생쥐에서 브로모벤젠과 그 중간 대사 산물의 다른 신장 시간 독성
May 17, 2022
브로모벤젠(BB)은 인간의 건강에 심각한 위협이 되는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 이전에 BB가 시간 독성, 즉 마우스에서 유도된 간독성의 중증도의 일일 변동을 보여주었다는 것을 입증했습니다. BB는 경미한 신독성을 나타내었지만, 이 독성에서 일간 변동은 관찰되지 않았다. 이것은 BB로 인한 시간 독성이 간에서만 관찰되고 간에서는 관찰되지 않는다는 사실에 기인할 수 있습니다.신장BB로 인한 손상은 간에서 두드러져 신독성의 일일 변동을 가립니다. 이 두 가지 가능성을 확인하기 위해 우리는 표적을 표적으로 하는 BB 중간 대사 산물로 인한 신독성의 일일 변동을 조사했습니다.신장: 3-브로모페놀, 브로모하이드로퀴논 및 4-브로모카테콜. 마우스에 3-브로모페놀, 브로모하이드로퀴논 또는 4-브로모카테콜을 하루 6개의 다른 시점(ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 또는 ZT22)에 복강 내 주사했습니다. 주사 후 7일 동안 사망률을 모니터링하였다. 마우스는 ZT2(밝기) 노출 주변보다 ZT14(암기) 노출 주변에서 이러한 대사 산물의 급성 독성에 더 민감했습니다. 또한, 치명적이지 않은 용량의 {{17}브로모카테콜을 투여한 마우스는 혈장 혈액 요소 질소 및신장ZT14 노출 시 malondialdehyde. 또한, ferroptosis 지표인 glutathione peroxidase{1}}는 ZT14 노출에서 약화되었습니다. 이러한 결과는 BB 대사 산물의 독성이 암기 노출 동안 더 높았음을 나타내며, 이전 보고서에서 BB에 의한 신독성의 일간 변화가 관찰되지 않은 이유를 보여줍니다.신장손상심각한 간 손상으로 인해 마스크를 착용했습니다.
키워드 브로모벤젠; 일교차; 일주기 리듬; 시간 독성;신장
소개
브로모벤젠(BB)은 의약품, 염료, 농약 합성의 원료로 주로 사용되는 일반 공업용 시약이다.1,2) BB는 자연환경을 훼손하고 인간의 건강에 심각한 위협이 되는 유기오염물질이다. . 한 연구에서는 BB가 심각한 간독성과 경증을 유발한다고 밝혔습니다.신장3) 비대사체 형태인 BB 자체는 독성이 낮지만 중간대사체는 간에 독성 영향을 미치며신장. CYP1A2, CYP1B1 및 CYP2E1과 같은 간 CYP450은 BB를 3-브로모페놀(3-BrP), 브로모하이드로퀴논(BrHQ), 4-브로모카테콜(4- BrC) 및 BB{11}},{12}}산화물. BB{13}},{14}}산화물은 높은 간독성을 나타내고 다른 대사체는 신독성을 나타냅니다.4-6) 이러한 대사체는 서로 다른 표적 기관을 가지고 있음을 나타냅니다.
이 연구에서 우리는 이전에 투여 시기와 화학물질의 독성 심각도 사이의 관계를 제안한 것처럼 "연대기 독성학"을 목표로 삼았습니다. , 쥐는 밝은 단계의 노출(14:00)보다 어두운 단계의 노출(2:00) 동안 BB로 인한 간 손상에 더 내성이 있었습니다.8) BB는 가벼운 신독성을 나타내었지만 , 시간 독성은 관찰되지 않았습니다.신장. 따라서 BB 유발 시간 독성은 간에서만 관찰되고 간에서는 관찰되지 않았을 가능성이 있습니다.신장. 이전 연구에서 정의된 신독성을 유발하는 것으로 알려진 항생제인 스트렙토마이신은 생쥐에서 유도된 신독성에서 명확한 일교차 변화를 보였다. 그만큼신장, 따라서 후자 기관의 시간 독성을 마스킹합니다. 다양한 대사 경로를 통해 생성된 BB의 대사 산물은 낮은 농도로 발생하므로 무시할 수 있는 신장 손상에 기여할 수 있습니다. 이 때문에 BB 대사체에 의한 신독성은 임상적으로 추정할 수 없다. 이 연구에서 우리는 BB 중간 대사 산물인 3-BrP, BrHQ 및 4-BrC의 신독성의 일별 변화를 조사했습니다(그림 1).
재료 및 방법
동물 치료
수컷 ICR 마우스는 Japan SLC Inc.(Shizuoka, Japan)에서 구입했으며 온도(24±1도), 습도(55±5%) 및 빛(12: 12-h)의 표준 조건에서 유지되었습니다. 명암 주기, 08: 00에 켜짐), 물과 음식을 무료로 이용할 수 있습니다. 실험적 처리는 7-주된 동물을 사용하여 수행되었습니다. 실험이 완료된 후, 생존한 마우스를 펜토바르비탈을 사용하여 희생시켰다. 모든 실험은 Kinjo Gakuin University의 기관 동물 관리 및 실험 위원회의 승인을 받았습니다.
실험 프로토콜
사망률 분석을 위해 {{0}}주령 수컷 ICR 마우스에게 5{11}} BrP, 180 mg/kg의 5{11}} mg/kg을 복강내(ip) 주사했습니다. BrHQ 또는 220mg/kg의 4-BrC(0.1mL/체중 10g의 부피에서, Tokyo Kasei Corp, Tokyo, Japan). 이 용량은 각 화학 물질에 대한 안전 데이터 시트의 LD50 값에 따라 결정됩니다. 각 대사 산물의 주사를 위해 마우스를 각각 5마리의 동물로 구성된 6개 그룹으로 할당했습니다. BB 대사산물은 6개의 다른 시점(시계 시간: 10:{13}}, 14:00, 18:{17}}, 22:00, 02: {{21 }} 및 06:00), ZT2(ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 및 ZT22)로 각각 기술됩니다. 대조군 마우스는 같은 양의 식염수를 받았습니다. 주사 후 7일 동안 사망률을 모니터링하였다.
24시간 주기 변화를 분석하기 위해신장부상, 7-주령 수컷 ICR 마우스(5~9마리)에 ZT2 또는 ZT14에서 165mg/kg의 4-BrC를 복강내 주사했습니다. 대조군 마우스는 위에서 설명한 것과 동일한 부피의 식염수를 받았습니다. 동물은 pentobarbital을 사용하여 안락사되었고, 그들의 혈장 샘플은 주사 후 24시간 동안 수집되었습니다. 얻어진 혈장 샘플은 -80도에서 보관하였다. 그만큼신장모든 동물 중 -80도에서 수확하여 보관했습니다.
혈장 혈액 요소 질소(BUN), 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) 및 신장 말론디알데히드(MDA) 수치
혈장 BUN 및 AST 수준은 제조업체의 지침에 따라 BUN Wako Test 및 transaminase CII-Test Wako(FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Japan)를 사용하여 결정되었습니다.8) 합계신장MDA 수준은 제조사의 지침에 따라 비색 마이크로플레이트 분석(Oxford Biomedical Research, MI, USA)을 통해 측정되었습니다.8)
웨스턴 블롯 분석
에서 추출한 단백질 샘플(50 µg)신장10% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 분리했습니다.10) 사용된 1차 항체는 다음과 같습니다(모두 1:1500로 희석): 마우스 수용체-상호작용 단백질(RIP) 1 모노클로날 항체, 마우스 RIP3 모노클로날 항체 및 마우스 글루타티온 퍼옥시다제 4(GPX4) 모노클로날 항체(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); 토끼 절단 카스파제{10} 다클론 항체(Cell Signaling Technology); 및 마우스-액틴 모노클로날 항체(Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Japan).
통계 분석
Tukey-Kramer 사후 테스트를 사용하여 다중 비교를 수행했습니다. 모든 통계 분석은 SPSS 25.{2}} 소프트웨어(미국 일리노이주 시카고)를 사용하여 수행되었습니다. p가 있는 결과< 0.05="" were="" considered="" statistically="">
결과 및 논의
이 연구에서 우리는신장독성. 우리는 먼저 BB 중간 대사 산물로 인한 사망률에 대한 주사 시간의 영향을 조사했습니다. 그림 2는 생존 동물의 수와 주사 후 평균 생존 시간(MST) 7일을 보여줍니다. 3-BrP가 ZT10 및 ZT14에 투여되었을 때 모든 마우스가 4시간 이내에 사망했습니다(0%)(그림 2A). 대조적으로, 3-BrP가 ZT6 및 ZT22에 투여되었을 때 3마리(60%)의 마우스가 생존했습니다. ZT2 및 ZT18에 투여했을 때, 생존한 마우스의 수는 각각 1마리 및 2마리(20% 및 40%)였다. BrHQ 투여 후, 모든 ZT 그룹에서 투여 후 4시간 이내에 마우스의 사망이 관찰되었다. 투여 후 7일째에 ZT14 및 ZT18 그룹에서는 마우스가 생존하지 않았고 ZT2 및 ZT6 그룹에서는 3마리(60%)가 생존하였다. ZT10 및 ZT 22 그룹에서 생존 마우스의 수는 각각 2마리 및 1마리(40% 및 20%)였다(도 2B). 4-BrC 투여 후 ZT14 또는 ZT18(0%)을 투여했을 때 모든 마우스는 3일 이내에 사망했으며 다른 ZT 그룹에서는 한 마리 또는 두 마리(20 또는 40%)만 생존했습니다(그림 2C). MST는 모든 그룹에서 생존한 마우스의 수와 거의 일치했습니다(그림 2D-F). 이러한 결과는 세 가지 BB 중간 대사 산물의 치명적인 시간 독성을 나타냅니다. ZT14(암기) 투여 후, 3가지 대사 산물 모두 높은 독성을 나타냈다. 흥미롭게도 이러한 BB 대사 산물의 시간 독성 패턴은 BB 자체의 시간 독성 패턴과 다릅니다. 즉, 어두운 단계에서 BB에 노출된 마우스는 독성에 대한 민감도가 낮았습니다. 9) 이전 연구의 이러한 결과는 본 연구의 결과와 모순되지 않으며 BB와 세 가지 BB 중간 대사 산물의 독성 차이가 표적 기관에 기인한다는 것을 시사합니다. . BB는 간을 표적으로 하는 반면 중간 대사산물은 간을 표적으로 합니다.신장.
다음으로 치명적이지 않은 4-BrC(165mg/kg) 용량을 사용하여 장기 독성의 중증도에 대한 주사 시간의 영향을 조사했습니다. 위에서 설명한 3-BrP 및 BrHQ 주사로 4시간 이내에 조기 사망이 관찰되었으므로 우리는 후속 실험을 위해 4-BrC만 선택했습니다. 실험의 편의를 위해 주입 시간으로 ZT2 및 ZT14를 선택했습니다. ZT2 그룹에서 신독성의 지표인 BUN의 혈장 수준은 4-BrC 노출 후 증가하지 않았습니다. 그러나 BUN 수준은 ZT14 그룹에서 현저하게 증가했습니다(그림 3A). BUN과 병행하여 간독성 지표인 혈장 AST 수치를 측정했습니다. 4-BrC 투여는 ZT2와 ZT14 모두에서 혈장 AST 수준에 영향을 미치지 않았으며(그림 3B), 4-BrC가신장. 또한, 우리는 산화 스트레스 지표로서 MDA의 수준을 추정했습니다.신장. 4-BrC의 투여는 ZT14 및 ZT2 그룹에서 신장 MDA 수준을 유의하게 증가시켰습니다. 그러나 ZT2 주사 그룹의 MDA 수준은 ZT14 그룹보다 현저히 낮았습니다(그림 3C).
현재까지 apoptosis, necroptosis, ferroptosis 등의 다양한 세포사멸 경로가 보고되고 있다.11) 또한, 4-BrC에 의한 세포사멸은 주로 괴사를 통해 매개되는 것으로 보고되었다.6) 이에 대한 연구 4-BrC에 의해 유도된 세포 사멸 유형에 따라 세포 사멸과 관련된 단백질 수준을 분석했습니다. apoptosis의 경우 cleaved caspase-3, necroptosis의 경우 RIP1/RIP3, ferroptosis의 경우 GPX4입니다. 어떤 그룹에서도 절단된 caspase-3, RIP1 및 RIP3 수준에서 명백한 변화가 관찰되지 않았으며, 이는 4-BrC에 의해 세포자멸사와 괴사가 유도되지 않음을 시사합니다(그림 4). 대조적으로, ZT14에서 4-BrC를 투여한 후 GPX4 수준의 감소가 관찰되었습니다(그림 4). 조직병리학적 분석에 의해 4-BrC로 인한 신장 괴사는 관찰되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 이는 본 연구에 사용된 4-BrC 농도가 경미한 신장 손상을 일으키고 괴사로 이어지지 않았음을 시사합니다. 이러한 결과로부터 4-BrC가 일교차를 보이는 자화상을 유발함을 시사할 수 있습니다.
이 연구에서 우리는 BB 중간 대사 산물이 시간 독성을 유발한다는 것을 보여주었습니다.신장. 대조적으로, 우리의 이전 결과는 BB-유도된 신독성을 보여주었다. 그러나 명기(light phase)와 암기(dark phase) 사이에 신장 시간 독성은 변화가 없었다.8) 선행 연구와 현재 연구 사이에 차이가 나는 결정적 이유는 아직 명확하지 않으나 심한 간독성을 유도하여 신장 시간 독성을 은폐하기 위해 발생한 것으로 생각된다. 부상. 향후 실험에서는 CYP 및/또는 부상 수준에 따라 이러한 양이 변경될 수 있으므로 각 BB-중간 대사 산물의 축적된 양을 측정해야 합니다.
많은 생물학적 요인은 발현 수준에서 24시간 주기 리듬을 보여줍니다. 예를 들어, Xu et al. 쥐에서 간 항산화 유전자 발현의 일중 변화가 보고되었습니다.12) 글루타티온(GSH)은 건강을 유지하고 독성 화합물로부터 보호하는 데 중요한 항산화제입니다. 4-BrC와 3-BrP 모두 신장 GSH 수치를 고갈시키는 것으로 보고되었습니다.4,13) Ferroptosis는 2012년에 시스테인의 수입을 억제하는 엘라스틴에 의해 유도된 세포 사멸의 형태로 제안되었습니다. GSH 고갈 및 GPX4 비활성화로 이어집니다.14) 결과에 따르면 GPX4는 4-BrC에 의해 ZT14에서만 억제되었습니다. 따라서 GSH 관련 단백질 또는 유전자는 시간 독성과 관련이 있을 수 있습니다.
결론적으로, 우리의 현재 연구는 BB가 3-BrP, BrHQ 및 4-BrC와 같은 대사 산물을 통해 신장 손상뿐만 아니라 간 손상을 유도한다는 것을 보여줍니다. 우리의 이전 보고서에서 BB에 의한 신독성의 일간 변화가 관찰되지 않은 이유는 강한 간 손상으로 인해 신장 손상이 가려졌기 때문입니다.
참조
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긴조가쿠인대학 약학대학; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Japan: b 치의학부 휴스턴에 있는 텍사스 대학교 보건 과학 센터의 두개골 안면 연구 센터; 1941 East Road, Houston, TX 77054, USA: 요코호마 약학대학 보건과학부; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, Japan. 2020년 8월 30일 접수; 2020년 10월 25일 수락됨
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