고 포도당 자극 하에서 HK-2 세포 및 엑소좀의 차등 지질체학

추상적인

비정상적인 세포 지질 대사는 당뇨병성 신장 질환(DKD)의 발생 및 진행에 매우 중요합니다. 그러나 DKD 발병의 중요한 부분인 신세뇨관 세포 및 그 엑소좀의 고포도당 자극에 의한 지질 구성 및 차등 발현은 거의 알려져 있지 않습니다. 본 연구에서는 isotope labeling과 tandem mass spectrometry에 의한 표적 지질 분석을 기반으로 HK-2 세포와 엑소좀에서 각각 총 421종과 218종의 지질을 정량하였다. 더 중요한 것은 GM3 d18:1/22:0, GM3 d18:1/16:0, GM3 d18:0/16:0, GM3 d18:1/22:1은 크게 증가한 반면 LPE18:1, LPE, CL66:4(16:1), BMP36:3, CL70:7(16:1), CL74:8(16 :1) 높은 포도당으로 자극된 HK{{4{{90}}}} 세포에서 유의하게 감소했습니다. 또한, PG36:1, FFA22:5, PC38:3, SM d18:1/16:1, CE-16:1, CE-18:3, CE-20:5, 및 CE-22:6은 유의하게 증가한 반면, GM3 d18:1/24:1, GM3은 고혈당으로 자극된 HK-2 세포에 의해 분비된 엑소좀에서 유의하게 감소했습니다. 또한 TAG, PC, CL은 HK-2 세포에 비해 엑소좀에서 유의하게 감소하였으며, LPA18:2, LPI22:5, PG32:2, FFA16:1, GM3 d18:1/18:1 , GM3 d18:1/20:1, GM3 d18:0/20:0, PC40:6p, TAG52:1(18:1), TAG52:0(18:0), CE{101 }}:5, CE-20:4, CE-22:6은 엑소좀에서만 발견되었습니다. 또한 HK-2 세포에서 PI4P의 발현은 고혈당 상태에서 감소했습니다. 이러한 데이터는 DKD의 메커니즘을 탐색하기 위한 새로운 목표를 제공하는 데 유용할 수 있습니다.

키워드

표적 지질체학; 신세뇨관; 엑소좀; 당뇨성 신장질환.

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소개

지질 대사 장애는 당뇨병성 신장 질환(DKD)의 발생 및 발달에 관여합니다[1, 2]. 고혈당 상태에서 신장의 세포 지질 조성 변화는 활성 산소 생산 증가, 미토콘드리아 기능 장애, 심지어 세포사멸을 유발할 수 있습니다[3, 4, 5, 6]. 많은 연구자들이 DKD의 발달과 진행에 있어 신세뇨관의 중요한 역할을 인정했지만, 신세뇨관의 전반적인 지질 발현이나 고혈당 자극 하에서의 변화를 다룬 연구는 거의 없습니다[7, 8]. 따라서 신세뇨관의 지질에 대한 포괄적인 정보를 얻어 DKD의 발병기전에서 지질의 역할을 더 밝히는 것이 매우 중요합니다.

최근 몇 년 동안 DKD 발병에서 엑소좀의 역할에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 자가포식-리소좀 경로와 협력하여 세포 내 스트레스를 완화할 수 있는 엑소좀은 세포 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다[9, 10]. 한편, 이들은 세포간 물질 전달 및 정보 전달을 위한 운반체 역할을 한다[11]. 최근 연구에 따르면 관형 세포와 네프론의 다른 신장 세포 유형 사이의 혼선이 질병 진행에 중요한 역할을 할 수 있음이 밝혀졌습니다[12, 13]. 엑소좀의 지질 구성이 그 특성에 영향을 미칠 수 있지만, 단백질 및 RNA에 대한 관심에 비해 연구가 덜 되었습니다[14]. 서로 다른 세포에서 분비되는 엑소좀은 지질의 종류, 함량 및 기능이 다양하기 때문에 고혈당 상태에서 신세뇨관에서 분비되는 엑소좀의 지질 조성과 차별적 발현을 밝히는 것은 신세뇨관에 관한 엑소좀 통신 메커니즘을 규명하는 이론적 근거를 제공할 것이다. .

여기에서 우리는 높은 포도당 자극 하에서 신장 세뇨관과 그 엑소좀의 차등 지질 분석을 제시하고 차등적으로 발현된 카디오리핀(CL), 모노시알로디헥소실 강글리오사이드(GM3) 및 콜레스테릴 에스테르(CE)의 지질 종을 검출했습니다. 우리는 또한 초기에 엑소좀 생산에서 포스포이노시타이드(PIP)의 역할을 탐구하고 사구체 메산지움 세포(GMC)에 의한 관형 엑소좀의 흡수를 관찰했습니다.

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행동 양식

1. 세포 배양

HK-2 인간 신장 근위 세뇨관 상피 세포주는 Shanghai Institute for Biological Sciences Cell Resource Center에서 구입했습니다. HK-2 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS; FSP500, 엑셀). 일반 포도당 DMEM/F-12은 DMEM(11966025, Gibco)과 Ham's F-12(11765054, Gibco)의 1:1 혼합물로 5.56mmol/L 포도당을 함유했습니다. 세포는 5% CO2 인큐베이터에서 37도를 유지하였다. 80% 융합에 도달하면 표준 트립신 분해 절차를 사용하여 세포를 수확하고 1:2의 분할 비율로 계대했습니다. 계대 세포를 블랭크 대조군(NG)으로서 5.5mmol·L-1 글루코스 및 고 글루코스로서 30mmol·L-1 글루코스에서 엑소좀 고갈된 FBS(CMS101.03, Cellmax)와 함께 배양하였다. 48시간 동안 그룹(HG).

2. 엑소좀 분리

HK{0}} 세포 배양 상등액에서 엑소좀을 추출하기 위해 차등 초원심분리를 사용했습니다. 요약하면, HK-2 세포 배양 상청액을 수집하고 2000×g, 4도에서 10분 동안 순차적으로 원심분리한 다음, 10000×g, 4도에서 30분간 원심분리했습니다. 세포, 세포 파편 및 큰 소포를 제거하는 분. 상청액 분획은 0.22-μm 공극 크기 필터를 사용하여 여과되었습니다. 그런 다음 여과된 샘플을 110,000 xg에서 75분 동안, 4도에서 두 번 초원심분리하여 엑소좀을 펠릿화했습니다. 생성된 엑소좀을 소량의 인산완충액(PBS)에 재현탁하고 -80도에서 보관하였다.

3. 나노입자 추적 분석(NTA)

엑소좀을 25도 수조에서 해동하고 얼음 위에 놓은 후 가변 저항 펄스 감지(TRPS)로 검출하기 위해 1X PBS로 직접 희석했습니다. 엑소좀의 크기 분포 및 농도 분석은 Izon Science의 Izon Control Suite 3.3.2와 함께 qNano Gold를 사용하여 수행되었습니다.

4. 단백질 정량 및 웨스턴 블롯팅

약. 미리 혼합된 크래킹 용액(RIPA 크래킹 용액 및 1% PMSF 억제제) 100ul를 세포 및 엑소좀 샘플에 별도로 첨가했습니다. 30분 동안 크래킹한 후, 12,000×g, 4도에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취하여 비신코닌산(BCA; Beyotime) 단백질 분석 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 소 혈청 알부민을 표준 단백질로 사용하였다.

단백질 시료는 SDS-PAGE(sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분별하였다. PVDF 막(Millipore)에 옮긴 후 다양한 일차 항체, 항-CD63(EXOAB-CD63A-1, SBI; 1:1000), 항-ALIX(YT6283, Immunoway; 1:1000)와 함께 배양하였다. ), 항-Calnexin(YT0613, Immunoway; 1:1000), 항-P62(P0067, Sigma; 1:1000) 및 항-LC3(L7543, Sigma; 1:1000), 염소 항-토끼 또는 마우스 Ig 2차 항체(180202-001, SBI; 1:5000). 향상된 화학발광(ECL; Beyotime) 기질을 사용하여 특정 밴드를 검출했습니다. -액틴(BM0627, Boster)을 내부 대조군으로 사용하였다. 상대 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정되었습니다.

5. 투과전자현미경(TEM)

5ul 샘플을 구리 망에 떨어뜨리고 실온에서 5분 동안 배양하였다. 2% 과산화 우라늄 아세테이트 한 방울을 구리 망에 첨가하고 실온에서 1분 동안 배양하였다. 상온에서 약 20분간 건조시킨 후 나노투과전자현미경(Tecnai G2 Spirit BioTwin, FEI)으로 관찰하였다.

계피 추출물

6. 표적 지질체학

Bligh와 Dyer의 방법[15]의 수정된 버전을 사용하여 지질을 추출했습니다. 모든 lipidomic 분석은 SCIEX QTRAP 6500 PLUS 시스템과 결합된 Exion 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)에서 수행되었습니다. UPLC-MS/MS 분석은 ESI(electrospray ionization) 모드에서 다음 조건으로 수행되었습니다. 커튼 가스=20, 이온 스프레이 전압=5,500 V , 온도=400 도 , 이온 소스 가스 1=35 및 이온 소스 가스 2=35. 극성 지질은 2개의 이동상: 이동상 A(클로로포름: 메탄올: 수산화암모늄, 89.5: 10: 0.5) 및 이동상 B(클로로포름:메탄올:수산화암모늄:물, 55:39:0.5:5.5). 구배 분리는 다음과 같이 수행되었습니다: 구배는 5분 동안 95% A로 유지한 다음 7분 동안 60%로 선형 감소하고 4분 동안 유지한 후 30로 감소했습니다. 퍼센트 후 15분 동안 유지하였다. 마지막으로 원래 그래디언트를 적용하고 5분 동안 유지했습니다. 다양한 지질 식별 및 정량 분석을 위해 질량 분석 다중 반응 모니터링(MRM)이 확립되었습니다[16, 17]. PE-d31(16:0/18:1), DMPE; PG-d31(16:0/18:1), DMPG; PI-d31(16:0/18:1), di-C8- PI; PS-d31(16:0/18:1), DMPS; PA-d31(16:{{1{{1{{11{115}}}}8}}4}}/18:1), PA(17:0/17:0); BMP-(14:0/14:0); LPE-17:1; LPI-17:1; LPS-17:1; LPA-17:0; GM3 d18:1/18:0-d3; d31-16:0, d{93}}:4; PC-d31(16:0/18:1), DMPC; SM d18:1/ d31-16:0, SM d18:1/12:0; LPC-17:0; Cer d18:1-d7/15:0; Sph-d18:1/17:0; CL 22:1(3)-14:1.

디아실글리세롤(DAG) 및 트리아실글리세롤(TAG)을 포함한 글리세롤 지질은 역상 HPLC/MS/MS의 수정된 버전을 사용하여 정량화되었습니다. Phenomenex Kinetex-C18 2.6µm 컬럼(id 4.6x100mm)에서 클로로포름:메탄올:{{19} }.1M 암모늄 아세테이트(100:100:4), 유속 160µl/min. d5-태그(16:0)3; d5-태그(14:0)3; d5-TAG(18:0)3은 TAG를 개별적으로 스파이크하는 데 사용되었습니다. d5-DAG(1,3-17:0); d5-DAG(1,3-18:1)는 Neutral Miss MS/MS 기술을 기반으로 개별 DAG를 스파이크하는 데 사용되었습니다.

유리 콜레스테롤, 스테롤 및 이들의 에스테르는 Cholesteryl-2,2,3,4,4,6-d6와 함께 대기압 화학 이온화(APCI) 모드에서 수행된 HPLC-MS/MS로 분석되었습니다. 옥타데코네이트; 내부 기준으로 콜레스테롤-26,26,26,27,27,27-d6.

클로로포름:메탄올:(1:1), 2.4M 염산, 0.25M EDTA를 시료에 첨가하고 저온에서 분쇄하였다. 시료를 4℃에서 3시간 동안 배양한 후 원심분리한 후 하부 유기상을 추출하였다. 2차 추출을 위해 클로로포름을 첨가한 후 유기상을 1N 염산:메탄올(1:1)로 세척하였다. 유기상을 진공 회전 농축기에서 건조시켰다. 이전에 보고된 바와 같이, 40% 메틸아민:물:n-부탄올:메탄올(36:8:9:47)을 탈아실화에 사용하고 Thermo ICS-5000 이온 크로마토그래피로 분석했습니다. PI4P, PI3P, PI4P, PI(3, 4)P2, PI(3, 5)P2, PI(4, 5)P2 및 PI(3, 4,5) P3를 사용하여 정량 분석을 위한 외부 보정 곡선을 작성했습니다. 분석. 분석은 Lipidall Technologies Company Limited에서 지원했습니다.

7. 형광현미경

엑소좀이 GMC(Sicencell)로 흡수되는 것을 시각화하기 위해, 높은 포도당 자극이 있거나 없는 HK-2 세포에 의해 분비된 동일한 양의 엑소좀을 제조업체의 지침에 따라 PKH67(mini67, Sigma)로 표지했습니다. 표지된 엑소좀을 GMC와 함께 24시간 동안 배양하였다. 컨플루언트 GMC를 PBS로 3회 세척한 후 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 30분 동안 빛을 차단했습니다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 4-6분 동안 DAPI(28718903, Solarbio)로 염색했습니다. 세 번 세척한 후, 컨플루언트 GMC를 Nikon C2 공초점 현미경을 사용하여 촬영했습니다.

8. 통계분석

GraphPad 7.0은 통계 분석 및 매핑에 적용되었습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. Student's t-test는 두 그룹 간의 비교에 사용되었습니다. P-value < 0.05는 통계적 유의성으로 간주되었습니다.

씨스탄슈 캡슐

논의

우리의 연구는 이전에 보고되지 않은 높은 포도당 자극 하에서 HK{0}} 세포와 엑소좀의 차별적으로 발현된 지질 종을 제공합니다. 흥미롭게도 GM3 d18:1/22:0, GM3 d18:1/16:0, GM3 d18:0/16:0과 같은 GM3 종 , GM3 d18:1/22:1은 고글루코스로 자극된 HK-2 세포에서 유의하게 증가하였고, GM3 d18:1/24:1, GM3은 이들의 엑소좀에서 유의하게 감소하였다. 또한, GM3 d18:1 /18:1, GM3 d18:1/20:1 및 GM3 d18:0/20:0은 엑소좀에서만 발견되었습니다. GM3는 세라마이드 골격 구조와 관련된 시알산 그룹을 특징으로 하는 포도당, 갈락토스 및 시알산으로 구성된 체내에서 가장 널리 분포된 강글리오사이드입니다[18]. 그것은 신호 전달, 증식, 분화 및 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 기능의 조절에 관여합니다. 최근 연구에 따르면 GM3의 혈청 농도는 제2형 당뇨병, 고지혈증, 비만 환자에서 더 높으며 GM3는 인슐린 수용체 제거를 촉진하고 인슐린 신호를 감소시킬 수 있습니다[19]. 우리의 결과는 높은 포도당 자극 하에서 HK-2 세포에서 모든 차별적으로 발현된 GM3 종의 상승된 수준, 특히 측면 사슬(22:0)이 있는 GM3의 증가가 가장 명백함을 나타냈습니다. 장 외. [20]은 또한 당뇨병성 신병증 마우스의 신장 피질에서 GM3 d18:1/22:0 발현이 증가한 것을 관찰했으며 이는 우리의 결과와 일치했습니다. Anela et al. [21]은 사구체에서 변하지 않은 GM3를 발견했지만 신장 세뇨관에서 GM3 발현이 크게 증가했으며 이는 신장 세뇨관에서 GM3 변화를 발견한 것과 일치합니다. Kwak et al. [22]는 streptozotocin에 의해 유도된 당뇨병 쥐의 사구체 함량에서 GM3 감소를 발견했으며, 그 후 사구체에서 전하 선택적 여과 장벽의 손실을 발견했습니다. 사구체와 세뇨관에서 GM3의 역할이 다양할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. GM3는 또한 지질 뗏목의 중요한 부분입니다[23]. 지질 뗏목에서 GM3 발현 수준의 변화는 지질 뗏목 의존성인 Na + -포도당 공수송체 2형(SGLT2) 및 신장 Na + /K + /Cl- 공수송체의 활성을 변경합니다[24]. 일부 연구자들은 GM3 농도가 높을수록 SGLT2 및 Na + /K + /Cl-수송체 활동이 증가하여 세뇨관 재흡수 및 원심성 세동맥 정수압이 증가한 다음 세뇨관 사구체 균형을 손상시켜 신세뇨관 세포 손상을 일으키는 것으로 추정했습니다. Kumariet al. [25]는 환자의 소변 엑소좀에서 GM3가 DKD와 진성 당뇨병 사이에 상당한 차이를 보였다는 것을 발견했습니다. 종합하면, 신장 세뇨관에서 고혈당 하에서 GM3의 발현 증가의 역할은 향후 연구에서 다루어져야 합니다.

중요하게도, 우리의 결과는 또한 CL66:4(16:1), CL70:7(16:1) 및 CL74:8(16:1)을 포함한 일부 CL 종들이 고혈당으로 자극된 HK{ {13}} 셀. HK-2 세포와 비교하여 CL은 엑소좀에서 유의하게 감소했습니다. CL은 거의 전적으로 미토콘드리아 내막에 위치하며 미토콘드리아 구조를 유지하는 중요한 부분입니다. 그것은 전자 전도, 아데노신 삼인산 생산, 에너지 대사 및 세포 사멸에 중요한 역할을 합니다 [26, 27]. 당뇨병에서 미토콘드리아 형태학적 변화 및 기능 장애는 종종 병적 CL 변화를 동반합니다[28,29]. 근위 신세뇨관 상피 세포는 다양한 물질의 활성 수송 및 재흡수를 유지하기 위해 충분한 ATP를 필요로 합니다. 높은 에너지 소비 세포로서 근위 세뇨관 상피 세포는 미토콘드리아가 풍부합니다[30]. 미토콘드리아 단편화는 초기 당뇨병의 근위 세뇨관 상피 세포에서 관찰되었습니다. 장 외. [31]은 CL이 1형 당뇨병이 있는 쥐에서 세뇨관 미토콘드리아 기능을 유지하는 데 필수적이라는 것을 발견했습니다. 우리의 결과는 DKD의 미토콘드리아 손상 메커니즘을 연구하기 위한 새로운 이론적 근거를 제공할 수 있습니다.

엑소좀은 자가포식-리소좀 경로와 협력하여 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 이전 연구에서는 PIP 발현 수준의 변화가 MVB의 변형을 조절함으로써 엑소좀 분비와 세포 자가포식 모두에 영향을 미칠 수 있음을 발견했습니다[32, 33, 34]. Ninaet al. [35]는 PC-3 세포에서 기질인 PI3P인 PIKfyve의 억제가 엑소좀의 분비를 증가시키고 분비성 autophagy를 유도하여 이러한 경로가 PIP에 의해 밀접하게 연결되어 있음을 발견했습니다. 위에서 언급한 내용을 바탕으로 고혈당으로 자극된 HK-2 세포에서 PIP, 엑소좀 생산 및 자가포식의 변화를 관찰했습니다. 우리의 결과는 HK-2 세포에서 높은 포도당 자극이 엑소좀의 분비와 자가포식의 활성화를 모두 자극하는 반면, PI4P 발현에서는 상당한 감소가 발견되었음을 보여주었습니다. 높은 포도당 자극에 관여하는 PIP의 엑소좀-자가포식 조절 메커니즘을 조사하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

전달자로서 엑소좀은 DKD 발병에서 세포내 신호 및 기능적 변화에 중요한 역할을 합니다[36, 37, 38]. 우리는 HK-2 세포 방출 엑소좀을 형광 표지하고 GMC에 의한 측분비 흡수를 입증했습니다. 모세포와 비교하여 엑소좀은 특별한 구성을 가지고 있어 풍부한 콜레스테롤, 스핑고지질, 포화 인지질 및 지질 뗏목 도메인으로 인해 더 안정적이고 기능적입니다[39]. 지질 조성의 작은 변화도 막의 특성에 영향을 미칠 수 있으므로 막의 기능에 큰 영향을 미칩니다. 본 연구에서는 HK-2 모세포에 비해 엑소좀에서 TAG, PC, CL이 유의하게 감소한 반면, LPA18:2, LPI22:5, PG32:2, FFA16을 포함한 13종의 지질이 다음과 같은 것을 발견했습니다. 1, GM3 d18:1/18:1, GM3 d18:1/20:1, GM3 d18:{{30}}/20:0, PC40: 6p, TAG52:1(18:1), TAG52:0(18:0), CE-20:5, CE-20:4, CE-22:6은 엑소좀. 여기에 제시된 작업은 관형 세포에 의해 방출된 엑소좀의 측분비 역할에 대한 추가 분석을 위한 기초를 제공합니다.

시탕슈 파우더

결론

결론적으로, 본 연구는 DKD의 병인을 탐구하기 위한 새로운 표적을 제공하는 지질체학 분석의 중요성을 입증했습니다. 차별적으로 발현된 지질의 기능에 대한 추가 연구와 네프론의 다른 세포 및 그 엑소좀에 대한 포괄적인 지질 연구는 DKD의 메커니즘을 추가로 설명할 새로운 관점을 제공할 수 있습니다.

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왕웨이동, 리팅팅, 리즈지에, 왕홍묘, 리우 샤오단

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