디젤 배기가스 노출은 Zebrafish 뇌의 신경 퇴행과 관련된 네트워크의 표현을 변화시킵니다 1부
Mar 04, 2024
추상적인
신경퇴행성 질환은 전 세계적으로 장애의 주요 원인이지만, 그 병인은 아직 파악하기 어렵습니다. 유전적 요인은 대부분의 이러한 장애에 대한 위험의 소수만을 설명할 수 있으며, 이는 환경 요인이 이러한 질병의 발병에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다.
퇴행성 신경질환이란 다양한 원인으로 인해 뇌세포의 퇴화가 일어나는 질병의 일종을 말합니다. 흔한 질환으로는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등이 있습니다. 이러한 질병은 뇌의 뉴런에 영향을 미쳐 뇌 기능이 손상되고 기억력, 사고력, 행동 변화 등의 증상이 나타납니다.
하지만 이러한 질병 때문에 긍정적인 태도를 잃을 필요는 없습니다. 환자의 기억력을 향상시키고 증상을 완화시키는 데 도움이 되는 방법은 여러 가지가 있습니다. 다음 방법 중 일부를 살펴보겠습니다.
먼저, 육체적인 운동을 하세요. 연구에 따르면 신체 활동은 뇌의 혈액 순환을 개선하고 뉴런의 기능을 보호하고 개선하는 데 도움이 되는 도파민 및 엔돌핀과 같은 화학 물질의 방출을 증가시킵니다. 동시에 운동은 불안, 우울증, 불면증과 같은 문제를 줄이는 데 도움이 되어 환자가 보다 즐거운 삶을 누릴 수 있도록 해줍니다.
둘째, 사회적 관계를 유지하라. 우리의 소셜 네트워크가 뇌의 관련 영역과 밀접하게 연결되어 있다는 것도 매우 중요하며, 사회적 상호 작용은 스트레스를 줄일 뿐만 아니라 행복도 증가, 우울증 퇴치 등을 통해 뇌 건강을 향상시킬 수도 있습니다.
마지막으로, 잘 먹고 충분한 수면을 취하세요. 이 두 가지 측면 모두 뇌 건강에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 좋은 식단에는 충분한 영양소가 포함되어야 할 뿐만 아니라 설탕, 포화지방, 콜레스테롤을 반복적으로 너무 많이 섭취하지 않아야 합니다. 또한 충분한 수면을 취하면 다양한 단계의 기억력 문제, 특히 알츠하이머병과 같은 질병을 퇴치하는 데 도움이 될 수 있습니다.
요컨대 신경퇴행성 질환은 삶에 대한 기대를 포기하는 것을 의미하지 않습니다. 긍정적인 태도를 유지하는 동시에 삶의 질을 향상시키기 위해서는 과학적이고 효과적인 방법을 채택하는 것도 필요합니다. 더 많이 웃고 더 많은 햇빛을 쬐면 건강을 유지하는 데 도움이 됩니다. 기억력 향상이 필요함을 알 수 있는데, 시스탄체 데저티콜라는 기억력 향상이라는 독특한 효능이 많은 중국 전통 약재이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. Cistanche Deserticola의 효능은 탄닌산, 다당류, 플라보노이드 배당체 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 다양한 경로를 통해 뇌 건강을 촉진할 수 있습니다.
최근 대기 오염에 대한 장기간의 노출이 알츠하이머병 및 파킨슨병의 위험을 증가시키는 것으로 확인되었지만 이것이 작용하는 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다.
디젤 배기 입자 추출물(DEPe)에 노출된 Zebrafishembryos는 자가포식 기능 장애 및 신경 세포 손실을 초래합니다. 여기에서 우리는 제브라피시 배아를 DEPe에 노출시키고 뇌에서 높은 처리량의 단백질체 및 전사체 발현 분석을 수행하여 대기 오염으로 인한 병원성 경로를 식별했습니다. DEPe 처리는 생체이물 대사, 포식체 성숙, 아밀로이드 처리 등 신경변성 과정과 관련된 여러 생물학적 과정과 신호 전달 경로를 변경했습니다. 유전자 발현 뇌의 가장 큰 유도는 Cyp1A에서였습니다(30-배 이상).
이러한 발현 변화의 관련성은 CRISPR/Cas9를 사용하여 유도를 차단함으로써 확인되었으며, 이로 인해 DEPe 독성에 대한 민감도가 극적으로 증가하여 Cyp1A 유도가 보상적 보호 메커니즘임을 확인했습니다.
이러한 연구에서는 신경퇴행성 질환의 발병에 기여할 수 있는 중단된 분자 경로가 확인되었습니다. 궁극적으로 대기 오염이 어떻게 신경퇴행의 위험을 증가시키는지에 대한 분자적 기초를 결정하는 것은 질병 수정 치료법의 개발에 도움이 될 것입니다.
키워드
대기 오염 · 치매 · 파킨슨병 · 알츠하이머병 · 전사체학 ·단백질체학.
소개
대기 오염은 사망률의 주요 원인이며 호흡기 질환, 심장 질환, 뇌졸중, 폐암 및 당뇨병과 관련이 있습니다. 새로운 역학적 증거는 대기 오염 노출과 알츠하이머병 및 파킨슨병(AD 및 PD)을 포함한 신경퇴행성 질환의 발병 사이의 연관성을 뒷받침합니다(Fu et al. 2019). 대기 오염이 AD 및 PD의 위험을 증가시킬 수 있는 메커니즘을 조사하는 연구가 부족하지만 인과 관계를 뒷받침하는 연구는 거의 없습니다(Fu et al. 2019).
뇌에 단백질 함유물이 축적되는 것은 신경퇴행성 장애의 보편적인 특징이며 신경 기능 장애 및 사망으로 이어지는 일반적인 경로일 가능성이 높습니다. 예를 들어, 아밀로이드 베타(A-베타) 및 타우 구조의 형성은 AD 및 PD의 -시누클레인(-syn) 응집체 또는 루이체의 병리학적 특징입니다(Ross and Poirier 2004; Woulfe 2008).
단백질 항상성의 변화는 적어도 부분적으로 이러한 응집체 형성의 기초가 되는 것으로 보이지만 정확한 메커니즘은 아직 알려지지 않았으며 유전적 및 환경적 위험 요인에 따라 개인마다 다를 수 있습니다. 우리는 A-betaor -syn의 발현 증가 또는 분해 감소가 AD 및 PD로 이어질 수 있다는 것을 알고 있습니다(Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).
신경퇴행성 장애의 다른 일반적인 특징은 염증과 산화 스트레스입니다. CNS의 염증 세포인 활성화된 소교세포는 AD 및 PD 뇌의 부검에서 쉽게 인식될 수 있으며 신경변성의 병인에 기여할 가능성이 높습니다(Kannarkat et al. 2013). 이 염증과 아마도 미토콘드리아 기능 장애는 부검된 뇌에서도 평가되는 산화 스트레스로 이어지는 것으로 생각됩니다(Picca et al. 2020).
현재까지 대기 오염과 신경퇴화에 관한 기계적 연구의 대부분은 염증에 초점을 맞춰 왔습니다(Jayaraj et al. 2017). 대기 오염은 동물과 인간의 뇌에서 CNS 염증과 산화 스트레스를 모두 증가시키는 것으로 보입니다(Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a,b 및 c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Yokota et al.2013a, b).
특히 흥미로운 점은 대기 오염이 쥐의 후각구(OB)에서 일부 염증 유전자의 발현을 증가시킨다는 사실입니다. 이 영역은 PD 병리가 질병 초기에 나타나는 뇌 영역입니다(Levesque et al. 2011a, b;Yokota et al. 2013a). . 염증은 농촌 지역에 비해 도시 지역에 사는 개에서도 나타났으며, 저자들은 이러한 변화가 높은 수준의 대기 오염으로 인한 것이라고 추측했습니다(Calderón-Garcidueñas et al. 2003).
같은 저자들은 또한 대기 오염으로 인해 -syn이 도시에 사는 사람들의 뇌에 축적되었다고 제안했습니다(Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). 최근 제브라피시 모델 연구에서 DEPe에 노출되면 자가포식을 방해하여 신경 독성을 유발하고 신경 세포 수를 크게 감소시키는 것으로 보고되었습니다(Barnhill et al. 2020).
DEPe는 대기 오염의 많은 독성 성분을 함유하고 있으며 일반적으로 세포 배양 시스템의 노출을 모델링하는 데 사용됩니다(Costa 등 2014; Hesterberg 등 2010; Levesque 등 2011b). 자가포식은 잘못 접힌 단백질과 손상된 세포소기관을 제거하고 근절하기 위한 필수적인 세포내 메커니즘입니다.
실제로, 세포의 항상성을 위해서는 정확한 자가포식 활동이 필요하며, 뉴런의 자가포식 기능 장애는 생존율과 신경 퇴화를 변화시킵니다(Kesidou et al. 2013). 이러한 많은 연구에는 명확한 한계가 있지만 모두 대기 오염 노출이 AD의 위험을 증가시킨다는 것을 시사합니다. 그리고 PD. 오염이 이러한 위험을 증가시키는 메커니즘에 대한 우리의 이해는 제한적이지만 초미세 입자와 대기 오염의 여러 구성 요소는 후각 구근을 통해 직접 또는 혈류를 통해 폐를 통해 뇌에 들어갈 수 있습니다(Kilian 및 Kitazawa 2018).
이러한 입자는 탄소 코어와 다환 방향족 탄화수소, 금속, 질산염, 황산염 및 기타 요소와 같은 흡착 화합물로 구성되며 특히 도시 지역에서 대기 오염 물질의 상당 부분을 구성합니다. 이러한 화합물 중 다수는 산화 스트레스 및 세포와 관련되어 있습니다 대기 오염과 신경 퇴화의 인과 관계에 타당성을 추가하는 독성.
세포 및 동물 모델을 포함한 상세한 다학문적 조사는 질병의 원인에 대한 통찰력을 제공하고 향후 치료 접근 방식을 지시할 수 있습니다(Cannon 및 Greenamyre 2011). 생체 내 연구에 사용되는 모델 유기체 중에서 Danio rerio(zebrafish)는 독성학, 분자 유전학, 독성유전체학 및 약물 발견 연구를 위한 강력한 모델입니다.
대부분의 생물학적 경로는 척추동물에서 고도로 보존되어 있으며, 기능성 인간 유전자의 대부분은 제브라피시에서 상동체를 가지고 있습니다(Vaz et al.2018). 또한, 제브라피시 배아는 빠르고 독립적으로 발달하므로 원하는 발달 단계에서 분석이 가능합니다. 이러한 특징은 빠른 번식과 저렴한 사육 비용과 함께 제브라피시를 환경 노출의 독성 영향을 연구하는 데 유리한 모델로 만듭니다.
질병의 발병 기전 뒤에 있는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 광범위한 고처리량 유전자 발현 프로파일링 접근법이 개발되었습니다. 질량 분석 기반 단백질체학 및 높은 처리량의 RNA 시퀀싱은 관심 있는 생물학적 경로를 식별하는 데 특별한 가능성을 가지고 있습니다. 이러한 기술은 환경 자극에 대한 세포 및 동물 모델의 반응을 이해하는 데 널리 사용되었습니다(Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).
본 연구에서 우리는 제브라피쉬 배아의 머리 내 프로테옴과 전사체 프로파일 모두에 대한 DEPe 처리 효과에 대한 발현 분석을 추구했습니다. 주로 뇌 조직으로 구성된 머리에서 샘플을 분리하면 더 많은 조직별 프로필을 얻을 수 있고 다른 조직에서 발생하는 효과를 최소화할 수 있습니다. 우리는 여기에서 DEPe에 노출된 제브라피시 머리의 신경퇴화와 관련된 여러 경로에서 변경된 유전자 발현과 단백질 프로필을 설명합니다. 이러한 결과는 대기 오염이 AD 및 PD의 위험을 증가시키는 가능한 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
재료 및 방법
물고기 처리 및 CRISPR/Cas9-매개 유전자 녹다운
모든 연구는 UCLA 동물권리위원회의 승인을 받았습니다. Zebrafish(AB)를 1시간 동안 빛 자극에 의해 사육하였고 총 200개의 알을 28도에서 24시간 동안 배양했습니다. 생성된 배아를 프로나제(2 mg/ml)에서 탈융모화시키고 수정 후 5일(DPF)까지 최종 농도 20 ug/ml의 DEPe(Standard Reference Materials, NIST, Gaithersburg, MD) 또는 비히클로 처리했습니다.
이 농도는 이전에 보고된 대로 뉴런 손실을 초래했지만 상당한 사망률이 없었기 때문에 선택되었습니다(Barnhillet al. 2020). Cyp1A 녹다운 물고기는 다음과 같이 준비되었습니다. http://crispr.mit.edu에서 사용 가능한 도구를 사용하여 CRISPR RNA(Cyp1A-crRNA )은 Cyp1A 유전자의 첫 번째 엑소온에서 적합한 PAM 사이트의 위치를 기반으로 설계되었습니다.
최고의 디자인은 표준 CRISPR-Cas9 tracrRNA와 함께 IDT DNA(www.idtdna.com)에서 구입했습니다. Cyp1Agene 및 tracrRNA에 대한 crRNA를 별도로 10mM Tris-EDTA에 재현탁하여 100μM 최종 농도를 생성했습니다. 그 다음, tracrRNA를 1x 이중 완충액(100mM 아세트산 칼륨; 30mM HEPES, pH 7.5; IDT DNA) 내 crRNA와 결합하여 10μM의 최종 농도를 생성했습니다. 혼합물을 끓는 수조에서 5분 동안 95도까지 가열하고 상보적인 뉴클레오티드 서열 incrRNA 및 tracrRNA의 어닐링과 기능성 가이드 RNA(gRNA)의 형성을 허용하기 위해 실온으로 천천히 냉각했습니다.
그런 다음 3 μL의 어닐링된 gRNA를 돌연변이 Cyp1A의 주형 서열과 동일한 부피의 기증자 단일 가닥 DNA(ssDNA; 200 μM)와 결합했습니다. 1x 주입 완충액(5mM KCl; 0.1M 인산나트륨, pH 6.8) 중 3ug의 Cas9 뉴클레아제(IDT)를 혼합물에 첨가하여 최종 CRISPR/Cas9리보핵단백질(Cyp1A-RNP) 복합체를 형성했습니다.
Scramble RNP(SC-RNP)를 준비하기 위해 특정 Cyp1A-crRNA를 게놈에 표적이 없는 상용 Scramble-crRNA로 대체했습니다. 이 작업에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드의 서열은 보충 표 1에 나열되어 있습니다. 계란은 약 3nL의 RNP 주입 혼합물을 사용하여 입체 현미경으로 주입되었습니다.
5번의 생물학적 반복 주입(각 반복에는 Cyp1A-RNP가 주입된 400~600개의 계란과 SC-RNP가 주입된 100~200개의 계란이 포함됨)이 수행되었으며 모든 미세 주입은 60분 이내에 완료되었습니다. 계란을 100mm 플라스틱 페트리 접시에 넣고 계란 물에서 28도에서 배양했습니다. 배아의 생존율을 최대 7일 동안 모니터링했습니다.
기형 점수를 매기기 위해 살아남은 물고기의 이미지를 검토했습니다. 각 유충은 머리 기형, 꼬리 기형, 심장 부종 및 난황 부종을 포함한 4가지 발달 기형의 존재 여부에 대해 맹검 방식으로 점수를 매겼습니다. 4가지 기형이 모두 있는 유충은 4점을 받은 반면, 정상적으로 발달 중인 유충은 0점을 받았습니다. 유의미한 차이를 평가하기 위해 통계적 T-테스트를 사용했습니다.
For more information:1950477648nn@gmail.com
