되지 않은 영역, 비코딩 RNA 또는 C. Deserticola의 새로운 유전자 서열로 인한 것일 수 있습니다. 발현된 전사체에는 광범위한 GO 카테고리 및 KEGG 경로(표 3 및 4)에 주석이 달렸으며, 여기서 많은 전사체는 2차 대사 관련 경로에 할당되었습니다. 우리가 알고 있듯이, 페닐프로파노이드는 지하 생활 방식에 큰 도움이 되는 유도성 항균 화합물로 기능할 수 있으며 [1] 약학적 유용성 외에도 식물-미생물 상호 작용에서 신호 분자 역할을 할 수 있습니다 [68, 69]. 테르페노이드는 생리활성 성분(예: 6- deoxycatalpol)의 생합성에 사용됩니다[70]. 우리는 페닐프로파노이드 및 테르페노이드 백본 생합성 경로에 관여하는 유전자가 C. Deserticola에 매우 풍부하다는 것을 발견했습니다. 더 중요한 것은 잘 알려진 리그닌 생합성 경로의 발견(그림 3)은 C. Deserticola 줄기에서 리그닌의 활성 대사 과정을 나타냅니다. 리그닌의 생합성에 관여하는 모든 알려진 효소 유전자(그림 3)가 발현된 것으로 검출되었으며, PAL, CCR, HCT 및 F5H를 포함한 4가지 주요 효소는 리그닌과 비교하여 발현 풍부도가 낮았습니다(각각 FPKM 26.47, 3.89, 3.4 및 3.83). 다른 효소 유전자(표 6). 이 세 가지 유전자의 발현 변화가 C. Deserticola의 리그닌 생산에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 추가 연구의 가치가 있습니다. PAL은 리그닌 생합성의 핵심 효소이며 페닐프로파노이드, 레스베라트롤, 플라보노이드 및 쿠마린의 생합성에도 관여합니다 [71-74]. 우리는 C. Deserticola 게놈(S2 그림)에서 4개의 서로 다른 PAL 유전자를 발견했는데, 이는 PAL이 작은 다중 유전자 계열에 의해 암호화된 것과 일치하며[39, 43, 45-49], 이것이 대사 탄소 플럭스에서 중요한 역할을 할 수 있음을 추가로 입증했습니다. .

PhG는 C. Deserticola의 주요 활성 성분입니다. 페닐에탄올의 생합성에 관여하는 유전자는 C. Deserticola의 품질에 중요합니다. 우리는 C. Deserticola 줄기에서 PhG 생합성에 관여하는 페닐 에탄올과 17개의 효소 유전자의 두 가지 다른 생합성 경로를 추론했습니다. 가능한 카페인/페룰산 공정(그림 3)은 또한 중간체의 구조식과 해당 효소의 촉매 특성을 기반으로 처음으로 추론되었으며, 여기서 카페인/페룰산은 먼저 페닐피루베이트 유도체로 산화됩니다. 그런 다음 카르복실기는 탈탄산효소에 의해 제거되었습니다. 마지막으로 알데히드 그룹은 탈수소효소에 의해 알코올 그룹으로 다시 전환되었습니다. 이는 C. Deserticola의 전체 전사체를 조사하고 참조 게놈 없이 RNA-seq 읽기를 조립하기 위해 Illumina 페어드 엔드 시퀀싱 기술을 최초로 적용한 것입니다. 본 연구는 향후 C. Deserticola의 기능유전체학 및 단백질체학 연구에 유용한 자료와 유전자 염기서열을 제공할 것이다.

결론

본 연구에서 우리는 높은 처리량의 시퀀싱 데이터를 기반으로 C. Deserticola 줄기의 전사체를 프로파일링하고, 리그닌의 생합성 경로에 관여하는 유전자를 식별했으며, 또한 처음으로 PhG의 잠재적 생합성 경로를 추론했습니다. 이는 확실히 이해를 가속화할 것입니다. 모호한 생리학적 과정과 분자 수준의 뛰어난 의학적 가치에 대해 설명합니다. 현재까지 이는 C. Deserticola 줄기의 전체 전사체를 새롭게 조립하고 Illumina 기반 시퀀싱 데이터 세트를 사용하여 의약 성분의 생합성 경로를 감지하려는 첫 번째 시도입니다. 우리의 연구는 천연 의약품의 개발과 약용 특성을 지닌 품종의 선택을 촉진할 수 있습니다.

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%