식이 Cistanche는 오리의 급성 회장 손상을 완화했습니다.
Mar 06, 2023
초록: Aflatoxin B1(AFB1)은 인간과 동물의 건강을 위협하는 안정한 독성 대사산물이며 광범위하게 오염된 동물 사료와 인간 식품입니다. 본 연구의 목적은식이 요법AFB1 투여에 의해 유도된 오리의 회장 손상에 대해 연구하고 기본 메커니즘을 탐색합니다. 체중이 비슷한 오리(N=450, 생후 1일 된 수컷)를 대조군, AFB1 그룹(60 µg AFB1 kg−1 체중), 시스탕슈(500 mg cistanche kg−1 다이어트) + AFB1 그룹. AFB1 투여는 회장 손상, 혈장 내 AFB1-DNA 부가물, 산화 스트레스 및 염증을 현저하게 증가시켰다. 식이에 cistanche를 추가하면 AFB1 투여에 의해 유발된 형태 손상으로부터 회장을 보호하고, 혈장에서 AFB1-DNA 부가물을 감소시키고, 오리 회장의 산화 스트레스와 염증을 제거했습니다.항산화그리고항염증 cistanche의 효과Nrf2-ARE 신호 경로를 활성화하고 NF-κB 신호 경로를 억제하여 급성 손상으로부터 회장을 보호할 수 있습니다. 결론적으로,담배식이 요법이었다항산화그리고항염Nrf2-ARE 신호 경로 활성화 및 NF-κB 신호 경로 억제를 통한 에이전트 AFB1 투여에 의해 유발된 급성 손상.
키워드:담배; 급성 회장; AFB1-DNA 부가물, Nrf2-ARE;
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1. 소개
육류는 인간 영양을 위한 고품질 단백질의 중요한 공급원입니다. 오리 고기는 바람직한 영양 특성 때문에 전 세계적으로 특히 아시아에서 많이 소비됩니다[1]. 따라서 오리의 번식은 사람들의 관심을 끌었습니다. 오리의 경우 오리의 건강을 위협하는 AFB1과 같이 번식 과정에서 다양한 단점이 있습니다. Aflatoxin B1(AFB1)은 Aspergillus 종이 생산하는 테이블 독성 대사산물 중 하나입니다. AFB1은 인간과 동물의 건강을 위협하는 다양한 독성 효과와 함께 아플라톡신(AF) 그룹 중에서 가장 독성이 강한 것으로 알려져 있습니다[2].
사람이나 동물의 경우 음식이나 사료는 AFB1에 노출되는 일반적이고 중요한 방법이지만 흡입 및 피부 또는 점막 접촉과의 직접 접촉도 계산되며 무시되지 않습니다[3]. 이전 연구에서는 AFB1이 매우 복잡하고 강한 강력한 독성을 발휘하여 성장 지연, 생물학적 기형, 간 독성, 소화관 장애 및 심지어 암을 유발한다는 것을 입증했습니다[4,5]. 음식이나 점막 접촉을 통해 얻은 AFB1은 호흡기, 소화기, 조직 및 성장 성능에 부정적인 영향을 미쳤습니다[3,6,7]. 산화 스트레스 및 염증과 관련된 AFB1 투여에 의해 유도된 조직 및 기관 손상. AFB1 투여는 손상된 기관에서 증가된 AFB1-DNA 부가물 함량을 나타냈다[8]. 영양분과 독소의 흡수와 전환은 위와 소장에서 일어나므로 작은
장 점막 면역 체계는 손상으로부터 신체를 보호하는 첫 번째 라인입니다[9]. 건강한 위장관의 기능과 형태는 독성 물질, 박테리아 및 바이러스와 같은 불리한 요인에 의해 파괴될 수 있습니다[10,11]. AFB1은 공장 융모의 상피 세포 탈락과 닭 장의 림프구 세포 침윤으로 나타나는 장 구조의 파괴를 유도했습니다[12,13]. 변형 기능 및 형태는 종종 산화 스트레스 염증을 동반하는 독소 대사 과정에 기인할 수 있습니다. 사람과 동물에 대한 AFB1의 위협을 줄이고 최소화하기 위한 해독제를 찾는 것이 시급한 문제입니다.
결과적으로 AFB1은 강력한 독성으로 인해 가금류 산업에서 가장 중요한 관심사 중 하나입니다. cistanche는 가축사료에 사용되는 기능성 사료첨가제로 강황(Cur cuma Longa Linn)에서 발생하는 폴리페놀 성분의 일종으로[14] 널리 사용되고 있다.
식품 산업에서 녹색 및 천연 향신료, 착색제, 방부제 및 향료로 사용됩니다. 폴리페놀을 함유한 cistanche와 같은 식물 추출물은 신체의 면역력을 향상시켰습니다[15]. cistanche는 만성 질환의 치료 및 예방을 위한 치료법으로 사용될 때 산화 스트레스 매개 병리학적 상태 및 활동에 대해 중요한 역할을 합니다[16,17]. 임상 시험에서 Cistanche는 심각한 독성이나 부작용이 없고 항발암성 및 항독성 특성을 가지고 있어 AFB1-유발 조직 손상에 대한 매력적인 화학 예방제로서 Cistanche를 이끌었습니다[18-20]. 문헌에 따르면 시스탄슈는 Nrf2/HO-1 경로를 활성화하여 항염증, 항세포사멸 및 항산화 능력을 가지고 있으며, 신체의 염증 및 산화 스트레스를 제거하고 AFB1- 유도를 제거하는 항산소 능력을 상향 조절했습니다. 산화 스트레스[21–25]. cistanche는 Nrf2-ARE를 활성화하고 잔여 신장 데몬닝[26], 항산화 및 항염증 특성에서 NF-κB 신호 전달 경로를 억제하여 산화 스트레스 및 인플라마좀 형성을 억제했습니다. 또한 식이성 식감은 육계[27]와 오리[28]의 항산화 능력을 크게 향상시켰습니다. Nrf2-ARE 및 NF-κB 신호 전달 경로와 급성 AFB1 투여의 동물 모델에서 cistanche의 역할을 연관시키려는 시도는 없었습니다.
이 연구는 이 문제를 조명하고 AFB1 투여로부터 오리의 건강을 보호하고 AFB1 오염으로 인한 사료 및 사육 산업의 경제적 손실을 줄이기 위한 사료 첨가제로서의 시스탄슈에 대한 이론적 근거를 제공했습니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 화학
cistanche는 Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd.(Nanjing, Jiangsu, China, CAS: 458-37-7)에서 구입하였으며 HPLC 분석 결과 순도는 98% 이상이었습니다. AFB1(순도 98% 이상, CAS NO . 1162-65-8)은 Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 본 연구에 사용된 항체는 GAPDH(카탈로그 번호: AG019), Nrf2(카탈로그 번호: AF7623), Phospho-NF-κB p65(Ser276)(카탈로그 번호: AF5875), HRP를 포함하여 중국 상하이의 Bey time Biotechnology에서 구입했습니다. 라벨이 붙은 Goat Anti-Rabbit IgG(H plus L)(카탈로그 번호: A0208) 및 HRP 라벨이 붙은 염소
Anti-Mouse IgG(H + L)(카탈로그 번호: A0216).
2.2. 오리와 축산
실험 프로토콜은 Northeast Agricultural University의 농업 연구 및 교육에서 농업 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드(프로토콜 번호: NEAU-[2011]-9)에 설명된 관행에 따라 수행되었습니다.
오리(n {0}}, 1일된 수컷 Anas platyrhynchos, 33.8 ± 0.2 g)는 상업용 부화장에서 구입하여 무작위로 3개 그룹(표 1)으로 할당했습니다. 70-일 동안 그룹당 우리(우리) 복제 및 우리당 오리 15마리
수유 재판. 기본 식단은 National Research Council(1994)에 따라 공식화되었습니다. T0 및 T0 + AFB1 그룹의 오리는 옥수수-대두 기초 식단을 섭취했고(표 2), T500 + AFB1 그룹의 오리는 500mg의 옥수수가 보충된 기본 식단을 섭취했습니다.
cistanche kg−1 다이어트(T500) 70-일 시험. 70일에 T0 + AFB1 그룹과 T500 + AFB1 그룹에서 비슷한 체중을 가진 오리에게 60 µg의 AFB1 kg−1 체중을 공급했고, T0 그룹의 오리는 동량의 PBS 용액을 먹였다. 오리는 동북농업대학의 Acheng Experimental Base에서 먹이를 주었고 물과 분말 사료에 자유롭게 접근할 수 있도록 제공되었습니다. 각 그룹에서 비슷한 체중(1.4 ± 0.3 kg)의 오리 15마리를 선택하여 12시간 동안 절식시킨 후 T0 그룹의 오리에게는 PBS 용액을, T0 그룹의 오리에게는 체중의 60 μg AFB1 kg-1 + AFB1을 공급하고 T500과 AFB1을 동시에 그룹화합니다. 12시간 후, 각 그룹의 15마리의 오리는 오리 샘플을 얻었다.
2.3. 샘플 수집
오리 날개 정맥에서 헤파린 튜브를 사용하여 혈액 샘플(10 mL)을 채취하고 4 ºC에서 15분 동안 1000×g로 원심분리했습니다. 얻어진 혈장은 즉시 분리하여 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 오리는 에테르를 흡입하여 마취하고 회장을 얻기 위해 죽였습니다. 회장은 즉시 PBS로 3회 세척하고 개별적으로 액체 질소 탱크에 보관한 다음 qRT-PCR 및 항산화 능력 분석을 위해 -80 ºC에서 보관했습니다. 그 후 약 0.125 cm3의 회장을 채취하여 조직 절편용 4% 파라포름알데히드 용액에 넣고 약 1 mm3의 회장을 전자현미경으로 관찰하였다.
차후 초미세구조 관찰을 위해 4℃에서 용액.
2.4. 혈장 내 항산화제 수준 분석
총 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(T-SOD), 글루타티온 퍼옥시다제(GSH Px), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GSH-ST) 및 말론디알데히드(MDA)의 혈장 수준을 분석 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)로 측정하였다. 각각
UV-VIS 분광광도계(UV1100, MAPADA, 중국 상하이).
2.5. AFB 분석1-DNA는 혈장에서 수준을 부가합니다.
혈장 내 AFB1-DNA 부가물의 생성은 키트의 사양(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)에 따라 ELISA 키트를 사용하여 결정되었습니다.
2.6. 회장의 항산화 능력 분석
회장(100.00mg)을 0.9mL 뇌졸중 생리 식염수 용액(4ºC, 0.9% NaCl, pH=7.2)에 이양하고 혼합했습니다. –7.4) 10% 회장/SPSS 균질액을 얻습니다. 총 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(T-SOD U/mg 단백질), 환원성 글루 글루타티온(GSH-PX µmol/mg 단백질), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GSH-ST U/mg 단백질) 및 말론디알데히드(MDA nmol/ mg 단백질)을 분석 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)를 사용하여 각각 UV-VIS로 평가했습니다.
분광광도계(UV1100, MAPADA, 중국 상하이).
2.7. RNA 분리 및 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)
오리 회장의 총 RNA(100.00 mg)는 제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라 시약 키트(TaKaRa, 일본)를 사용하여 분리했습니다. total RNA의 농도와 순도는 분광광도계(IMPLEN, Germany)를 사용하여 A260/A280 비율로 검출하였다. gDNA Eraser(TaKaRa, Dalian, China)가 포함된 Prime Script™ RT 시약 키트를 사용하여 각 샘플의 총 RNA 1µg을 cDNA로 변환했습니다.
제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따릅니다. 각 오리 회장에서 얻은 cDNA를 TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Dalian, China) RT-PCR(qRT-PCR) 키트의 주형으로 사용하였다. 오리의 유전자 접근 번호는 NCBI에서 얻었고
오리 유전자 프라이머는 Sangon Biotech Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 합성하였다(표 3). 오리 회장의 관련 유전자 발현은 Quanta 유전자 Q225 열 순환 장치에 의해 결정되었습니다. qRT-PCR은 Monad Selected Real-Time에서 실행되었습니다.
PCR System(ABI 7500 real-time PCR instrument (USA)) 조건으로 흐르는 것: 95ºC에서 30초 동안 1주기, 95ºC에서 5초 동안 40주기, 60ºC에서 30초 동안. 검출 mRNA의 상대적인 유전자 발현 비율은 2-∆∆Ct 방법을 사용하여 검출되었고 -actin 발현으로 정규화되었습니다.
2.8. 웨스턴 블로팅
오리 회장을 분쇄하고 얼음에 1mmol/L PMSF(Beyotime, Shanghai, China)를 함유하는 RIPA 완충액에서 용해시켰다. 회장의 총 단백질 농도는 BCA(bicinchoninic acid) 분석 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)로 측정했습니다. 전기영동을 위한 12% 및 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔은
분자량이 다른 목적 단백질을 얻기 위해 사용됩니다. 그런 다음 표적 단백질을 trans blotting 장치로 blot을 위해 polyvinylidene-difluoride (PVDF) 막 (Beyotime, Shanghai, China)으로 옮겼습니다. PVDF 멤브레인을 1X PBST에서 매번 10분 동안 3회 세척한 다음 5% 탈지유에서 2시간 동안 차단했습니다. PVDF 멤브레인을 다시 3번 세척하고 GAPDH, Nrf2 및 P-P65(Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) 일차 항체와 함께 각각 4oC에서 8~12시간 동안 배양했습니다. 다음 날, PVDF 멤브레인을 다시 3번 세척하고 상응하는 양고추냉이 퍼옥시다제 표지 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 다시 3번 세척하였다.
향상된 형광 검출 키트 BeyoECL Star(Beyotime Biotechnology, Shanghai, China)의 작용 하에 표적 단백질 밴드를 검출하고 가시화하였다. 블롯의 이미지는 Essential V6 이미징 플랫폼(UVITEC, Cambridge,
영국). GAPDH 단백질은 내부 제어 단백질로 사용되었습니다. 모든 실험 결과는 3회 반복하였다. 표적 단백질의 상대적인 발현은 GAPDH에 대한 단백질의 밴드 강도의 비율로 표현하였다.
2.9. 통계 분석
실험 데이터는 최소 6회 이상 획득하였으며 각 샘플은 3회 측정하였다. Independent-Samples T Test by SPSS (Version 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 5%로 사용한 연구 데이터 분석 오류 확률 및 통계적 유의성은 p < {{4} }.05 이 연구에서
