스트렙토마이세스의 생리활성 물질을 이용한 다기능 화장품 크림 개발

람 하리 다할1 , 투안 만 응우옌1,2, 심동섭3, 김준영4, 이장율4 그리고 김재수1,*

추상적인:단일 기능을 갖는 다양한 화장품의 사용이 증가하고 있지만, 다기능 활성을 갖는 화장품은 여전히 ​​제한적이다. 를 가진 다기능 화장품 크림 개발을 목표로 하고 있습니다.항산화제, 안티 티로시나제, 노화 방지 및 항균 활성. 항균 활성은 디스크 확산법으로 수행하였다. 세포 독성 및 세포 증식은 96-HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1 및 B16F10과 같은 다른 세포주를 사용하는 웰 플레이트에서 평가되었습니다. 버섯 티로시나제 억제, 엘라스타제 억제 및 1,{11}}디페닐{12}}피크릴히드라질(DPPH) 라디칼 소거 활성을 평가하고 IC50을 계산했습니다. 메조포러스 실리카 입자는 Pluronic P123과 TEOS(tetraethyl ortho-silicate)를 사용하여 합성되었습니다. 얼굴 사진은 VISIA-CR(Facial Imaging System for Clinical Research)로 캡처되었습니다. 이미지의 거칠기는 PRIMOS 소프트웨어로 분석하고 이미지의 밝기는 Chromameter CR{17}}로 분석했습니다. 균주 T65의 조 생성물은 Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus epidermidis와 같은 다양한 인간 병원성 박테리아를 억제했습니다. 버섯 티로시나아제, 엘라스타아제 및 DPPH 라디칼 소거 활성에 대한 T65 조 생성물의 IC50은 각각 58.73, 14.68 및 6.31 ug/mL이었다. T65 조 생성물은 250pg/mL에서 CCD{28}}Sk 세포에서 콜라겐 유형 I을 최대 145.91% ± 9.11%(평균 ± SD, 평균 24, 48, 72시간) 증식했습니다. 합성 메조포러스 입자(SBA-15)는 3일 동안 제어 방출하여 지속 가능한 성능을 확인했습니다. T65 함유 SBA{40}}를 함유한 제형화된 기능성 화장품 크림은 도포 4주 후 피부 거칠기를 4.670%, 피부 밝기를 0.472% 증가시켰습니다. T65 조 생성물은 그람 양성 및 그람 음성 병원체를 모두 억제했습니다. 합성 메조포러스 입자인 SBA{49}}는 생리 활성 물질이 지속 방출 상태로 방출됨을 확인했습니다. T65 조 생성물은 완벽한 항균성을 나타내었고,항산화제, 인체 피부와 관련된 다양한 세포주에 세포독성이 없는 항노화, 미백 작용을 합니다.

키워드: 항산화제; 세포독성; 항티로시나제; 노화 방지; 항균제; 메조포러스 실리카 입자; 코스메슈티컬 제형; 미적 응용

cistanche 잃어버린 제국 허브또한 가지고있다피부 미백 효과.

1. 소개

피부는 인체의 가장 큰 기관이자 외피입니다. 피부의 시각적 외양을 통해 나이, 성별, 건강, 매력, 아름다움을 추정할 수 있습니다[1,2]. 화장품은 피부의 외관을 개선하고 피부 노화를 줄이기 위해 광범위하게 사용됩니다. 또한, 화장품의 국소 적용은 얼굴 대비와 관련된 아름다움의 요소를 조작하여 매력을 증가시키는 방법을 보여줍니다[3,4]. 화장품 산업은 스킨케어 접근 방식을 개선하기 위해 코스메슈티컬 제형에 대한 노화 방지, 항산화, 항티로시나제 및 항균 특성을 지닌 새롭고 천연적인 생리 활성 물질을 끊임없이 찾고 있습니다[5,6].

피부 노화는 생리적 기능 장애와 피부의 구조적 완전성의 상실을 초래하는 다양한 내적 및 외적 요인에 의해 야기되는 복잡한 생물학적 과정입니다. 일반적으로 피부의 자연적 노화(시간적 노화)라고 하는 내적 노화는 나이에 따른 호르몬 변화와 관련이 있는 반면, 외적 노화는 근육의 움직임, 공해, 니코틴, 태양광 노출, 카페인, 온도, 생활 습관 등의 생활 방식과 관련이 있습니다. 식이(영양), 수면 부족, 스트레스 및 기타 건강 상태[7-9]. 엘라스틴은 운동 후 피부가 원래 위치로 돌아오도록 돕는 반면, 포상세포에서 생성되는 엘라스타제는 엘라스틴을 분해하여 피부 노화를 유발한다[9]. 항엘라스타제는 엘라스타제를 억제하고 엘라스틴을 초기 상태로 유지하여 피부 노화를 방지합니다. 노화 방지 특성이 있는 화장품 또는 스킨케어 제품은 피부 노화에 긍정적인 영향을 미칩니다[10-13].

자유 라디칼은 일반적으로 세포 대사 중에 생성됩니다. 음이온 라디칼, 슈퍼옥사이드, 과산화물, 하이드록실 라디칼, 산화질소(NO), 퍼옥시나이트라이트 및 차아염소산과 같은 반응성 산소종(ROS) 및 반응성 질소종(RNS)은 세포, 지질, 단백질, 및 DNA, 죽상 동맥 경화증, 발암, 심혈관 질환, 세포 노화, 만성 염증, 당뇨병, 고혈압, 돌연변이 유발, 신경 퇴행, 류마티스 관절염, 뇌졸중, 패혈성 쇼크 및 기타 퇴행성 질환으로 이어진다 [7,14-17]. 산화 방지제는 산화 스트레스와 싸워 정상 조직에 대한 자유 라디칼 손상을 줄일 수 있는 단백질의 산화와 ROS 및 RNS의 생성을 방지합니다[17-19].

피부는 멜라닌으로 알려진 어두운 색소를 생성합니다. 멜라닌의 생성은 피부가 UV로 인한 손상을 방지하는 것을 방지합니다[9]. 그러나 멜라닌의 과잉 생산과 축적은 피부 과색소침착을 유발하여 기미, 주근깨, 노인성 흑점, 모반, 마름병과 같은 심미적 합병증을 유발한다[9,20]. 티로시나아제는 멜라노솜의 막에서 발견되는 당단백질로, l-티로시나아제가 3,{6}}디하이드록시페닐알라닌(l-DOPA)으로 수산화되고 l-DOPA가 도파퀴논으로 후속 산화되어 멜라닌 생합성을 담당합니다[21]. 자발적 중합으로 인해 도파퀴논은 최종적으로 멜라닌으로 전환됩니다[22]. 과잉 생성된 멜라닌은 피부 무결성을 유지하기 위해 조절되어야 합니다. 이것이 코스메슈티컬 제형 개발을 위한 새로운 티로시나제 억제제의 발견이 상당한 관심을 받는 이유이다[23-25].

항균 방부제는 화장품에 사용되는 전체 기간 동안 미생물학적 순도를 유지하기 위해 첨가됩니다[26]. 메틸파라벤과 같은 화장품 방부제를 사용하는 대신 다른 기능을 가진 천연 항균 화합물이 인체 건강에 더 좋고 유익합니다[27-29]. 박테리아 자원에서 분리된 이차 대사 산물은 피부에서 박테리아 병원체(Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus)의 집락화를 억제하는 방부 및 항균 특성을 모두 가질 수 있습니다[9,26,28].

토양 또는 해양 박테리아, 특히 악티노박테리아에 의해 생성되는 생리활성 화합물은 아직 개발되지 않았으며 아직 탐사되지 않았습니다[23,30]. 노화방지, 항산화, 항티로시나제, 항균 및 비세포독성 특성을 포함하여 코스메슈티컬 및 화장품 산업에 적용할 수 있는 다양한 생리활성 화합물은 새로운 용도에 대한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

현재 cosmeceutical 제제에 사용되는 식물에서 분리된 생리활성 물질에 대한 많은 연구가 있지만 박테리아의 생리활성 물질에 대한 연구는 거의 없습니다[9,21,24-27,31]. 이 연구는 박테리아 균주 Streptomyces sp. 항산화, 노화 방지, 항티로시나제, 항균 활성 및 다양한 마우스 및 인간 세포주에 대한 세포독성 효과에 대한 T65. 또한, 우리는 메조포러스 실리카 입자를 합성하는 것을 목표로 하였다. 마지막으로, 본 연구의 주요 목표는 토양 미생물에서 추출한 생리활성 물질을 사용하여 국소 적용을 위한 최종 화장품을 개발하는 것이었다.

2. 재료 및 방법

2.1. 시약, 세포주 및 장비

사용된 모든 용매는 분석 등급이었습니다. B16-F10 흑색종 세포주, B16-F1 마우스 흑색종 세포주 및 인간 각질 세포주(HaCaT)는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형 이글스 배지(DMEM), 페니실린-스트렙토마이신 및 열 불활성화된 소 태아 혈청(HI FBS)은 Gibco(Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., 서울, 한국)에서 구입했습니다. Cell Counting Kit-8(CCK{7}})는 Dojindo(Kumamoto, Japan)에서 구입했습니다. 마우스 대식세포 세포주 RAW264.7 및 CCD{10}}Sk 인간 섬유아세포는 한국 세포주 은행(한국 서울)에서 구입했습니다. 지질다당류(LPS, 대장균, 혈청형 ​​O11:B4), 설파닐아미드, 나프틸 에틸렌디아민 디하이드로클로라이드, 버섯 티로시나제, 돼지 췌장 엘라스타제, l-티로신, 아스코르브산, 알부틴, N-Succ-(Alide6}la){1 , 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,{23}}디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT), 콜라겐 유형 I, 트윈 20, 테트라메틸벤지딘(TMB ), 테트라에틸 오르토-실리케이트(TEOS), 플루로닉 P-123(폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜); PEG-PPG-PEG) 및 -멜라닌 세포 -자극 호르몬(-MSH)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 1,{38}}디페닐{39}}피크릴히드라질(DPPH) 및 올레아놀산은 Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. COL1A1(콜라겐, 유형 I, 알파 1) 1차 항체 및 HRP(Horseradish peroxidase)와 접합된 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했습니다. SpectraMax 340PC384 Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)는 96-웰 플레이트 판독에 사용되었습니다.

2.2. 병원성 박테리아 균주

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 및 Pseudomonas aeruginosa KACC 10185는 한국농업문화원(KACC, 전주, 한국)에서 구입했습니다. Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234 및 Staphylococcus aureus KEMB 7301-069는 한국환경미생물은행(KEMB, 한국 수원)에서 입수했습니다. 프로피오니박테리움 아크네스 KCTC 3314는 한국형 배양 컬렉션(KCTC, 한국 정읍)에서 구입했습니다.

2.3. 격리 및 보존

화성의 매립초지(37◦16'10" N 126◦45'43" E)와 한국의 경기대학교 산림(37◦18'1" N 127◦2'20" E)에서 다양한 토양 시료를 채취하였다. 박테리아는 이전에 설명된 방법을 사용하여 분리되었습니다[9]. 콜로니는 단기 보존을 위해 1주마다 R2A 플레이트에 줄무늬를 긋고 장기 보존을 위해 20%(v/v) 글리세롤이 보충된 R2A 국물에 현탁액으로 -80℃에서 보관했습니다.

2.4. 분리된 균주의 스크리닝, 식별 및 계통 발생 위치

분리된 균주의 화장품 및 항균 활성에 대한 스크리닝은 앞서 설명한 대로 완료되었습니다[9]. 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 이용하여 기능을 갖는 박테리아를 동정하였다. InstaGene Matrix 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 균주의 게놈 DNA를 추출하고 범용 박테리아 프라이머 27F 및 1492R을 사용하여 PCR에 의해 16S rRNA 유전자를 증폭하였다[32]. PCR 산물을 멀티스크린 필터 플레이트(Millipore Corp., Bedford, MA, USA)로 정제하고 BigDye Terminator 사이클 시퀀싱 키트 v.3.1(Applied Biosystems, Foster City, 캘리포니아, 미국). SeqMan 소프트웨어(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)를 준수하는 거의 완전한 서열. 분리된 기능성 균주의 가장 가까운 균주는 EzBioCloud[33]와 NCBI GenBank 데이터베이스[34]를 사용하여 식별되었습니다. 관련 16S rRNA 염기서열은 GenBank에서 얻었고, 계통발생학적 분석은 MEGA7을 이용하여 이루어졌다[35].

2.5. 박테리아의 배양

P. 아크네스는 Schaedler 혐기성 배지(Oxoid)에서 3-4일 동안 37℃에서 혐기성 배양에 의해 배양되었다. 혐기성 배양을 위해 GasPak EZ Gas Generating Container System(Becton Dickinson, NJ, USA)이 있는 BBL 혐기성 용기를 사용했습니다. S. epidermidis와 S. aureus는 TSB(Tryptic soy broth) 배지(Oxoid)에서 37℃에서 24시간 동안 호기성으로 배양되었다. E. coli, P. aeruginosa 및 B. subtilis를 LB(Luria-Bertani)(Oxoid) 배지에서 배양하였다. 분리된 박테리아 균주는 28℃에서 4-5일 동안 R2A에서 배양되었습니다.

2.6. 발효

발효 과정을 위해 접종물은 28 oC의 R2A 국물에서 오후 150시에 4-5일 동안 준비되었습니다. T65 균주는 ISP2(International Streptomyces Project 2) 배지에서 1-2% 접종물을 사용하여 오후 140시에 28ºC에서 1주일 동안 발효되었습니다.

2.7. 추출

수확된 배양액은 1736R의 대용량 원심분리기(LABOGENE, Seoul, Korea)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 11,305×g에서 원심분리하였다. 배양 상등액을 150mm 크기의 여과지(Whatman 1001-150, GE Healthcare, Maidstone, UK)로 여과하여 세포 파편을 제거하고 회전 증발기로 40℃에서 농축시켰다. 농축된 조 생성물을 5가지 상이한 용매(n-헥산, 디-에틸 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름 및 에틸 아세테이트)를 사용하여 동일한 부피로 2회 추출하였다. 에틸 아세테이트가 가장 좋은 용매로 밝혀졌으며 에틸 아세테이트 추출물을 사용하여 추가 분석을 수행했습니다. 유기층을 분리 깔때기로 분리하고 증발 건조시켰다. 마지막으로, 추가 평가를 위해 건조된 조 생성물을 메탄올에 용해시켰다.

시스탄체 추출물

2.8. 분취용 HPLC(Prep-HPLC)에 의한 활성 분획 수집

분취용 HPLC(Agilent 1200 시리즈)를 사용하여 T65의 조 배양 추출물의 활성 분획을 수집했습니다. 15μm 입자 크기를 갖는 Shim-pack-PREP-ODS(K) C18 역 컬럼(30mm id × 25cm)을 고정상으로 사용했습니다. 이동상의 경우 0.1% HCHOOH 물(용매 A)과 아세토니트릴(용매 B)이 사용되었습니다. 용매 B 농도는 0분에서 60분까지는 10%에서 100%, 60분에서 75분까지는 100%를 사용하였다. 유속은 15mL/분이었다. MWD(Multi-wave Detector)는 208, 230, 254 및 280 nm에서 사용되었습니다. 14분에서 21분 사이에 수집된 분획을 증발 건조시키고 추가 평가를 위해 메탄올(T65 조 생성물)에 용해시켰다.

2.9. HaCaT 세포의 세포 생존율

HaCaT 세포의 세포 생존율은 제조업체의 지침에 따라 CCK{0}}(Cell Counting Kit{1}}) 분석으로 결정되었습니다. HaCaT 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 104개 세포로 시딩한 다음 10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 Dulbecco의 변형된 이글스 배지(DMEM)에서 37℃에서 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 다양한 농도의 T65 조 생성물(10mg/mL, 1mg/mL, 100ug/mL, 10ug/mL, 1ug/mL, 100ng/ml 및 1ng/mL)로 처리하고 인큐베이션했습니다. 10μL의 CCK{19}} 시약을 첨가하여 5% CO2를 포함하는 가습된 대기에서 실온에서 2시간 동안 반응 혼합물의 흡광도를 450 nm에서 마이크로플레이트 분광광도계로 측정하고 세포 생존율의 백분율을 계산했습니다.

2.10. 항산화 활성 평가

2.10.1. RAW264.7 세포의 독성 평가

RAW264.7 세포를 1{13}}% FBS, 100U/mL의 페니실린, 100ug/mL의 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에서 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 유지했습니다. RAW264.7 세포를 웰당 104개 세포의 밀도로 {{10}웰 평평한 바닥 미세역가 플레이트에 다양한 농도(0~1mg/mL)의 T65 조 생성물과 함께 시딩하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션했습니다. h 5% CO2 인큐베이터에서. 24시간 배양 후 PBS(phosphate-buffered saline)로 세포를 두 번 세척하고 190μL의 신선한 배지와 10μL의 MTT working solution(5mg/mL)을 각 웰에 첨가한 후 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 37 ºC. 그런 다음, 상층액을 제거하고 형성된 포르마잔 결정을 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 10분 동안 각 웰에 150μL의 DMSO(디메틸 설폭사이드)를 첨가하여 용해시켰다. 용해된 포르마잔 결정의 강도는 570 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 정량화되었습니다.

2.10.2. 산화질소 측정

RAW264.7 세포(105 cells/mL)를 30분 동안 다양한 농도의 T65 조 생성물(15.5-125 ug/mL)로 전처리한 후 24시간 동안 1 ug/mL LPS로 자극했습니다. 세포에서 방출되는 NO의 농도는 NO2-[36]의 표준 곡선을 사용하여 Griess 시약에 의해 결정되었습니다. 100 마이크로리터의 배양 상층액을 100 μL의 Griess 시약(N-1-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride(NEDHC)과 sulfanilamide의 혼합물)과 함께 실온에서 어두운 곳에서 20분 동안 배양했습니다. 흡광도는 540 nm에서 측정되었습니다.

2.10.3. DPPH 자유 라디칼 소거 분석

DPPH 자유 라디칼 소거 활성은 이전에 설명한 방법에 따라 수행되었습니다[9]. T65 배양 추출물의 조 생성물을 메탄올에서 농도 6{9}}0, 200, 100, 20 및 4 ug/mL로 희석했습니다. 180 μL의 반응 혼합물은 90 μL의 0.1 mM DPPH(MeOH에 용해됨) 및 90 μL의 다양한 농도의 샘플 용액으로 제조되었습니다(표 S1). 테스트 반응을 96-웰 플레이트에서 완전히 혼합하고 37℃에서 30분 동안 배양하고 분광 광도계를 사용하여 516nm에서 흡광도를 측정했습니다. DPPH 억제의 백분율은 다음과 같이 계산되었습니다:

억제(백분율)=[1 - (ODexp - ODcon) / (ODstd - ODbln)] × 100 (1)

여기서 ODexp는 실험 샘플의 흡광도입니다. ODcon은 대조군의 흡광도입니다. ODstd, 표준 흡광도; 및 ODbln, 블랭크의 흡광도.

2.11. 노화방지 활동 평가

2.11.1. CCD-986Sk 세포의 세포독성 평가

인간 피부 섬유아세포(CCD-986Sk)에서 T65 조생성물의 다양한 농도(0–1 mg/mL)의 세포 독성은 RAW264.7의 MTT 분석에 대해 이전에 설명한 대로 MTT 분석에 의해 결정되었습니다. 세포.

2.11.2. CCD-986Sk 세포를 사용한 인간 섬유아세포 증식

CCK{1}} 분석을 사용하여 CCD0}Sk 세포에서 인간 진피 섬유아세포(HDF) 세포 증식을 측정했습니다. CCD-986Sk 세포를 96-웰 플레이트에 5 × 103개 세포/웰로 시딩한 다음 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 37℃에서 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 다양한 농도의 T65 조 생성물(0~1mg/mL)로 처리하고 10μL의 CCK{16}} 시약을 첨가하여 5% CO2를 포함하는 습한 분위기에서 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. 반응 혼합물의 흡광도를 450 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 측정하고, 미처리 세포의 흡광도와 비교하여 생존 세포의 백분율을 결정하였다.

Cistanche는 노화 방지입니다.

2.11.3. 콜라겐 유형 I 합성 분석

콜라겐 유형 I 합성은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 분석되었습니다. CCD-986Sk 세포를 10% FBS를 함유한 DMEM에서 5 × 103 cells/well의 밀도로 96-웰 플레이트에 파종하고 37 ◦에서 배양했습니다. C에서 24시간 동안 다양한 농도의 T65 조 생성물(31.25–25{{3{33}}}} pg/mL)을 FBS가 없는 배지에 24시간 동안 첨가했습니다. 그런 다음 1{35}}0 μL의 배양 배지와 콜라겐 유형 I을 콜라겐이 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가하고 37℃에서 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양했습니다. 각 웰을 0.1% 트윈 20(PBST)이 포함된 0.05% 인산염 완충 식염수로 세척하고 COL1A1 1차 항체를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 다시, 웰을 0.05% PBST로 세척하고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 이차 항체를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 0.05% PBST로 세척하고, TMB(테트라메틸벤지딘)를 첨가하였다. 원하는 색 강도(청색)를 얻은 후 0.5N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시켰고 용액의 색이 노란색으로 변하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 측정하였고, 콜라겐 타입 I 생성을 측정하였다.

2.11.4. 엘라스타제 억제 분석

돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 억제 활성은 이전에 설명된 절차에 따라 분석되었습니다[9]. T65 조 생성물을 메탄올에서 3{6}}{{1{11}}}}0, 1{23}}00, 500 및 100ug/mL의 농도로 희석했습니다. 반응 혼합물은 0.2M Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 기질로 0.5mM N-Succ-(Ala){15}}p-nitroanilide(SANA), 돼지 췌장 엘라스타제(3.5U/mL in 0.2 M Tris-HCl 완충액, pH 8.0) 및 억제제(샘플). 각 샘플은 37℃에서 15분 동안 사전 배양되었고, 전체 반응 혼합물은 37℃에서 20분 동안 배양되었습니다. 흡광도는 400 nm에서 측정되었다. 150 μL의 총 반응 혼합물을 표 S2에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 반응 혼합물에서 샘플의 최종 농도는 300, 100, 50 및 10 ug/mL였습니다. PPE 억제율은 식 (1)을 사용하여 계산하였다.

2.12. 미백 활성 평가

2.12.1. B16F1 세포의 세포독성 평가

B16F1 흑색종 세포에 대한 T65 조 생성물의 세포독성을 MTT 검정에 의해 결정하였다. B16F1 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1{11}4개의 세포로 시딩한 다음 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 37℃에서 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 다양한 농도의 T65 조 생성물(0–1 mg/mL)로 처리하고 5% CO2를 포함하는 습한 대기에서 실온에서 2시간 동안 배양했습니다. 반응 혼합물의 흡광도를 450 nm에서 마이크로플레이트 분광광도계로 측정하고 세포 생존율의 백분율을 계산했습니다.

2.12.2. B16F10 세포에서 멜라닌 합성 억제

B16F10 세포를 웰당 105개 세포로 6-웰 플레이트에서 -MSH로 전처리하고 멜라닌 합성을 촉진하기 위해 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 37℃에서 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 48시간 동안 -MSH의 존재 또는 부재 하에 양성 대조군으로서 다양한 농도의 T65 조 생성물(31.25-125 ug/mL) 및 100 ug/mL의 알부틴과 함께 배양하였다. B16F10 흑색종 세포에서 멜라닌 합성 억제가 관찰되었다.

Cistanche는 멜라닌 형성을 억제합니다.

2.12.3. 버섯 티로시나제 억제 분석

버섯 티로시나제 억제 활성은 이전에 설명한 대로 결정되었습니다[9]. T65 조 생성물을 메탄올에서 3{6}}00, 1000, 500 및 100ug/mL의 농도로 희석했습니다. 반응 혼합물은 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 6.8), 3mM l-티로신 용액[DW(증류수)에 용해] 및 2000U/mL 버섯 티로시나아제(0.05M 인산칼륨 완충액에 용해, pH 6.8)로 제조하였다. ; Sigma) 96-웰 플레이트에서. 150 μL(120 μL 인산염 완충액, 10 μL l-tyrosine, 15 μL 시료 용액, 5 μL 버섯 티로시나아제; 표 S3)의 총 시험 혼합물을 37℃에서 10분 동안 배양하고 475 nm에서 흡수를 측정했습니다. 반응 혼합물에서 샘플의 최종 농도는 300, 100, 50 및 10 ug/mL였습니다. 표준은 샘플 용액이 없었고, 대조군은 l-티로신이 없었고, 블랭크는 l-티로신과 샘플 용액이 없었습니다. 티로시나아제 저해율은 식 (1)을 적용하여 계산하였다.

2.13. 아미노산 분석

T65 조생성물의 유리아미노산은 한국고분자시험연구원(Koptri)에서 GC-FID(gas chromatography –flame ionization Detector)법으로 측정하였다. GC-FID 방법의 경우 사용된 기계는 Agilent 6890N GC-FID입니다. 컬럼, ZB-AAA(10m × 0.25mm); 사출 부품 온도, 250℃; 주입 컬럼, 2 μL; 분할 비율, 5:1; 온도 조건, 110ºC → 32ºC/min → 320ºC; 검출기, FID @ 320 ºC; 담체, 질소 가스, 1.5mL/분; 제조사, 페노메넥스; 아미노산 표준; 및 농도, 200μmol/L.

T65 조생성물의 복합아미노산은 한국고분자시험연구원(Koptri)의 GC-FID(gas chromatography-flame ionization Detector) 방법으로 측정하였다. GC-FID의 경우 사용된 머신은 Agilent 6890N GC-FID입니다. 컬럼, ZB-AAA(10m × 0.25mm); 사출 부품 온도, 250℃; 주입 컬럼, 2 μL; 분할 비율, 5:1; 온도 조건, 110ºC → 32ºC/min → 320ºC; 검출기, FID @ 320 ºC; 담체, 질소 가스, 1.5mL/분; 제조사, 페노메넥스; 아미노산 표준; 및 농도, 200μmol/L.

2.14. 지방산

T65 조 생성물의 지방산은 한국고분자시험연구원(Koptri)에서 GC-FID(gas chromatography-flame ionization Detector) 방법으로 측정하였다. GC-FID의 경우 사용된 시스템은 Agilent 6890N GC-FID입니다. 컬럼, Supelco SP–2500(100m × 0.25mm × 0.20μm); 사출 부품 온도, 250℃; 주입 컬럼, 1 μL; 분할 비율, 50:1; 온도 조건, 100ºC(4분) → 3ºC/min → 240ºC(15분); 검출기, FID @ 285 ◦C; 담체, 질소 가스, 0.8mL/분; 제조사, SUPELCO 37 Component FAME Mix; 및 농도, 0.5 mg/mL.

2.15. 항균 활성

병원성 세균의 억제는 디스크 확산법으로 수행하였다. 108 CFU(콜로니 형성 단위)/mL에서 100마이크로리터의 P. 아크네스 배양물을 펼친 후 15ug을 포함하는 6mm 디스크(Whatman)와 함께 Schaedler 한천 플레이트에서 35℃에서 혐기성으로 배양했습니다. 메탄올에 용해된 조 추출물의 농도 및 억제 영역을 측정했습니다. 유사하게, 108 CFU/mL의 S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli 및 P. aeruginosa 100 μL을 도말하고 1-2 동안 R2A 또는 LBA 플레이트에서 호기적으로 35℃에서 배양했습니다. 일 및 억제 영역을 측정했습니다.

2.16. 메조포러스 실리카 입자의 합성

구조유도 고분자를 탈이온수에 녹여 미셀 용액을 제조하였다. 메조포러스 실리카 물질은 문헌[37]에 기술된 방법에 따라 합성되었다. 메조포러스 실리카 입자(SBA{2}}) 합성을 위해 Pluronic P123(EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, USA) 10g을 2M HCl 55mL에 녹인 후 실온에서 교반하였다. 30분 동안 온도. 또한 용액에 TEOS(tetraethylorthosilicate) 22g을 넣고 30분간 더 교반한 후 36℃에서 24시간 방치한 후 100℃로 유지되는 오븐에 넣고 방치하였다. 정적 상태에서 4일. 4일 후, 용액은 병에서 탁한 용액으로 변했습니다. 탁한 용액을 두 층의 셀룰로오스 여과지로 여과하고 EtOH(2회) 및 DI(탈이온)수(2회)로 세척하였다. 생성된 여과된 분말을 120℃ 컨벡션 오븐에서 건조시키고 머플로(Muffle Furnace)에 넣었다(한양과학기기, 서울, 대한민국). 6개의 샘플이 동일한 조건에서 다른 배치로 합성되었습니다. 합성된 SBA의 투과 전자 현미경 사진(TEM){19}}은 서울대학교에서 투과 전자 현미경(Talos L120C, FEI)으로 촬영했습니다.

2.17. BET 표면적 분석

실리카의 입자 크기는 Mastersizer 2000(Malvern Instruments Lt., Malvern, United Kingdom)으로 측정하였다. BET(Brunauer-Emmett-Teller) 분석의 샘플 준비를 위해 5g의 P-123를 76g의 2M HCl에 첨가하고 250rpm에서 24시간 동안 교반했습니다. 24시간 후, P{8}}가 완전히 용해되면 DI(탈이온)수 160mL와 TEOS를 균일하게(15mL/분) 첨가하고 750rpm에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 형성된 분말을 여과하여 분리하고 분리된 분말을 골무에 넣고 속슬렛으로 24시간 동안 세척하였다. 그런 다음 탈이온수로 세척하고 머플로(Muffle Furnace)(한양과학기기, 대한민국)에서 소성하였다. BET 표면적 분석을 수행하여 SBA{14}} 합성에 의해 생성된 분말의 성능을 확인했습니다. BET 분석은 인하대학교와 창원대학교에서 완료되었습니다.

가스 흡착 분석기(Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, OR, USA)를 사용하여 준비된 메조포러스 실리카 재료의 표면적 및 기공 크기 분포를 조사했습니다. 흡착-탈착 등온선에 기반한 ASiQwin 소프트웨어(Anton Paar Quanta Tech Inc., Boynton Beach, FL, USA)를 사용하여 표면적 및 기공 크기 분포를 계산했습니다. 원래 합성된 입자는 300 oC/3h에서 가스를 제거한 다음 -196 oC의 온도에서 N2 흡착 및 탈착 등온선을 측정했습니다. 전체 표면적 계산에는 Multipoint BET 분석이 적용되었습니다.

2.18. 지속 가능성 평가

포함된 SBA-15에서 T65의 존재를 확인하기 위해 다음과 같이 수행했습니다. 12g의 SBA-15와 1.2g의 T65 조 생성물을 500mL 아세토니트릴에 혼합했습니다. 용액을 30℃에서 18시간 동안 교반하였다. 여과 후 혼합물을 여과하고 여과된 입자를 100℃ 컨벡션 오븐에서 건조시켰다. SBA{12}}에서 T65 입자 자체를 찾기 위해 SBA{15}}에 포함된 건조된 T65 1g을 아세토니트릴에 용해시키고 3M 불산 25mL를 첨가했습니다. 용액이 투명해질 때까지 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 용액을 여과하고, 여액을 샘플로 사용하였다. 상기 실험에서 얻은 샘플을 HPLC로 분석하였다.

제어 방출 특성을 확인하기 위해 35mL의 포함된 SBA{1}}를 50mL의 미네랄 오일(M3516; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 붓고 잘 혼합했습니다. 그런 다음, 혼합물에 50 mL의 DI water를 첨가하고 실온에서 6시간 동안 흔든 후 12시간 동안 책상 위에 두었다. 액체층이 분리되면 물층은 버리고 오일층 1mL를 HPLC 분석용 시료로 채취하였다. 2일과 3일에 동일한 실험을 반복하고 HPLC를 사용하여 샘플을 다시 분석하였다.

2.19. 화장품 제형 및 적용

2.19.1. 제형 및 안정성 시험

유화제형 크림으로 화장품을 제형화하였다. 화장품 제형의 안정성은 화장품을 냉동실, 냉장실을 포함한 다양한 온도(37, 45, 60℃)에서 28일 동안 실온에서 보관하여 결정하였다. 화장품 크림의 안정성은 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 주에 관찰되었습니다.

2.19.2. 임상 시험, 자원 봉사자 및 적용 방법

21명의 여성 지원자에게 T65 조제품을 함유한 기능성 화장품 크림을 도포하여 피부 거칠음 및 피부 밝기를 통한 주름 개선 및 미백 효능 측정을 하였다. 이 연구를 위한 인간 참여를 위한 모든 실험 절차는 Elad Institutional Review Board(IRB)(EL-P-7400)의 승인을 받았습니다. 모든 개별 참가자로부터 사전 동의를 얻었습니다. 시험은 제품 도포 전, 2주 후, 4주 후에 실시하였다. 세안 후, 1일 2회(아침, 저녁) 화장품 약 5mg을 얼굴에 도포하여 피부결에 따라 부드럽게 펴 발라줍니다. 지원자는 시험 1주일 전과 시험 기간 동안 다른 크림이나 제품을 사용하는 것이 허용되지 않았습니다.

2.19.3. 이미지 캡처 및 처리 방법

사진은 VISIA-CR로 캡처했습니다. 이미지의 거칠기는 PRIMOS 소프트웨어(PRIMOS 버전 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, USA)로 분석되었습니다. 평균 거칠기(Ra) 및 최대 거칠기 깊이(Rmax)는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

Ra 또는 Rmax 비율(백분율)=(처리 전 값 - 처리 후 값)/처리 전 값 × 100(2)

이미지의 밝기는 Chromameter CR-400로 분석했습니다. L*은 밝기 매개변수이며 다음 공식으로 측정됩니다.

L* 증가율(%) =(처리 전 값 - 처리 후 값)/처리 전 값 × 100(3)

2.20. 통계 분석

IC5{9}} 값의 통계 계산은 OriginPro 8.5 통계 소프트웨어(OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)에 의해 수행되었습니다. 모든 실험은 세 번 수행되었으며 모든 결과는 세 번의 개별 실험의 평균 ± SD로 표시되었습니다. 데이터는 OriginPro 8.5를 사용한 Tukey의 사후 검정에 이어 독립 표본 t-검정 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의해 분석되었습니다. 차이는 p < 0.05에서="" 유의미한="" 것으로="">

3. 결과 및 논의

3.1. 선택된 활성 균주의 분리, 선택 및 계통 발생

수집된 토양 샘플에서 총 2285종의 박테리아가 분리되었습니다. 스크리닝 결과 102종의 박테리아가 화장품에 적용 가능한 기능을 가지고 있는 것으로 나타났다(표 S4). 1차 선별에 기초하여, Streptomyces sp. T65는 모든 화장품 용도, 즉 항산화, 항엘라스타제, 항티로시나제 및 항균 활성에 대해 더 높은 활성을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 마지막으로, 균주 T65는 코스메슈티컬에서의 잠재적 적용을 확인하기 위해 추가 평가를 위해 선택되었습니다. 계통발생학적 분석은 균주 T65가 강한 부트스트랩 값을 갖는 Streptomyces bungoensis DSM 41781T(16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 한 가장 가까운 균주)로 분기군을 형성함을 보여주었습니다(그림 S1).

3.2. 생리활성물질의 검출 및 수집

T65 에틸 아세테이트 배양 추출물의 혼합 생리활성 물질을 Prep-HPLC에서 수집했습니다. 생체 활성 물질은 검출기에 의해 208, 230, 254 및 280 nm에서 측정되었습니다. 분획은 시간을 기준으로 수집되었습니다(14분에서 21분까지). 수집된 분획을 증발 건조시키고 메탄올(T65 조 생성물)에 용해시키고 항균 활성을 포함한 모든 평가에 사용하였다.

3.3. HaCaT 세포의 세포독성

인간 케라티노사이트 세포주(HaCaT 세포)의 세포 생존율은 10 mg/mL까지 T65 조 생성물에 의해 영향을 받지 않은 상태로 유지되었습니다. 한편, T65 조 생성물의 10ng/mL 내지 10mg/mL 농도가 적용될 때 세포 생존율은 용량 의존적으로 증가하였다(도 S2). 이 농도 범위는 100% 이상의 세포 생존율을 가져왔고 이는 HaCaT 세포의 증식을 촉진하고 따라서 HaCaT 세포주에 무독성임을 나타냅니다.

3.4. 항산화 활성

3.4.1. RAW264.7 세포의 세포독성

T65 조 생성물의 세포독성은 MTT 분석 방법에 의해 RAW264.7 대식세포의 세포 생존력에 의해 평가되었다. T65 조 생성물은 RAW264.7 세포주에 대해 세포독성 효과를 나타내지 않았다.

반대로 T65 조 생성물은 13.5~1{13}}00 ug/mL로 처리했을 때 용량 의존적으로 RAW264.7 세포를 증식시키는 데 도움이 되었습니다. 1000ug/mL T65 조 생성물을 사용했을 때 RAW264.7 세포의 세포 생존율은 118.7%였습니다(p < 0.05).="" 이러한="" 결과는="" t65="" 조="" 화합물이="" 최대="" 1mg/ml까지="" 독성이="" 없고="" 화장품="" 제형에="" 사용될="" 수="" 있음을="">

3.4.2. 산화질소(NO) 생성 억제

Griess 시약은 NO 수준을 결정하는 데 사용되었습니다. NO 억제를 결정하기 위해 RAW264.7세포를 다양한 농도의 T65 조 생성물과 함께 1 ug/mL LPS(지질다당류)로 처리하였다. RAW264.7 세포는 LPS에 의해 활성화되었고 NO 생산은 배양 배지에서 아질산염 농도로 측정되었습니다. LPS 단독과 비교하여 T65 조 생성물은 15.5에서 125 ug/mL로 사용될 때 LPS로 자극된 RAW264.7 세포의 아질산염 농도를 농도 의존적으로 억제했습니다(그림 2). 대식세포는 수용체를 통한 세포 활성화 신호에 의한 유도성 NO 합성효소(iNO)의 LPS-Toll-유사 발현이었다[38]. LPS는 대식세포의 활성화제이며 포유류 세포에서 NO 생성에 중요한 역할을 합니다[39]. NO는 대식세포와 같은 면역능이 있는 세포에 의해 생성되는 자유 라디칼입니다[40]. NO의 생산은 대식세포에 대한 식세포 효과가 있습니다. 따라서, 항산화 분석을 위해 대식세포 세포주 RAW264.7을 선택하였다. 오랫동안 NO 생성을 억제하기 위한 천연 항산화제에 대한 탐구에 상당한 관심이 주어졌습니다[41]. 125ug/mL에서 T65 조 생성물은 1ug/mL LPS에 의해 생성된 NO와 비교하여 NO 수준을 57.4%만큼 충분히 감소시켰습니다. LPS-유도된 RAW264.7 대식세포 세포주에서 생성된 NO의 억제에 기초하여, T65 배양 추출물은 강력한 항산화제로 간주될 수 있다.

T65 조 생성물의 다양한 농도 및 IC50 값에서 DPPPHrRaddicial lsScacvavennggininggpAerccteivnitayges가 표 S5에 나와 있습니다. 아스코르브산(비타민 C)은 로션, 크림, 세럼 및 패치에 사용되기 때문에 표준으로 사용되었으며 이는 국소 적용에 대한 강력한 항산화 활성을 갖는 것으로 잘 알려져 있습니다[42]. 비타민 C 및 T65 2차 제품에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성에 대한 IC50은 각각 5.01 및 6.31 ug/mL인 것으로 나타났습니다(그림 3).

식물 재료와 비교하여 분리된 박테리아의 항산화 활성에 대한 연구는 소수에 불과하며 대부분의 연구는 잘 정립된 식물 제품에 중점을 둡니다[43-49]. 10ug/mL 제품의 농도는 DPPH-유리 라디칼의 68.66 ± 2.83%를 소거할 수 있었습니다. T65 조제품의 IC50은 가장 강력한 항산화제인 비타민 C와 거의 비슷하여 화장품 제형에서 항산화제로 사용될 수 있음을 보여주었다.

3.5.1. CCD-986Sk 세포의 세포독성

인간 진피 섬유아세포(HDF) 세포에서 T65의 조 화합물의 세포독성은 MTT 분석을 사용하여 CCD{1}}Sk 세포주에서 평가되었습니다. T65 조 생성물의 농도가 0에서 1 mg/mL로 공급되었을 때 HDF 세포는 500 ug/mL의 농도까지 용량 의존적으로 증식하였다. 이 결과는 T65의 조 화합물이 HDF 세포에 대해 세포독성이 없음을 보여주었다. 그러나 1 mg/mL 이상의 농도에서는 세포독성이 발견되었으며 대조군에 비해 81.34%의 세포만 생존했습니다(그림 4).

3.5.2. HDF의 확산

HDF 세포의 증식은 CCD{0}}Sk 세포주를 사용하여 결정되었습니다. T65 조 생성물은 0에서 500ug/mL까지 농도 의존적 ​​방식으로 HDF 세포를 증식시켰다(그림 5). 그러나 1 mg/mL 농도에서는 세포독성이 있었습니다. 인간 진피 상피 세포의 성장은 인간 진피 세포에서 분리된 1차 배양 세포와 분비된 콜라겐의 변화를 통해 주름 개선 능력을 확인하였다[50,51].

3.5.3. 콜라겐 유형 I 합성

콜라겐 유형 I의 합성은 ELISA에 의해 검출되었습니다. 250 pg/mL에서 T65의 조 생성물은 145.91% ± 9.11%(평균 ± SD, 24, 48 및 72시간의 평균)까지 용량 의존적으로 콜라겐 유형 I의 농도를 증가시켰습니다. 24시간, 48시간, 72시간에 3회 실험한 결과 type I 콜라겐의 합성이 확인되었다(Figure 6). 따라서 인간의 진피세포 성장을 동반한 콜라겐의 진피세포 분비는 T65 화합물의 주름개선 능력을 확인시켜 주었다.

3.6. 미백활동

3.6.1. B16F1 세포의 세포독성

MTT 분석에 의한 B16F1 흑색종 세포에 대한 T65 조 생성물의 세포독성 결과를 도 8에 나타내었다. B16F1 세포에서 T65 조 생성물의 인큐베이션 결과는 1 mg/mL 농도까지 무독성 효과를 나타내었다. B16F1 세포는 62.5ug/mL의 농도까지 용량 의존적으로 증식했지만, 125에서 1000ug/mL로 세포 생존력의 유의한 용량 의존적 감소(p < 0.05)가="" 평가되었습니다.="" 그러나="" 1="" mg/ml의="" 농도에서는="" 99.12%="" ±="" 4.16%의="" 생존="" 세포가="" 관찰되었습니다(그림="" 8).="" 실험="" 결과,="" 균주="" t65="" 배양물의="" 에틸="" 아세테이트="" 추출물은="" b16f1="" 흑색종="" 세포주에="" 대해="" 세포독성이="" 없었고="" 인간="" 피부="" 미백용="" 화장품="" 제형에="" 사용될="" 수="" 있음을="">

3.6.2. B16F10 세포에서 멜라닌 합성 억제

미백효과 확인을 위해 B16F10 세포를 분비, 생산하는 세포주세포의 멜라닌을 사용했습니다. 멜라닌 합성을 촉진하기 위해 B16F10에 1ug의 -MSH를 보충했습니다. 양성대조군으로는 알부틴(100ug/mL; 상용화된 미백제)을 사용하였다. 이 실험의 현미경 관찰은 48시간 내에 125ug/mL의 T65 배양 추출물의 적용에 의해 멜라닌의 거의 완전한 억제를 보여주었습니다(그림 9A, B). 이 실험은 T65 배양 추출물이 용량 의존적 방식으로 멜라닌 합성을 억제할 수 있는 가능성이 있고 국소 적용을 위한 화장품 제형을 위한 미백제로 사용될 수 있음을 입증했습니다.

3.7. 메조포러스 실리카 재료

메조포러스 물질은 IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry) 명명법에 따라 직경 2~50nm의 기공을 포함하는 물질이며, 따라서 메조포러스 실리카 물질은 직경 2-50nm의 기공을 갖는 실리카 물질이다. 이 물질은 1970년대에 미국 특허에 처음 보고되었으나 관련 분야에서 주목을 받지 못하여 1990년에 일본에서 다시 유사한 물질을 독자적으로 연구 합성하였다[69]. Mobil Corporation Laboratories에서 더 자세한 연구를 수행했으며 이 물질을 MCM(Mobil crystalline material)이라고 명명했으며 MCM-41 또는 MCM-48과 같은 예를 들어 메조기공 직경이 2에서 6 사이입니다. nm [70,71]. 캘리포니아 대학(University of California, Santa Barbara)의 또 다른 연구 그룹은 6년 후 더 큰 기공 크기(5~30nm)의 메조포러스 실리카 합성에 성공했으며 이를 SBA(Santa Barbara amorphous material)라고 명명했습니다.{16}} [72] . 메조포어 실리카 물질은 구조적 특성으로 인해 처음에는 분자체로 사용하도록 설계되었지만 최근에는 약물 전달, 촉매, 바이오 센서, 에너지 저장 등의 광범위한 응용 분야를 발견했습니다.

SBA{0}} 및 MCM{1}} 메조포러스 재료에는 다양한 차이점이 있습니다. 그러나 이 둘을 구별하는 가장 간단한 방법은 실리카 벽 두께입니다. 두꺼운 실리카 벽을 가진 SBA-15는 얇은 벽 두께를 가진 MCM-41에 비해 더 안정적이고 단단한 구조를 가지고 있습니다. 또한 SBA-15의 합성 방법은 MCM-41의 합성 방법보다 간단합니다. 이러한 차이로 인해 SBA-15는 실리카 물질의 중간 기공 내부에 생리활성 T65 조 생성물을 운반하기 위해 선택되었습니다.

3.8. 메조포러스 실리카 입자의 합성

200℃에서 2시간, 600℃에서 3시간 연속 소성하여 백색의 실리카 메조다공성 분말을 얻었다. 이 과정에서 8nm 기공의 SBA-15가 합성되었습니다. SBA{6}}의 입자 크기는 직경이 11.539–13.630mm인 것으로 확인되었으며(그림 S4) 인하대학교 연구소와 창원대학교 연구소의 두 시설에서 측정되었습니다. 또한 그림 S4의 6개 샘플은 모두 동일한 방법을 사용했지만 배치는 다릅니다.

위의 방법에 따라 혼합물을 60℃로 유지하고 4일 동안 정적 조건에서 방치하면 5 nm 기공의 SBA-15를 알 수 있었다. 또한 온도를 120℃로 조절했을 때 10nm의 SBA{5}}가 합성되었다. 그 결과, 노화 과정에 따라 중간 기공 크기를 조절할 수 있다[73]. 10nm 기공의 SBA-15(그림 11)는 기공이 큰 메조포러스 실리카 나노물질이 좁은 기공보다 생체분자에 대한 전달 작용이 더 우수하기 때문에 추가 처리에 사용되었습니다[74].

3.9. 지속 가능한 성과 평가

메조포러스 SBA{0}}가 제어 방출 능력을 가지고 있는지 확인하기 위해 SBA-15와 T65 조 생성물을 탈이온수, 메탄올, 아세토니트릴 또는 에틸렌 글리콜 용매에서 함께 결합했습니다. SBA-15와 물을 섞으면 실리카 표면과 물이 응고되어 용액이 슬러리가 된다. 메탄올은 실리카와 T65 조 생성물 모두에 대해 좋은 용매였습니다. 그러나 독성 때문에 아세토니트릴을 메탄올로 대체하였다. T65 침지 비율에 대한 입자는 PV 값에 의해 결정되었습니다(표 S13). 표 S13에 나타난 바와 같이, SBA-15의 PV 값은 T65 조 생성물에 침지 후 감소하였다. 이는 T65 물질이 메조포러스 실리카 입자 내부에 잘 침지되었음을 보여주었다.

입자 내부에 T65가 있는지 여부를 확인하기 위해 T65 자체를 HPLC로 조사했습니다(그림 S5). 데이터에서 알 수 있듯이 T65 준비 배치가 변경되었음에도 불구하고 T65 배양 추출물의 경우 항상 볼 수 있는 두 개의 특정 피크(빨간색 상자 안)가 있었습니다. 이 두 피크의 머무름 시간은 230nm에서 10분과 12분이었습니다. T65가 포함된 SBA-15 내부에 존재하는지 확인하기 위해 여액 샘플을 HPLC로 조사했습니다. 그림 S6에서 볼 수 있듯이 10분과 12분 부근에서 두 개의 특정 피크가 관찰되었습니다. 또한, 머무름 시간 18분 부근에서 작은 피크가 관찰되었는데, 이는 시간 방출되는 T65 제품을 추적하는 데 매우 중요합니다.

그림 12는 0에서 3일까지 T65 임베디드 SBA-15의 지속 가능한 테스트의 통제된 릴리스를 나타냅니다. T65의 특정 피크는 0일부터 3일까지 15분 및 2{8}}분 부근에서 볼 수 있었습니다. T65 조 생성물은 적절하게 침지되었고 시간이 지남에 따라 점차적으로 분비되었습니다. 또한, 본 연구에서 제안한 실리카 메조포러스 물질(SBA{11}})은 T65 조제품에 생리활성물질을 담지할 수 있으며, 로딩 후 생리활성물질이 서방성으로 방출되는 것을 확인하였다. 또한, 본 연구에서 제안하는 실리카 메조포러스 물질은 향후 다양한 생리활성 물질을 지지하여 다양한 기능성 물질을 함침시키는 우수한 담체 및 서방성 물질로 사용될 수 있을 것이다.

4. 결론

토양 미생물에서 추출한 2차 생리활성 물질은 항균, 항산화, 주름 개선, 피부 미백 및 항균 활성으로 인해 화장품 용도로 관심을 받고 있습니다. 이 연구는 화장품 제형의 기능성 성분에 대한 균주 T65 배양의 에틸 아세테이트 추출물의 신규 활성에 대해 설명합니다. T65 조 생성물은 HaCaT(인간 각질세포), RAW264.7(대식세포), CCD{6}}Sk(인간 피부 섬유아세포), B16F1 및 B16F10 흑색종 세포와 같은 다양한 세포주에 독성이 없었습니다. . 또한, T65 조제품은 피부 주름 개선에 매우 중요한 콜라겐 I형 합성의 상향 조절을 보였다. 또한, T65 조제품은 B.subtilis, E. coli, P. acnes, S. aureus, S. epidermidis와 같은 인체 병원성 세균을 충분히 억제하여 화장품의 부패 및 병원성 세균의 군집화를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인간의 피부에 심상성 여드름을 형성합니다. 또한, T65 조산물은 미백 효과를 위한 버섯 티로시나아제와 노화 방지 활성을 위한 돼지 췌장 엘라스타아제를 억제하였고, 항산화 활성을 위해 NO와 소거된 DPPH 라디칼을 억제하였다. 메조다공성 실리카 입자인 SBA{15}}의 합성은 T65 조 생성물이 효과적인 제어 방출 특성을 가진 화장품 제제에 효과적임을 입증했습니다. 마지막으로, T65 조제품과 함께 제형화된 화장품을 지원자의 얼굴에 생체 내 적용한 결과 T65의 미백 및 주름 개선 효과가 입증되었습니다. 그러나 다양한 생리활성 화합물의 화학적 성질과 다양한 효소 억제 및 병원체 억제 활성과 관련된 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 결론적으로, 우리 연구는 미백 효과, 주름 형성 방지, 항산화 효과 및 항균 활성을 위해 국소 적용되는 화장품에 박테리아 자원을 첨가할 수 있다는 아이디어를 강력하게 지지하였다.

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