양측 투명 세포 RCC의 차별적 VHL 돌연변이 패턴은 독립적인 원발성 종양과 반대측 전이성 질환을 구별합니다.
May 24, 2023
목적
양측성, 다발성 투명 세포 신세포 암종(ccRCC) 환자가 VHL 돌연변이 분석에 의해 여러 개의 독립적으로 발생하는 원발성 종양 또는 반대측 신장뿐만 아니라 동측으로 퍼진 단일 원발성 종양을 나타내는 사례로 구별될 수 있는지 여부를 평가하기 위해. 알려진 유전성 증후군 이외의 다발성 신장암의 성질은 아직 잘 알려져 있지 않습니다.
재료 및 방법
환자당 여러 종양의 DNA를 체세포 VHL 유전자 돌연변이 및 과메틸화에 대해 평가했습니다. 공유 VHL 돌연변이가 있는 종양의 하위 집합을 표적화된 차세대 시퀀싱 분석으로 분석했습니다.
결과
이 코호트는 반대측 신장을 포함하여 전이성 확산과 일치하는 공유된 체세포 VHL 돌연변이를 입증한 다중 종양을 가진 5명의 환자를 포함했습니다. 여러 경우에 이것은 ccRCC 관련 유전자의 추가 공유 체세포 돌연변이에 의해 입증되었습니다. 대조적으로, 다발성 종양을 가진 나머지 14명의 환자는 독립적으로 발생하는 신장 종양과 일치하는 모든 분석된 종양에서 독특하고 공유되지 않는 VHL 변경을 입증했습니다. 이들 후자의 환자 중 어느 누구도 국소 전이 또는 원격 전이의 증거를 나타내지 않았다.
결론
단일 환자로부터 평가된 양측, 다초점 ccRCC 종양 내의 VHL 변경 스펙트럼은 다수의 독립적인 종양 성장과 전이를 구별할 수 있습니다. 이것은 현재 사용 가능한 임상 유전자 검사를 사용하여 수행할 수 있으며 환자 진단 및 예후의 정확성을 향상시키고 적절한 관리를 알릴 것입니다.
소개
투명 세포 신장 세포 암종(ccRCC)은 가장 흔한 유형의 신장암으로, 사례의 75%를 차지합니다. ccRCC 환자의 예후 및 관리는 임상 단계에 따라 다릅니다. 질병이 조기에 발견되고 여전히 신장 내에 국한된 경우 외과적 절제는 95%5-10-년 생존율과 관련이 있습니다. 그러나 종양이 국소적으로 또는 전신적으로 퍼지면 5-년 생존율이 각각 67% 또는 12%로 떨어집니다. 투명 세포 RCC는 가장 흔히 von-Hippel Lindau 종양 억제 유전자인 VHL의 이중대립유전자 손실을 특징으로 합니다. 기계적으로 이것은 VHL의 다른 사본의 돌연변이 또는 프로모터 과메틸화와 함께 VHL을 인코딩하는 영역을 포함하여 염색체 3p의 한 사본의 손실에 의해 달성됩니다. 체세포 VHL 유전자 변이는 산발성 ccRCC의 약 90%에서 관찰되며 유전자 돌연변이는 ccRCC의 80% 이상에서 관찰되고 CpG 섬 프로모터 과메틸화는 ccRCC의 약 8%에서 관찰됩니다.
대부분의 산발성 ccRCC 사례에서 하나의 신장에 단일 병변만 있는 반면, 일부는 하나 또는 두 신장에 여러 병변을 나타냅니다. 이 환자들은 양측 다초점(BMF) ccRCC를 나타내며 이러한 다중 종양의 특성은 진단 및 환자 관리에 영향을 미칠 수 있습니다. 프레젠테이션은 동측 신장 내에서 퍼졌거나 반대측 신장으로 전이된 단일 원발성 종양을 나타낼 수 있습니다. 여러 연구에서 동일한 환자 내에서 종양 간의 3p 손실 정도 또는 염색체 변경 스펙트럼을 비교하여 다초점 ccRCC 사례를 조사하여 전이 확산과 일치하는 공통 클론 기원을 공유하거나 각 종양이 독립적으로 발생하는 사건을 나타냄을 보여주었습니다. . 이러한 감수성은 트리클로로에틸렌(TCE)에 대한 노출과 같은 환경적 영향이나 생식계열 유전자 변형으로 인해 유발될 수 있습니다. 양측성 다발성 신장암의 알려진 원인은 유전성 종양 소인 증후군과 관련된 VHL, MET, BAP1 또는 FLCN과 같은 RCC 감수성 유전자의 생식선 돌연변이입니다. 이들 중 가장 흔한 것은 von Hippel-Lindau(VHL) 질병으로, VHL 유전자의 생식계열 변형으로 인해 발생하며 양측 다초점 ccRCC에 대한 소인을 초래합니다. 일부 BMF ccRCC 환자는 VHL 증후군을 가지지만 다초점 양측성 질환을 가진 많은 환자는 진단된 RCC 감수성 증후군이 없습니다.
전이성 또는 독립적으로 발생하는 질병의 차이를 평가하는 것은 종양의 유전적 분석을 통해 전이의 경우 공통적으로 공유되는 유전적 변이를 식별하거나 독립적인 사건의 경우 이질적인 다양한 유전적 변화를 식별할 수 있습니다. 이 두 가지 임상 증상을 구별하는 것은 적절한 환자 관리에 매우 중요합니다. 전이가 발생한 경우 환자는 전신 질환 치료를 받을 가능성이 높습니다. 대조적으로, 모든 종양이 신장 내에서 여러 개의 독립적인 사건인 경우, 환자는 국소 질환에 대해 치료를 받을 가능성이 높으며 잠재적으로 위험에 처한 가족 구성원의 스크리닝과 함께 생식계열 유전 질환에 대해 조사될 것입니다.
이 연구에서 우리는 ccRCC에서 VHL 유전자 돌연변이 분석을 유전자 마커로 활용하여 알려진 생식계열 유전적 변경이 없는 양측 다초점 ccRCC 환자 집단에서 각 환자 내의 종양을 비교했습니다. 독립적으로 발생하는 종양이 있는 환자와 반대쪽 신장으로 전이가 있는 환자의 두 환자 집단이 확인되었습니다.
Cistanche 효과
재료 및 방법
1. 환자
환자들은 임상 평가를 위해 국립 암 연구소(NCI), 국립 보건원(NIH)의 비뇨기과 종양학 분과(UOB)에서 진료를 받았습니다. 환자는 투명 세포 RCC의 병력이 있는 1차 또는 2차 친척이 1명 이상 있고 46세 이하에서 진단된 경우 조기 발병한 경우 가족력이 있는 것으로 간주되었습니다. 이 연구는 National Cancer Institute의 Institutional Review Board의 승인을 받았으며 모든 환자는 Urologic Oncology Branch 프로토콜에 대한 서면 동의서를 제공했습니다. 모든 환자에게 내부 참조를 위해 실험실에서 할당한 식별되지 않은 6-자리 번호가 제공되었습니다.
2. PCR 및 DNA 시퀀싱
Promega Maxwell 16 Blood and Tissue DNA Purification Kits(Promega, WI)를 사용하여 혈액 및 종양 조직에서 DNA를 추출했습니다. DNA 시퀀싱은 제조업체의 사양에 따라 Qiagen Taq PCR Core Kit(Qiagen, MD)를 사용한 PCR에 이어 제조업체의 사양에 따라 Big Dye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, CA)를 사용하여 양방향 시퀀싱을 수행했습니다. ABI 3130xl 또는 3730 유전자 분석기(Applied Biosystems, CA)에서 실행합니다. Sanger 시퀀싱은 National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD 20892의 CCR Genomics Core에서 수행되었습니다. 순방향 및 역방향 시퀀스는 Sequencher 5.0.1(Genecodes, MI)을 사용하여 평가되었습니다.
3. DNA 메틸화 분석
제조사의 사양에 따라 Qiagen EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen, MD)를 사용하여 DNA를 bisulfite 처리했습니다. VHL 프로모터 부근에서 메틸화 및 비메틸화/중아황산염 전환 DNA 모두에 어닐링할 수 있는 2개의 프라이머 쌍을 설계했습니다. 외부 프라이머를 사용하여 위와 같이 PCR을 수행한 다음 내부 프라이머를 사용하여 두 번째 PCR을 수행하고 제품을 위와 같이 양방향 시퀀싱했습니다.
4. Oncomine 및 TruSight Oncology 500 분석
Oncomine Comprehensive Assay v3(ThermoFisher, MA) 이상, TruSight Oncology 500(Illumina, CA), 단일 뉴클레오티드 변이, 복제 수 변이, 각각 161개에서 523개 암 드라이버 유전자의 유전자 융합 및 인델. 포르말린 고정, 파라핀 내장 샘플은 NCI 병리학 실험실의 분자 진단 섹션에서 처리되었습니다.
표준화된 시스탄체
논의
양측 다초점 신장 종양 환자를 더 잘 특성화할 수 있는 능력은 더 나은 환자 관리를 가능하게 하고 투명 세포 신장 세포 암종의 유전적 특성에 대한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 일반적으로 양측 다 초점 ccRCC의 진화에 대해서는 상대적으로 거의 알려져 있지 않습니다. 양측성 및/또는 다초점 RCC의 발현 시점 또는 최초 종양 발견 후 1년 이내의 빈도는 상대적으로 낮으며 보고된 빈도는 0.8%에서 5.4%까지 다양합니다. BMF ccRCC의 정확한 빈도를 확인하기 위해서는 보편적인 진단 기준을 가진 더 큰 코호트에 대한 추가 연구가 필요합니다. Wiklund 등은 BMF RCC가 젊은 환자에서 더 흔하다고 보고했으며 Syed 등은 추적 기간이 길수록 발병률이 증가하는 것으로 나타났습니다. 몇 가지 연구에서 동일한 환자 내에서 종양 간의 염색체 변경 범위 또는 3p 손실 정도를 비교하여 다초점 RCC가 국소 전이를 나타내는지 또는 독립적으로 발생하는 사건을 나타내는지 조사했습니다. Miyake et al과 Junker et al은 모두 전이성 퍼짐과 일치하는 동일한 환자의 종양 간에 염색체 3p 손실 또는 염색체 변경의 공유 패턴을 보인 반면, Ji et al은 독립적으로 발생하는 것과 일치하는 2명의 다른 환자의 종양에서 서로 다른 정도의 3p 손실을 보였습니다. 두 경우 모두 종양. 몇몇 증례 보고에서는 한쪽 신장에서 반대쪽 신장, 부신 또는 신장 부위로 전이가 전이되었다는 증거를 보여줍니다.
현재 연구에서 모든 환자는 양쪽 신장에서 종양이 발생했습니다. 이시성 질환은 종양이 독립적으로 성장한 그룹(3/14; 21%)보다 반대측 전이를 보인 그룹에서 더 흔했지만(4/5; 80%), 동시성 및 이시성 반대측성 질환은 두 코호트 모두에서 관찰되었습니다. . 각 환자의 종양에서 VHL 돌연변이 패턴을 분석하여 모든 환자를 전이성 질환 또는 독립적으로 발생할 가능성이 있는 국소 양측성 신장 종양에 대한 우려가 있는 것으로 지정할 수 있었습니다. 전이성 질환이 있는 환자는 모든 종양에서 공통적인 VHL 변경을 공유하는 반면, 독립적으로 발생하는 신장 종양이 있는 환자는 다른 종양에서 다른 VHL 변경을 가졌습니다.
여러 신장 종양에서 공유된 VHL 돌연변이를 입증한 환자는 전이가 아닌 생식선 모자이크 현상 VHL 돌연변이로 인해 발생할 수 있습니다. 이 경우 생식계열 돌연변이는 신장 세포 또는 신장 세포의 일부에만 존재할 수 있지만 혈액 검사에서 평가된 백혈구 또는 뺨 면봉에서 채취한 구강 세포에는 존재하지 않을 수 있습니다. 환자는 표준 검사에서 생식계열 음성으로 나타나지만 여러 개의 독립적으로 발생하는 종양에 동일한 VHL 돌연변이가 존재할 수 있습니다. 이 원리는 공유 드라이버 돌연변이가 있는 양측성 다발성 종양을 초래하는 발달 초기에 돌연변이가 있는 윌름스 종양 환자에서 최근 입증되었습니다. 중요하게도, 이 시나리오에서 종양이 진화함에 따라 독립적인 종양이 고유한 추가 돌연변이를 발생시킬 것이라는 사실도 밝혀졌습니다. 일반적으로 모자이크 현상은 드문 현상이며, 3명의 환자가 공유된 추가 체세포 유전자 돌연변이(환자 3의 경우 MTOR 및 ARID1A, 환자 4의 경우 PBRM1, SETD2 및 NFE2L2, 환자 5의 경우 PBRM1 및 KDM5C)가 있는 종양을 입증했기 때문에 이 연구에서는 가능성이 낮습니다. 모자이크가 아닌 전이로 인해 공유될 수 있었습니다. 또한 VHL 돌연변이를 공유하는 2명의 환자(환자 2 및 3)도 VHL 돌연변이의 증거를 보이지 않는 인접한 정상 신장 조직에서 시퀀싱을 수행했습니다. 마지막으로, 5명의 환자 중 4명(환자 1~4)이 신장 외부에서 전이가 발생했습니다.
참고로, 환자 5는 아직 원격 전이의 증거를 보여주지 않았습니다. 그의 가장 큰 종양은 4.8cm이고 전이성 확산 위험이 더 높은 것으로 간주될 수 있지만, 최근 절제된 7개의 종양 모두 VHL 돌연변이를 공유하고 대부분이 PBRM1 및 KDM5C 돌연변이를 공유한다는 관찰은 원격 전이에 대한 의심을 더욱 높입니다. 결과적으로 이 환자는 앞으로 특히 주의 깊고 면밀한 관찰을 통해 추적될 것입니다.
Cistanche 환약 및 건조한 Cistanche
독립적으로 발생하는 신장 종양이 있는 환자는 신장암의 가족력과 조기 발병 질환 모두에 대한 강화를 입증했으며, 둘 다 유전된 생식계열 변경의 지표입니다. 모든 환자는 알려진 신장암 유전자 병원성 변이에 대해 음성으로 선별되었으며, 이는 알려지지 않은 대체 유전적 원인이 존재할 수 있음을 시사합니다. 염색체 3p를 포함하는 생식선 전좌는 또한 ccRCC의 위험을 증가시키는 것으로 나타났으며 양측성 다초점 질환과 관련이 있습니다. 전위는 표적 유전자 배열로 감지할 수 없으며 핵형 분석이 필요합니다. 따라서 알려진 RCC 감수성 유전자에 돌연변이 없이 독립적으로 발생하는 신장 종양이 있는 환자는 염색체 3p 전좌에 대해서도 선별 검사를 받아야 합니다. 이 연구에서 독립적으로 발생하는 신장 종양 환자 14명 중 12명에 대해 핵형 분석이 가능했지만 관련 전좌는 관찰되지 않았습니다. 추가 생식계열 변경에 대한 이러한 환자의 추가 평가는 새로운 RCC 감수성 유전자를 식별할 수 있으며 VHL 돌연변이 스펙트럼 분석을 통해 이러한 환자를 선택할 수 있습니다.
환자 종양 또는 생검에 대한 표적 암 유전자 돌연변이 분석을 수행하는 것이 점차 일반화되고 있으며 이러한 분석에는 VHL 유전자뿐만 아니라 PBRM1, BAP1, SETD2 및 ARID1A와 같은 추가 ccRCC 관련 유전자가 자주 포함됩니다. 따라서, 양측 신장 종괴의 일상적인 양측 생검은 이전에 수행된 염색체 변이 기반 분석과 달리 반대측 전이와 독립적으로 발생하는 다초점 종양을 구별하는 쉽고 효율적인 방법을 제공할 수 있습니다. 전이성 질환. 몇몇 최근 연구는 ccRCC 내에 존재하는 종양 내 이질성을 강조했으며 이는 샘플링된 영역에 종양의 일부 영역에만 존재하는 돌연변이가 부족하고 부정확한 결과를 제공할 수 있기 때문에 생검 분석을 혼란스럽게 할 수 있습니다. VHL 돌연변이 평가의 장점은 대부분의 ccRCC에 존재하고 전체 종양에 걸쳐 나타나는 초기 절단 돌연변이이므로 생검은 거의 항상 정보를 제공해야 한다는 것입니다.
전이성 질환 또는 국소적으로 독립적으로 발생하는 신장 종양을 가진 환자를 구별할 수 있는 것의 중요성은 이들이 다르게 관리되고 잠재적으로 뚜렷하게 다른 결과를 가질 수 있다는 것입니다. 신장 외부 전이의 증거는 결정적이지만 BMF ccRCC가 있는 환자의 영상은 정확한 지정을 허용하지 않습니다. 이 연구에서 이 문제는 환자 4, 9, 19에서 가장 잘 예시됩니다. 환자 3명 모두 한쪽 신장에 큰 종양이 있고 반대측 신장에 작은 종양이 있는 양측성 질환이 있고 신장 외부에 병변이 동시에 있다는 증거가 없기 때문입니다. 신장. VHL 돌연변이 분석 없이 유일하게 눈에 띄는 특징은 환자 19가 36세에 가장 어린 나이에 발병했고 환자 9가 62세에 가장 늦게 발병했다는 것입니다. 독립적으로 발생하는 신장 종양과 일치하는 다른 종양. 반대로, 환자 3은 공통 기원 및 반대쪽 전이와 일치하는 모든 종양에서 동일한 공유 VHL 돌연변이를 가졌습니다. 이것은 환자 3의 모든 종양에서 MTOR 및 ARID1A에서 공유된 추가 체세포 돌연변이의 공유된 존재에 의해 뒷받침되었습니다. 따라서 환자 9와 19는 종양의 외과적 절제와 일상적인 감시로 치료할 수 있는 반면, 환자 3은 전이성 질환 환자에게 적합한 전신 요법으로 치료할 수 있습니다.
결론적으로, BMF ccRCC의 VHL 변형 분석은 반대측 전이성 신장 종양과 국부적이고 독립적으로 발생하는 신장 종양을 구별하는 데 도움이 될 수 있으며 이는 환자 관리 및 결과에 영향을 미치는 데 사용될 수 있습니다.
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