분화, 신장, 신생식, 네프론 선조,

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요약

태아 기간 동안 정의된 네프론 자질은 평생 동안 신장 및 관련 심혈관 건강을 결정합니다. 우리는 여기에 부정적인 영향에도 불구하고 보여줍니다.신장 성장, GDNF의 유전적 증가는 정상적인 중단을 넘어 신장 프로그램을 연장합니다. 다단계 기계론적 분석은 과도한 GDNF가 분비된 표적의 증가된 발현 및 증대된 WNT 신호를 통해 네프론 전구체 및 신생을 유지하여 네프론 전구체 유지에 대한 두 부분 효과로 이어지는 것으로 밝혀졌습니다. 비정상적으로 높은 GDNF in 배아 신장이 상향 조절그것의 알려진 표적뿐만 아니라 Wnt9b 및 Axin2도 nephron progenitor 증식의 수반되는 감속과 함께. 출생 후 GDNF 수준의 감소신장이 정상화되다형태학적으로나 분자적으로 정상적인 출생 후 네프론 전구 자가 재생 및 분화에 의해 입증된 바와 같이 요관 봉오리를 형성하고 신장 프로그램의 지속을 위한 허용 환경을 만듭니다. 이러한 결과는 과잉 GDNF가 마우스의 네프론 전구세포에 이상 효과를 가지며, 이는 태아 및 출생 후 기간 동안 GDNF 투여량 조작에 충실하게 반응할 수 있음을 입증합니다. 우리의 결과는 신호 활성 수준을 감지하는 것이 GDNF 및 기타 분자가 네프론 전구 세포 수명 사양에 기여하는 중요한 메커니즘임을 시사합니다.

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소개

포유동물의 신장은 필수적인 해독 및 전해질 균형 기능을 가진 재생되지 않는 혈액 여과 기관입니다.

이러한 기능을 수행하는 네프론은 태아 기간 동안 태어납니다. 성인 신장은 제한된 복구 능력이나 보상적 사구체 확장(비대)만을 보이기 때문입니다(Chawla and Kimmel, 2012; Rinkevich et al., 2014; Romagnani et al., 2013). 선천성 낮은 네프론 질량은 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 말기 신장 질환에 대해 널리 인정되는 위험 인자이며(Bertram et al., 2011; Hoy et al., 2008) 따라서 평생 동안 신장 건강에 큰 영향을 미칩니다. 신장 프로그램은 인간의 임신 주35-37와 생쥐의 경우 출생 후 3일 사이에 종료되지만(Hartman et al., 2007; Hinchliffe et al., 1991; Ryan et al., 2018) 중단에 대한 이해가 부족합니다. 성장 패턴의 단계별 변화(Cebrián et al., 2004)와 세포 고유의 연령 감지 메커니즘(Chen et al., 2015a)이 관련되어 있다고 가정되었습니다. 분자적으로, 골 형태 형성 단백질(BMP)-유도된 SMAD 신호 전달(Brown et al., 2015), 하마르틴(Tsc1)(Volovelsky et al., 2018) 및 microRNA 조절(Yermalovich et al., 2019)이 신장의 결정에 참여합니다. 프로그램 기간. 그러나, 신장 프로그램의 가소성은 완전히 탐구되지 않았습니다. 네프론은 후신 또는 캡 중간엽이라고도 하는 네프론 전구체(NP) 풀과 구별됩니다. SIX2, 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF) 및 CITED1을 포함하는 마커의 고유한 레퍼토리를 발현하는 NP는 확립된 각 요관 봉오리(UB) 팁을 둘러싸는 배아 신장에만 존재합니다(Boyle et al., 2008; Self et al., 2006). 신생 과정은 미분화된 NP 집단에서 자가 재생을 동시에 유지하고 NP의 하위 집합이 잘 정의된 전구체 단계를 통해 점진적인 중간엽에서 상피로의 전환을 겪도록 유도하는 UB 분기와 동기화됩니다(세관 전 응집체, PA, 신장 소포 , RV, 쉼표 모양의 몸체, CSB, S 모양의 몸체, SSB), 결국 기능적인 네프론으로 분화됩니다(Kobayashi et al., 2008; Lindström et al., 2018). NP 집단 내에서 자가 재생 대 분화의 균형은 UB와 인접 중간엽 사이에서 발생하는 상호 유도 조직 상호 작용을 매개하는 신호에 따라 달라집니다. GDNF 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)와 같은 후신 간엽 및 NP 유래 신호는 배아 신장의 크기가 성장하고 모양을 만들고 집합관 시스템을 확립하는 UB 형태 형성을 조절합니다(Costantini and Kopan, 2010). UB 팁에서 GDNF 활성화 RET 신호 전달은 덕트 전구체 수집 및 UB 형태 형성의 제어를 담당하는 전사 프로필을 조절합니다(Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019; Lu et al., 2009; Ola et al. , 2011; Riccio et al., 2016). GDNF로 조절되는 전사체는 또한 WNT11 및 CRLF1과 같은 분비 단백질을 포함하며, 신장 프로그램을 조절할 수 있는 가능성이 입증되었습니다(O'Brien et al., 2018; Schmidt-Ott et al., 2005). 다른 UB 유래 신생식 조절자는 NP 유지 및 분화에 영향을 미치는 WNT9b 및 FGF-리간드입니다(Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). 우리는 이전에 Gdnf 3' 비번역 영역의 유전적 파괴가 내인성 GDNF의 발현을 3-~{54}}배 증가시키고 UB 분지 결함으로 인한 신장 저형성을 초래한다고 보고했습니다(Kumar et al., 2015). Gdnf 녹아웃의 신생아 치사율과 달리 Gdnfhyper/hyper 생쥐는 최대 3주까지 생존하며 관 전구 자가 재생을 수집하는 데 GDNF의 필수적인 역할을 밝혔습니다(Costantini, 2012; Kumar et al., 2015; Li et al., 2019). 여기에서 우리는 전체 신장 성장에 대한 부정적인 영향에도 불구하고 과도한 GDNF가 NP 수명을 연장하여 포유류 신장의 새로 인식된 가소성을 더욱 강화할 수 있음을 보여줍니다.

핵심 단어:분화, 신장, 신생식, 네프론 전구세포, 마우스

결과

배아 신장 프로그램은 GDNF에 따라 다릅니다.

배아 및 초기 출생 후의 6개{0}}양성 NP의 공간적 배열신장초기의 다세포층 조직이 전체 틈새 조직에 큰 영향을 미치지 않으면서 시간이 지남에 따라 얇아지는 정형적이고 잘 설명된 패턴을 따릅니다(Short et al., 2014). Gdnfhyper/hyper 신장의 NP는 비정상적으로 넓은 UB 주위에 얇은 층으로 분포되어 있습니다(그림 1A-F, 그림 S1A, B). E11.5에서 NP의 정량화는 초기 증가를 나타내었고, 이는 E12.5에서 일시적으로 정상화되었지만 Gdnfhyper/hyper 신장에서 E14.5에서 심각하게 감소했습니다(그림 1E-G, 그림 S1C-F). 유사분열 분석은 내인적으로 증가된 GDNF와 외인적으로 보충된 GDNF가 모두 pHH3와 NPC에서 상당한 감소를 유발한다는 것을 보여주었습니다(그림 1H, 그림 S1G). 종합하면, 데이터는 수용체가 발현되는 UB에서 주로 기능하는 과도한 GDNF가 초기 신장 발달 동안 NP 세포 증식의 급격한 감소를 유도한다는 것을 보여줍니다.

조기 또는 가속화된 NP 분화는 틈새 시장에서 NP 세포 감소를 유발할 수 있는 것으로 알려져 있습니다(Kobayashi et al., 2008; O'Brien, 2018). 이를 평가하기 위해 LEF1 및 cyclin D1으로 염색하여 신생식을 조사했으며, 이는 각각 가장 초기의 분화-수임 세포와 완전한 상피화가 진행 중인 네프론을 표시합니다(Lindström et al., 2015). 이것은 초기 네프론 전구체 수의 일반적인 감소를 보여주었고 배아 Gdnfhyper/hyper에서 감소된 네프론 분화를 나타냈습니다.신장(그림 2). 사구체 밀도 평가는 이를 추가로 뒷받침했으며, 야생형(WT) 신장보다 이형성 저하증 Gdnfhyper/hyper 신장에서 더 낮은 전체 밀도를 입증했습니다(그림 S1G). 흥미롭게도, 전체 측정 영역 내에서 피질 사구체의 분석, 특히 대뇌피질 대 전체 사구체 비율은 Gdnfhyper/hyper에서 WT 비율보다 약간 더 높은 것으로 나타났습니다(표 1, Gdnfhyper/hyper에서 17%, WT에서 12%). 이것은 NP 자가 재생 및 분화의 초기 감속에도 불구하고 기관 형성 동안 과도한 GDNF에 직면한 신장이 가장 피질에 위치한 가장 최근에 태어난 네프론의 약간의 증가와 함께 지속적인 출생 후 신장을 갖는다는 것을 나타냅니다(Rumballe et al., 2011; Short et al., 2014).

과도한 GDNF는 출생 후 NP 풀의 수명을 연장합니다.결핍이 있는 많은 마우스 모델신장 성장, UB 형태 형성 및/또는 네프론 분화로 인해 출생 직후 사망합니다(Kuure and Sariola, 2020). 현저한 저형성, UB 형태의 이상 및 심하게 파괴된 배아 신생에도 불구하고(그림 2), Gdnfhyper/hyper 마우스는 출생 후 최대 3주까지 생존하여(Kumar et al., 2015; Li et al., 2019) 가능성을 제공합니다. 출생 후 신생식을 검사하기 위해.

확립된 바와 같이(O'Brien, 2018), P1-P10에서 NP 개체군을 분석한 결과 P3에서 WT 신장의 극적인 손실이 나타났으며, 여기서 6{4}}양성은 주로 다음에서 검출되었습니다.

분화된 네프론 전구체와 분석된 UB 팁(틈새)의 10%만이 네프론 전구 세포(NPC)로 덮였습니다(그림 3A, n{2}} 신장). 그러나 6개의2-양성 NP가 P3에서 Gdnfhyper/hyper niches의 59%에서 검출되었습니다(그림 3B, n=2신장). 유사하게, PAX{8}}양성 NP는 P3에서 Gdnfhyper/하이퍼 신장의 NP 틈새에서 감지되었지만 PAX{10}}양성 세포는 WT에서 분화하는 네프론 전구체에만 국한되었습니다.신장(그림 3C, D).

출생 후 Gdnfhyper/hyper에서의 신생식신장WT 및 Gdnfhyper/hyper 신장에서 유사한 네프론 전구체 패턴으로 예시된 바와 같이 배아 신장에서 상당한 개선을 입증했습니다(그림 3E-H, 그림 2와 비교). 드디어,

우리는 NP 틈새 시장의 ~18%가 P4에서 6개의{1}}긍정적인 NPC를 유지하고 헌신적인 NPC가 Gdnfhyper/hyper에 있다는 것을 발견했습니다.신장P6까지는 커밋된 NPC가 WT에서 감지되었습니다.

신장P4까지만 가능합니다(그림 4, 그림 S1H). 이것은 생체 내 NP 수명이 미리 고정되어 있지 않음을 보여주고 성장 인자 수준, 특히 GDNF의 조절이 최종 네프론 분화 파동의 타이밍에 기여함을 시사합니다.

우리는 출생 후 Gdnfhyper/hyper 신장의 지속적인 NPC가 신장 저형성증으로 이어지는 UB 분지 결함에 의해 유발되는 일반적인 보상 기전의 결과이거나 대안적으로 GDNF 특이성에서 파생될 수 있다고 가정했습니다. NP 인구에 미치는 영향. 옵션을 구별하기 위해 다른 신장 저형성 모델에서 출생 후 NP를 분석했습니다. Fgf9;20-결핍신장Gdnfhyper/hyper에서 검출된 것과 유사한 배아 NP 세포층의 얇아짐을 보여줍니다(Barak et al., 2012).신장그러나 출생 후 NP 틈새에서 SIX{0}} 및/또는 PAX{1}}양성 세포를 감지하지 못했습니다(그림 S2). 이에 대해 더 자세히 설명하기 위해 다음으로 Hoxb7Cre를 분석했습니다. Mek1fl/fl; Mek2 플러스 /- 신장(Ihermann-Hella et al., 2014)에서 Gdnfhyper/hyper 마우스와 유사하게 신장 저형성증은 손상된 UB 분기로 인해 발생합니다. 이 모델은 또한 출생 후 NP 틈새(그림 S3)에서 SIX{8}} 및/또는 PAX{9}}양성 세포의 존재에 의해 감지된 바와 같이 연장된 신생식의 징후가 없었으며, 이는 신장 저형성증이 다음과 같다는 견해를 뒷받침합니다. 이는 출생 후 신생식을 유지하기에 충분하지 않습니다.

발표된 데이터는 또한 신장 저형성증만으로는 출생 후 NP 유지를 지원할 수 없음을 보여주며(Kuure and Sariola, 2020), 이는 GDNF에 대한 적극적인 역할을 추가로 시사합니다. 다만, GDNF 이외의 과잉성장인자도 같은 영향을 미칠 가능성을 완전히 배제할 수는 없다.

지속적인 출생 후 NP는 정상적인 중단을 넘어 신장 프로그램을 유지합니다.

지속적인 출생 후 NP는 정상적인 중단을 넘어 신장 프로그램을 유지합니다.

다음으로, 출생 후 Gdnfhyper/hyper에서 지속적인 NP의 분화 가능성신장조사되었다. Ki67 분석은 P4까지 WT 및 Gdnfhyper/hyper 신장에서 유사한 출생 후 증식 패턴을 보여주었습니다(그림 5A,B). P5부터 Ki{4}}양성 세포는 WT 신장의 피질 분화 영역에서 감소했습니다(그림 5C,E,G). 이러한 피질 증식의 감소는 Gdnfhyper/hyper 신장에서 검출되지 않았으며, 이는 P7에서 네프론 전구체 유사 구조에서 활발하게 순환하는 세포를 보여주었습니다(그림 5D, F,

H) 그러나 더 이상 P12에 있지 않습니다(그림 S4A, B).

출생 후 네프론 분화 분석은 Gdnfhyper/hyper에서 과도한 양의 네프론 전구체를 보여주었습니다.신장P7까지는 WT 신장에서 검출된 반면 P4까지만 검출되었습니다(그림 6, 그림 S4C-F). 그러나 이러한 지속적인 출생 후 신생식은 후기 배아 단계에서 사구체 밀도를 증가시키는 데 실패했습니다(그림 S5A-C, 각각 6.4±2.1 대 10.2±1.2, 평균±sem). P7(59%)에서 Gdnfhyper/hyper 신장의 피질 사구체 비율은 1.5배 더 높습니다.

그림 1. Nephron 조상은 배아 Gdnf hyper/hyper에서 고갈됩니다.신장. (A,B) 네프론 전구체(NP) 마커 SIX2(빨간색)는 WT(A; n{1}} 신장) 및 Gdnfhyper/hyper(B; n=5 신장) E11.5에서 신장. (C,D) E12.5 WT(C) 및 Gdnfhyper/hyper(D) 신장을 24시간 동안 시험관 내에서 배양하고 SIX2(빨간색)로 염색하여 UB(n{9} } 신장/치료, 3개의 독립적인 실험). (E,F) NP는 E14.5 WT 신장(E; 42.6/tip)에 풍부하지만 Gdnfhyper/hyper 신장에서는 NP가 명확하게 감소합니다(F; 화살표, 29.8/tip)(WT의 경우 n{16}} 및 9개의 신장/유전자형에서 분석된 Gdnfhyper/hyper tip의 경우 431).

흰색 화살표는 NP 세포(빨간색)를 가리킵니다.

(G) WT 및 Gdnfhyper/hyper의 6개{0}}양성 NP 양 분석신장E12.5에서 비슷한 초기 NP 풀을 보여줍니다. 데이터는 100%로 설정되고 4개의 독립적인 새끼(WT: 100±15.61%, n{{ 7}}, Gdnfhyper/hyper: 124.74±33.89%, n{12}}, P{13}}.533, SPSS의 양측 t-검정). (H) E12.5에서 Gdnfhyper/hyper 신장에서 증식하는 6개{17}}양성 NP의 비율은 WT 신장과 비교할 때 상당한 감소를 나타냅니다. 데이터는 100%로 설정되고 독립적인 3마리의 새끼(WT: 100±9.04%, n{{ 25}}, Gdnfhyper/hyper: 56.94±12.67%, n{30}};

*P=0.024, SPSS의 양측 t-검정). 스케일 바: 100 µm.

WT보다신장(39%) (표 1) Gdnfhyper/hyper 신장의 지속적인 출생 후 NP 풀이 정상적인 신생식 중단 후 새로운 네프론을 유도한다는 견해를 뒷받침합니다.

심한 이형성증이 심한 신장에서 신생이 연장된 Gdnfhyper/hyper 마우스는 짧은 수명 동안 신생물 또는 종양 발생의 징후를 보이지 않습니다(Kumar et al., 2015; Turconi et al., 2020).

Gdnfwt/hyper 신장은 Gdnfwt/hyper보다 NPC의 배아 감소가 더 완만함을 보여줍니다.신장. 이 쥐는 정상적인 수명을 가지고 있으며 종양이 나타나지 않습니다.신장s 및 기타 기관(Turconi et al., 2020)(그림 S6A-D, n{3}}). 그러나 배아 발생 동안 2배의 GDNF 증가는 출생 후 Gdnfwt/과신장에서 NP 개체군을 유지하는 데 실패하여(그림 S6E, F),

그림 2. 과잉 GDNF가 배아 신생식에 미치는 영향. (A) WT E14.5 신장에서 세관 ​​전 응집체, 원위 신장 소포 및 S자형 몸체의 마커인 LEF1(빨간색). (B) E14.5 Gdnfhyper/hyper 신장은 칼빈딘 염색(녹색)에 의해 검출된 바와 같이 매우 적은 LEF1-양성 분화 네프론 전구체 및 요관 봉오리(UB) 상피의 전형적인 풍부함을 보여줍니다.

(C) Cyclin D1(빨간색)은 E14.5에서 UB 상피(녹색) 옆에서 풍부하게 관찰될 수 있는 분화하는 네프론(별표는 소관 응집체 및 쉼표 모양의 몸체를 표시하고 화살표는 S 모양의 몸체를 가리킴)의 모든 전구체를 얼룩지게 합니다. WT신장.

(D) E14.5 Gdnfhyper/hyper에서 훨씬 적은 수의 분화하는 네프론 전구체가 감지됩니다.신장. (E,F) E16.5 WT(E)의 사이클린 D1(빨간색) 현지화 및

Gdnfhyper/hyper(F) 신장. 칼빈딘(녹색)

염색은 모든 이미지에서 UB 상피를 시각화합니다. 주어진 단계 n{0}} 신장/유전자형에서의 각 염색에 대해. 스케일 바: 100 µm.

표 1. E18.5 및 P7에서 Gdnfhyper/hyper 신장의 사구체 밀도 정량화

데이터는 입방 mm±sem당 네프론의 평균 양입니다(n=4개의 신장/유전자형, 동일한 사구체의 반복 횟수를 피하기 위해 125µm 간격으로 각 신장에 대해 분석된 평균 8개의 슬라이드). E18.5에서 WT 신장에서 피질 사구체의 비율은 12%인 반면, Gdnfhyper/hyper 신장에서는 17%입니다. P7에서 피질의 사구체 비율은 Gdnfhyper/hyper에서 추가로 증가합니다.신장,이는 네프론이 여전히 활발히 분화하고 있음을 시사합니다.

신장 프로그램을 조절하는 GDNF의 능력에 대한 역치 한계.

지속적인 출생 후 신 생성은 GDNF 유도 신호의 변화에 ​​달려 있습니다

Gdnf 발현은 P2(www.gudmap.org)에 의해 WT 신장에서 손실되는 반면, mRNA와 단백질은 여전히 ​​Gdnfhyper/hyper에 존재합니다.

지속적인 출생 후 신 생성은 GDNF 유도 신호의 변화에 ​​달려 있습니다

WT에서 Gdnf 표현식이 손실되었습니다.신장P2(www.gudmap.org)에 의해, 그 mRNA와 단백질은 여전히 ​​Gdnfhyper/hyper에 존재합니다.

신장P7만큼 늦게(그림 7A-D). 보존적 GDNF 수용체 복합체는 상피 UB 팁에서만 발현됩니다(Costantini, 2012;

Golden et al., 1999). NPC 개체군에 인접한 조직의 수용체 위치로 인해 내인성 GDNF 증가가 신장 형성에 미치는 영향이 매개되어야 한다고 생각했습니다.

UB 유래, 분비, GDNF 의존성 분자(http://www.signalpeptide.de/index.php)(Lu et al., 2009; Ola et al., 2011; Schmidt-Ott et al., 2005) (표 2), 또는 다른 분자, 그 표현은 특대 UB로 인해 변경될 수 있습니다.

UB 유래, 분비된 GDNF 표적의 발현 분석은 E14.5에서 Gdnfhyper/hyper 신장에서 Crlf1, Srgn 및 Wnt11의 상당한 상향 조절을 나타내었다(도 7E). 또한, Wnt9b 발현이 유의하게 증가하였다(도 7E). E14.5 대조군 및 Gdnfhyper/hyper 신장에서 WNT/-카테닌 신호 전달 표적(Clevers and Nusse, 2012)에 대한 추가 분석은 표준 표적 Axin2(P{14}}.003371)의 상당한 상향 조절을 입증한 반면, NP-발현 WNT 목표(Karner et al., 2011)는 하향 조절의 경향을 보였고, 이는 NPC의 감소된 전체 수를 반영하는 것으로 보입니다(그림 S7A). 함께, 이는 증강된 GDNF 유도 신호 전달뿐만 아니라 NPC 조절에서 알려진 기능을 가진 증가된 Wnt{20}} 및 Wnt{21}}신호 유도가 돌연변이 UB에서 인접한 NP 풀로의 상호 통신 매개에 참여한다는 것을 나타냅니다. E14.5(Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018).

그림 3. 신장 형태 형성 중단 시 네프론 분화. (A) P3 WT 신장은 캡 중간엽(화살표)에서 세포의 손실에 의해 나타난 바와 같이 피질의 SIX2-양성 네프론 전구 세포(NP)를 잃었습니다. 대신, SIX2는 측면 간엽 및 초기 네프론 전구체(화살촉)에 국한됩니다.

48개의 NP 틈새(분석된 팁 번호)를 정량화한 결과 NP가 있는 틈새는 5개뿐이었습니다. (B) SIX2에 대해 양성인 캡 중간엽은 여전히 ​​P3에서 Gdnfhyper/hyper 신장에 존재합니다(화살표). 107개의 NP 틈새(분석된 팁 번호)의 정량화는 NP 세포가 있는 63개의 틈새를 밝혀냈습니다. (C,D) WT(C) 및 Gdnfhyper/hyper에서 PAX2(빨간색) 및 칼빈딘(녹색) 염색

(D) P3의 신장. 화살표는 Gdnfhyper/hyper에서 NP 세포가 유지되는 위치를 가리킵니다.신장.

(E,F) P3 WT(E) 및 Gdnfhyper/hyper에서 사이클린 D{0}}양성(적색) 네프론 전구체의 동등한 양

(F) 신장. (G,H) LEF{0}}양성 네프론 전구체(빨간색) 및 요관 상피(녹색)의 시각화는 WT에서 유사한 진행 중인 신형성을 나타냅니다.

(G) 및 Gdnfhyper/hyper(H) 신장. 각 염색에 대해

n=3 신장/유전자형. 스케일 바: 100 µm.

P5 Gdnfhyper/hyper의 분자 특성화신장Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 및 Uncx4.1(Uncx라고도 함)의 지속적인 상향 조절을 보여주었지만 잠재적인 틈새 인자 Lama1(Rayagiri et al., 2018), 네프론 분화 유도제 Wnt4(Stark et al. , 1994) 및 WNT 신호전달 작용제 R-스폰딘 1(Rspo1)(도 7F, 도 S7B). 이러한 전사 프로파일은 감소된 Fgf9 및 Fgf20 발현 및 SIX2 플러스 세포의 이동된 국소화를 기반으로 분화 파동을 겪는 것으로 보이는 NP에 대한 UB-유도된 효과의 증가를 시사한다(도 4C, D 및 7F). 우리는 가장 크게 증가한 Crfl1, Wnt11 및 Wnt9b 발현이 마우스의 신생 프로그램에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 기능적으로 테스트했습니다. 생리학적 리간드 카디오트로핀 유사 사이토카인과 복합된 CRLF1은 분리된 쥐의 신장 중간엽 배양에서 분화를 유도합니다(Schmidt-Ott et al., 2005). Crfl{28}}녹아웃 신장의 특성화는 WT 신장과 유사한 신장 크기 및 신생식을 나타내었으며(그림 S6C-F), 이는 생체내에서 필수적인 CRLF1 기능을 시사합니다. 과잉 GDNF로 인한 표현형에 대한 증가된 표준 WNT 신호전달의 기여가 다음에 테스트되었습니다. IWR1은 정상적인 신장 발달에 필요한 탄키라제 1과 2를 억제합니다(Chen et al., 2009; Huang et al., 2009; Karner et al., 2010). IWR1 처리는 과도한 GDNF가 있는 경우 UB 팁 수와 형태를 완화했습니다(그림 S8). 마지막으로, 우리는 Gdnfhyper/hyper 신장에서 크게 증가한 Wnt11 발현이 Gdnfhyper 배경에 Wnt11 녹아웃 대립유전자를 교차시킴으로써 Gdnfhyper/hyper 마우스에서 연장된 신장 프로그램에 기여하는지 여부를 물었습니다. 이것은 이중 동형 접합체를 생성하지 못했습니다

그림 4. 네프론 전구체는 출생 후 Gdnfhyper/hyper 신장에서 지속적으로 유지됩니다. (A,B) P4(A) 및 P6(B)에서 WT의 네프론 전구(NP) 마커 SIX2(빨간색)의 위치는 SIX2가 약하게 양성인 신장 소포(별표)에서만 발견되는 WT 신장에서 NP의 손실을 보여줍니다. . (C) P4의 Gdnfhyper/hyper 신장에서 SIX2는 요관 봉오리(녹색) 팁(화살표)을 덮는 NP에도 국한됩니다(WT의 n{7}} 팁 및 4개의 신장/유전자형에서 분석된 Gdnfhyper/hyper의 245개). (D) P6 Gdnfhyper/hyper 신장에서 SIX2(적색) 및 calbindin(녹색)의 위치는 돌연변이 신장(n{12}} 신장/유전자형)에서 수임된 NP 세포(13, *는 분화하는 네프론을 나타냄)의 지속성을 나타냅니다. . NP 세포 틈새의 정량화는 WT 신장에 6개의{13}}양성 NP가 없는 팁이 거의 없는 반면 Gdnfhyper/hyper 신장의 틈새(n{15}}, 16개 틈새)의 틈새가 동반되었습니다. 헌신적이고 차별화되는 네프론 전구체에서 6가지{17}}양성. 스케일 바: 100 µm.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− 자손(표 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 + /− 번식). 이러한 결과는 Gdnfhyper/hyper;Wnt11-/- 돌연변이체에 대한 배아 치사율을 나타내며 우리는 Gdnfhyper/hyper;Wnt11 + /- 신장에 대한 분석에 집중하도록 했습니다. Gdnfhyper/hyper 배경에서 하나의 Wnt11 대립유전자를 제거하면 UB 형태가 약간 개선되었고 Gdnfhyper/hyper 신장에서보다 신장 크기가 더 감소했는데, 이는 아마도 Wnt11 투여량 감소 시 집합관 낭종의 형성 감소를 반영하는 것 같습니다(그림 S9A-C). 그러나 6개의{12}}양성 NP 개체군이 향상되었으며(E14.5에서 29.8 NPC/tip 대 40.7 NPC/tip 및 P0에서 20.3 NPC/tip 대 30.9) Gdnfhyper/hyper의 피질 분화 영역에서 신생화가 개선되었습니다. ;Wnt1 + /- 신장(그림 8, 그림 S9D-F, 그림 1F와 비교). 따라서 이러한 결과는 증가된 GDNF 수준이 단독으로가 아니라 서로 결합하여 그리고 증가된 표준 WNT 신호와 함께 배아 신장에서 NPC를 조절하는 여러 새싹 유래 GDNF/Ret 표적을 증가시킨다는 것을 시사합니다.

토론 네프론 수는 태아기 동안 정의되며 개인마다 크게 다를 수 있습니다. NP 확장 및 수명은 최종 네프론 부여에 큰 영향을 미치므로 NP 자가 재생을 제어하는 ​​조절 메커니즘의 식별이 중요합니다. 여기에서 우리는 신장 발달을 시작하고 UB 형태 형성을 조절하는 것으로 알려진 신경영양 인자 GDNF(Costantini, 2010; Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019)가 신장 성장에 대한 부정적인 영향에도 불구하고 할 수 있음을 보여줍니다. 정상적인 중단을 넘어 신장 프로그램을 연장하는 것. 우리의 결과는 초과 GDNF가 NP 자가 재생 및 유지에 2상 효과가 있음을 보여줍니다. 우리의 분석을 기반으로, 우리는 Gdnfhyper/hyper 신장에서 과잉 GDNF가 어떻게 기능하는지에 대한 모델을 제안합니다

세포주기 진행과 성장 인자 수준을 감지하는 능력의 변화를 포함하는 메커니즘을 통해. 초기에 배아 신장에서 높은 GDNF 수준은 틈새당 NP 수의 급격한 감소를 유발하며, 이는 UB의 1차 결핍이 있는 많은 마우스 모델에서 일반적입니다(Carroll and Das, 2013; Chen et al., 2015b; Costantini and Kopan, 2010; Liu et al., 2018). 이러한 이전에 발표된 모델에서 볼 수 있는 조기 NP 감소는 일반적으로 시기 적절하지 않은 분화로 인해 발생하며, 이는 Gdnfhyper/hyper 신장의 경우가 아닙니다. 대신, 과도한 GDNF는 WT 신장에서 볼 수 있는 것보다 훨씬 더 오래 산후 신장 피질에서 활성 세포 주기를 유지할 수 있습니다. 증식은 WT 신장보다 오래 유지되는 NP 세포에서 발생하며 계속해서 새로운 네프론을 생성합니다. 앞으로 UB 형태 형성에 심각한 영향을 주어 전반적인 장기 성장을 왜곡시키지 않으면서 지속적인 산후 신형성에 유리한 방식으로 과잉 GDNF를 투여하는 것이 가능한지 여부를 보는 것이 흥미로울 것입니다. 우리의 데이터는 Gdnfhyper/hyper 신장의 배아 NP의 초기 감소가 조기 분화 증가보다는 감소된 세포 증식으로 인한 것임을 보여줍니다. 이 세포 메커니즘은 알려진 GDNF 표적(Crlf1, Wnt11 및 Srgn)(Lu et al., 2009; Ola et al., 2011)과 NP 세포 유지 신호의 중요한 조절자(Wnt9b, Wnt11 및 그 전사 표적)(Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; O'Brien et al., 2018). 디프테리아 독소 A로 NP 개체군을 제거하거나 MAPK/ERK 활성화를 방해하여 NP 세포의 수명과 탄력성에 대한 이전 조사는 둘 다 수명에 긍정적인 영향 없이 NP 세포의 급격한 감소를 초래했습니다(Cebrián et al., 2014 ; Ihermann-Hella et al., 2018), 우리의 결과와 함께 NP 세포 증식이 본질적으로 전체 수명을 정의하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 일치하게, 후기 배아 신장의 NP 세포는 현저하게 감소된 증식 속도와 가속화된 분화를 나타내는 반면, 오래된 NP 세포를 초기 단계의 신장에 이식하면 수명이 연장됩니다(Chen et al., 2015a). 우리의 결과를 바탕으로 우리는 GDNF가 NP 세포가 발달 연령과 궁극적으로 수명을 감지하는 메커니즘에 기여한다고 제안합니다. 정상 신장에서 GDNF 발현은 신장 형태 형성 초기 및 활성 성장기 동안 높은 반면, GDNF 수준의 명백한 감소는 후기 배아 신장에서 발생하여 초기 출생 후 단계까지 발현 손실을 초래한다(그림 7 및 9) . 초기 Gdnfhyper/hyper 신장의 GDNF 수준은 비정상적으로 높으며, 이는 NP 세포 증식을 억제하는 것으로 보이며, 이는 변경된 WNT 경로와 같은 돌연변이 UB 내에서 감지된 세포 및 분자 변화로 인한 것 같습니다.

NPC 생물학(Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). WT 신장과 유사하게, Gdnf mRNA 및 GDNF 단백질 수준은 Gdnf가 전사 후 수준에서 조작되어 발현의 내인성 시간 조절을 허용하는 출생 후 Gdnfhyper/hyper 신장에서 감소합니다(Kumar et al., 2015). 아마도 이것은 GDNF 발현을 NP 세포 자가 재생 및 분화를 허용하는 수준으로 감소시키며, 이는 출생 후 신장에서 지속적인 신 생성 프로그램으로 감지됩니다(그림 9). 신장 분화에서 이와 같이 새롭게 인식된 성장 인자 의존적 가소성은 향후 재생 목적으로 사용되기를 희망합니다. 네프론 분화 기간을 연장할 가능성에 대한 첫 번째 단서는 BMP/

그림 5. 출생 후 Gdnfhyper/hyper 신장에서 지속적인 피질 증식. (A,B) P4 WT(A) 및 Gdnfhyper/hyper(B) 신장에서 Ki67 염색은 두 유전자형의 피질 신장(빨간색 화살표)에서 유사한 패턴의 증식 세포를 보여줍니다. (C,D) P5 WT 신장에서 (C) Ki{4}}양성은 피질에서 상당히 감소한 반면(빨간색 화살표), Gdnfhyper/hyper 신장(D)은 여전히 ​​국소적으로 매우 높은 증식(빨간색 화살표)을 나타냅니다. (E, F) WT 피질 신장(E)의 증식은 P6에서 추가로 감소되는 반면, Gdnfhyper/hyper 신장(F)에서는 고도로 활성 상태를 유지합니다. (G,H) Ki67-양성 증식 세포는 P7 WT 신장(G)의 수질 세뇨관(검은색 화살표)에 국한되지만 활성 증식은 Gdnfhyper/hyper 신장의 피질 분화 네프론 구조(빨간색 화살표)에서 여전히 감지됩니다. (시간). 각 산후 단계에 대해 n=3개의 신장/유전자형. 스케일 바: 1mm.

Gdnfhyper/hyper 신장에서만 P7. (A,B) WT(A) 및 P4의 Gdnfhyper/hyper(B) 신장에서 네프론 전구체 마커 LEF1(빨간색)은 두 유전자형(화살표)(n=2 신장/유전자형)에서 진행 중인 신장 생성을 보여줍니다. (C,D) P5 WT 신장(C)은 피질에서 매우 적은 LEF{5}}양성 세포를 나타내는 반면, Gdnfhyper/hyper 신장(D; 화살표; n{6}} 신장/유전자형)에서는 충분한 신생합성이 검출됩니다. . (E,F) LEF1은 P6(E)에서 WT 신장의 피질에 더 이상 존재하지 않는 반면, 풍부한 네프론 전구체는 Gdnfhyper/hyper 신장(F)(n=3 신장/유전자형)에서 여전히 검출됩니다. (G) 사이클린 D1(흰색) 및 JAG1(빨간색)은 P7 WT 신장(n{13}} 신장)에서 네프론의 분화된 원위 세뇨관(노란색 화살표 및 화살촉)에 국한됩니다. (H) P7에서 Gdnfhyper/hyper 신장 cyclin D1 및 JAG1은 피질 분화 영역에서 네프론 전구체의 쉼표 모양(화살촉) 및 S 모양(화살표) 몸체에 국한되어 이 늦은 출생 후 단계에서 지속적인 신 생성을 나타냅니다(n{ {19}} 신장). 스케일 바: 100 µm.

SMAD1/5 신호 전달은 비히클 처리된 신장에서보다 더 많은 네프론을 포함하는 약간 더 큰 신장으로 이어졌습니다(Brown et al., 2015). mTOR 억제제를 인코딩하는 Tsc1의 감소된 투여량은 배아 NP 세포 수에 대한 보고된 영향 없이 NP 세포를 추가로 하루 동안 유지합니다(Volovelsky et al., 2018). 연장된 신생식은 Lin28, Lin28b의 과발현 또는 Let{8}} 비활성화된 쥐에서도 관찰되었습니다(Let-7a1; Let{11}}d; Let{12}}f1)(Urbach et al ., 2014; Yermalovich et al., 2019), 소아 신장암 Wilms 종양과 관련된 Igf2 또는 H19h 유전자좌의 직접적인 종양 형성 또는 활성화도 보여줍니다(Chen et al., 2018; Ogawa et al., 1993). 참고로, 이형성증이 있고 3주 동안 생명과 양립할 수 있는 Gdnfhyper/hyper 신장에서는 pSMAD1/5 위치 또는 수준의 변화가 감지되지 않았습니다.

현재의 연구는 이전에 내인성 Gdnf 투여량을 감소시키고 네프론 보유량을 감소시켜 조사한 신생에서 GDNF 기능의 특성화에 중점을 둡니다(Cullen-McEwen et al., 2001, 2003). GDNF에 대한 표준 수용체 복합체는 UB 상피에서만 독점적으로 공동 발현되는 RET 티로신 키나제 및 그 공동 수용체 GFRa1에 의해 형성됩니다(Costantini, 2012; Golden et al., 1999; Pachnis et al., 1993). . GDNF는 UB 팁 세포의 핵심 틈새 요소입니다(Chi et al., 2009; Riccio et al., 2016; Shakya et al., 2005). 우리는 이전에 과도한 GDNF가 요관 줄기 신장을 희생시키면서 덕트 전구 풀을 확장하여 전구 운동성의 결함과 단축된 세포 주기 길이로 인해 확장된 팁 및 짧은 몸통 표현형을 초래한다는 것을 보여주었습니다(Li et al., 2019). 배아 단계에서 비정상적으로 결합된 효과

그림 7. 중요한 신장 발달 조절 인자의 발현 분석. (A) P4에서 Gdnf의 제자리 혼성화 분석은 WT 신장(n{2}} 신장)에서 전사체를 검출할 수 없습니다. (B) Gdnf 발현은 P4 Gdnfhyper/hyper 신장에서 유지되고 과도한 GDNF(n{4}} 신장)로 인해 네프론 전구 세포가 유지되는(빨간색 화살표) 피질 분화 영역에 국한됩니다. (C) P7에서 Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/hyper 및 Gdnfhyper/hyper 신장에서 Gdnf 전사체의 qRT-PCR 분석(n{7}} 신장/유전자형). Gdnfhyper/hyper 신장에서의 Gdnf 발현은 WT(P{8}}.036) 및 Gdnfwt/ko(P=0.038)(SPSS의 평균±sem, 양측 t-검정)보다 상당히 높습니다. ). (D) P7 신장(n{15}} 신장/유전자형)에서 GDNF 단백질 수준의 ELISA 분석(mean±sem). (E,F) E14(E) 및 P5(F)에서 선택된 유전자의 상대적 발현 수준의 qRT-PCR 기반 정량화(주어진 단계에서 n{19}}신장/유전자형). UB 유래 분비 GDNF 표적은 점선 위에 나열되어 있는 반면 다른 알려진 신생식 조절 인자는 선 아래에 나와 있습니다. Gdnfhyper/하이퍼 신장은 Crlf1(*P{22}}.019), Srgn(*P{24}}.021), Wnt11(**P=0.001) 및 Wnt9b( **P=0.01) E14에서 반면 P5에서는 Crlf1(**P=0.009), Etv4(**P=0) 유전자 발현이 크게 증가했습니다.{{ 39}}), Etv5(*P=0.03), Lama1(*P=0.014) 및 Wnt4(*P=0.026). 대조적으로, Sostdc1(**P=0.{51}}), Fgf9(**P=0.001) 및 Fgf20(**P=0.001 )은 P5에서 Gdnfhyper/hyper 신장에서 유의하게 감소합니다. 스케일 바: 100 µm.

높은 GDNF, 비정상적인 UB 팁 형태로 인한 생물 물리학 적 변화 및 GDNF 표적 및 WNT 경로의 관련 분자 변경은 NP 세포를 증식 감소로 공동으로 밀어 넣는 것으로 보입니다. 우리는 확장된 UB 팁 형태가 시간이 지남에 따라 개선되지만 출생 후 Gdnfhyper/hyper 신장에서 P4까지 온화한 형태로 지속된다는 것을 보여줍니다(그림 5). UB 팁 세포는 분자적으로 P5 Gdnfhyper/hyper 신장에 여전히 존재하며, 이는 높은 수준의 GDNF 조절 팁 마커 Crlf1, Etv4, Etv5 및 Lama1, NPC 발현 표준 WNT 표적 Cited1 및 Uncx4.1, WNT 효능제 R을 발현합니다. -spondin1(그림 7E,F, 그림 S7A,B)(Karner et al., 2011; Lu et al., 2009; Vidal et al., 2020). 따라서 출생 후 UB의 이러한 분자 변화는 P2/P3를 넘어 지속적인 NP 자가 재생을 위한 유리한 환경을 제공할 가능성이 있습니다. 우리는 증강 표준 WNT와 함께 GDNF 표적으로 UB 유래 분비 CRLF1 및 WNT11을 확인했습니다.

증가된 Wnt9b 발현에 의해 추가로 강화된 신호전달은 NP 조절에 미치는 영향을 매개합니다. 우리의 데이터는 또한 CRLF1의 비활성화가 신장 분화에 영향을 미치지 않기 때문에 CRLF1의 기능이 다른 사이토카인과 중복됨을 나타냅니다. WNT9b와 WNT11은 모두 NPC와 신생식의 많은 측면을 조절합니다(Carroll et al., 2005; Karner et al., 2011; Majumdar et al., 2003; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Gdnfhyper/hyper 신장에서 신형성의 많은 측면을 조절하는 것으로 알려진 UB 발현 Wnt9b의 상향 조절은 NP에서의 강제 발현을 모방할 수 있으며, 이는 유지 대 분화 평형을 방해하고(Kiefer et al., 2012), 따라서 기계적으로 기여합니다. Gdnfhyper/hyper nephrogenesis에서 불균형한 NP 자가 재생에. 이는 과도한 GDNF에 직면하는 전체 신장에서 IWR1에 의한 표준 WNT 억제 시 개선된 팁 형태에 의해 뒷받침됩니다.

표 2. 신장 프로그램에 영향을 미칠 가능성이 있는 분비된 GDNF 표적 유전자

우리의 결과는 IWR1 억제 자체가 UB 팁에 분산되고 느슨하게 부착된 NPC에 큰 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. NPC 자체의 표준 WNT 억제는 과도한 GDNF가 있을 때 표현형을 증가시키지 못하는 데 기여할 가능성이 있습니다. 이것은 Gdnfhyper/hyper 배경에서 UB-발현된 Wnt11 발현을 낮추면 NP 유지 및 분화가 개선되었지만 과도한 GDNF로 인한 신장 저형성증을 완전히 구제하지 못한 유전 실험에 의해 뒷받침됩니다. 이것은 적어도 부분적으로 Wnt11-/-의 배아 치사율로 인해 Gdnfhyper/hyper 배경에서 두 Wnt11 대립유전자를 비활성화하지 못하기 때문일 수 있습니다(Nagy et al., 2016). 따라서, 남아 있는 하나의 Wnt11 대립유전자는 이전에 제안된 대로 GDNF 캐스케이드를 증가시킬 수 있으며(Majumdar et al., 2003), 따라서 부분적으로 신생식의 완전한 구조를 금지할 수 있습니다. 우리의 현재 연구는 잠재적인 대체 신호 수용체가 NP에 의해 표현되기 때문에 NP에 대한 GDNF의 일부 효과가 비표준 GDNF 신호 전달로 인한 가능성을 배제할 수 없습니다(Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis et al., 2013; Paratcha et al., 2003). 그러나 NCAM의 결실 또는 UB에서만 Gfra1의 발현(Ret 프로모터의 제어하에 배치함으로써)은 모두 정상적인 신장 표현형을 유지한다(Cremer et al., 1994; Heuckeroth et al., 1999; Keefe Davis et al., 2013; Rossi et al., 1999; Sariola and Saarma, 2003). 이것은 적어도 NCAM이나 GFRa1 자체가 신장 프로그램에 필수적이지 않다는 것을 시사합니다. 요약하면, 우리의 실험은 파킨슨병에 대한 임상 시험이 있었고 현재 진행 중인 GDNF(Kirkeby and Barker, 2019)가 미래에 네프론 자질을 개선하기 위한 전향적 수단으로 작용할 가능성이 있음을 시사합니다. 신장 성장에 해로운 영향 없이 GDNF 신호를 과도하게 활성화할 수 있는 수단을 식별하려면 추가 실험이 필요합니다.

재료 및 방법

동물

동물 관리 및 연구 프로토콜은 동물 실험에 대한 윤리 행동 강령 및 유럽 연합 지침(지침 2010/EU/63)에 따라 수행되었으며 핀란드 국립 동물 실험 위원회의 승인을 받았습니다. 마우스를 음식과 물을 임의로 공급하여 개별적으로 환기되는 케이지에 수용했습니다. 헬싱키 대학교의 인증된 실험 동물 센터에서는 최적의 가습 및 난방이 지속적으로 제공되었습니다. Gdnfhyper(Kumar et al., 2015) 및 Fgf9;20(Barak et al., 2012) 마우스 모델의 생성 및 유전자형은 이전에 설명되었습니다. Gdnfhyper;Wnt11- 새끼는 C57BL6 Wnt11-

표 3. Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /- intercrosses의 자손 유전자형 요약

(Nagy et al., 2016) 및 Gdnfhyper 계통을 포함하고 이전에 설명한 대로 유전자형을 지정했습니다(Kumar et al., 2{64}}15; Nagy et al., 2016 ). 연구에 사용된 모든 마우스 계통은 129Ola/ICR/C57bl6 삼중 혼합 배경에서 유지되었습니다. Crlf 녹아웃 마우스의 생성은 이전에 설명되었습니다(Alexander et al., 1999). PCR 유전자형은 Crlf1에 대한 유전자 특이적 프라이머 세트(5'-GCCTAATAGGTGCTGGGTGA{{ 18}}' 및 5'-GACCCTATCTGCGTTTTCCA{21}}'). 조직 수집 배아는 이전에 설명한 대로 Theiler(1989)의 기준에 따라 준비되었고(Kuure et al., 2005), CO2로 깊은 마취에서 임산부의 자궁 경부 탈구 후에 수집되었습니다. 후기 배아 및 출생 후 새끼는 참수를 통해 희생되었습니다. 조직을 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 Dulbecco 배지에서 해부한 후 4% 파라포름알데히드(PFA) 또는 장기 배양액으로 고정했습니다. 장기 배양 E11.5 및 E12.5 마우스 배아에서 분리된 신장을 Transwell® 폴리에스테르 멤브레인 시스템(Costar)이 지원하는 공기-액체 계면에 놓고 신장 배양 배지 [F12 :DMEM(1:1) + Glutamax(Gibco)] 10% 소태아혈청과 페니실린-스트렙토마이신으로 보충(Ihermann-Hella and Kuure, 2019). NPC 정량화를 목표로 하는 100ng/ml 외인성 GDNF(ProSpec Ltd)(Sainio et al., 1997)를 사용한 시험관 내 배양의 경우, 최종 신장 기초인 후신을 포함하는 각 비뇨생식기 블록을 배쪽 선로를 따라 반으로 나누었습니다. 각 샘플의 절반은 외인성 GDNF와 함께 배양되었고 나머지 절반은 대조군으로 사용되었습니다. WNT 억제 실험은 먼저 50-100 ng/ml GDNF 및 50-100 µM IWR1(I0131-25, Sigma-Aldrich)로 테스트되었습니다. 이러한 용량 의존성 실험을 기반으로 최적 농도는 50ng/ml GDNF 및 75μM IWR1이었습니다. 조직학 및 면역염색 파라핀 절편에서 관심 마커를 조사하는 연구를 위해 표시된 단계의 배아 또는 새끼에서 신장을 절개한 다음 이전에 설명한 대로 조직 처리 및 절편을 수행했습니다(Li et al., 2019). 각 분석에는 각 신장의 최소 5개 섹션과 유전자형당 3~5개의 다른 신장이 사용되었습니다. 정확한 샘플 번호는 그림 범례에 나와 있습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 파라핀 섹션에서 수행된 면역조직화학은 이전에 설명한 대로 완료되었습니다(Li et al., 2019). 간단히 말해서, 절개된 조직을 4% PFA(pH 7.4)로 밤새 고정한 다음 자동 조직 처리기(Leica ASP 200)로 탈수 및 파라핀화했습니다. 5 µm 두께의 섹션을 준비하고 Xylene에서 탈랍한 다음 Harris H&E로 염색하거나 항원 검색 완충액(10mM 시트레이트, pH 6.0)에서 열 유도 항원 검색을 수행하기 전에 재수화했습니다. 면역염색을 위해 3% BSA를 차단(실온에서 1시간)에 사용한 다음 발색 염색을 위해 30분 0.5% 과산화수소 처리를 사용했습니다. 그런 다음 섹션을 플러스 4도에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션한 다음 실온에서 2시간 동안 종 특이적 이차 항체 인큐베이션을 수행했습니다. 발색 검출은 EnVision 검출 시스템-HRP(DAB) 키트(Dako)로 구현되었습니다.

그림 8. Wnt11 수준의 유전적 감소는 Gdnfhyper/hyper 신장에서 네프론 전구 세포 손실을 부분적으로 구합니다. (A) 6개의2-양성 네프론 전구체(NP, 빨간색)는 E14.5 Gdnfhyper/hyper 신장에서 드문드문 있습니다(9개의 신장에서 분석된 552개의 팁에서 평균 29.8 NP/tip). (B) Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /− 신장은 1개의 Wnt11 대립유전자가 없을 때 틈새당 NP의 일반적 풍부함의 증가를 나타냅니다(4개의 신장에서 분석된 107개의 팁에서 평균 4{18}}.7 NP/팁 ). (C,D) PAX{13}}Gdnfhyper/hyper(C) 및 Gdnfhyper/hyper;Wnt11 플러스 /-(D) 신장의 양성 세포는 E14.5에서 유사한 패턴과 양을 나타냅니다. (EH) P0에서 SIX2 염색은 하나의 Wnt11 대립유전자를 제거함으로써 NP 수의 개선을 보여줍니다(610 Gdnfhyper/hyper 팁에서 평균 20.3 NP/tip 대 Gdnfhyper/hyper에서 평균 30.9 NP/tip; Wnt11 plus /- 6개의 신장/유전자형에서 분석된 팁), PAX2 염색에 의해 지원됩니다. 6개의2-양성 NP(A',B',E',F') 및 PAX2- 양성 세포(C',D',G',H')의 분포는 칼빈딘 없이 표시됩니다( 녹색) 신호는 모든 신장의 UB 상피를 묘사합니다. 스케일 바: 200 µm.

전체 마운트 면역형광 염색을 거친 E11.5 및 E12.5 신장을 고정하고 1{9}}0% 얼음처럼 차가운 메탄올로 10분 동안 투과화한 후 1차 항체와 함께 밤새 배양했습니다. 대응하는 종-특이적 2차 항체와의 인큐베이션은 PBST(PBS 중 0.1% Tween 20)로 격렬하게 세척한 후 둘째 날에 실행되었습니다. 본 연구에 사용된 1차 및 2차 항체에 대한 세부 정보는 표 S1에 나열되어 있습니다. 원위치 혼성화 원위치 혼성화는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다(Ihermann Hella et al., 2014). 간단히 말해서, Gdnf 엑손에 대한 안티센스 RNA 프로브는 4% 저융점 아가로스에 포함된 P4 신장(10-15개 섹션/신장, n{17}}}개의 신장/유전자형)에서 파생된 두꺼운 섹션에 전사되고 혼성화되었습니다. (NuSieve GTG, Lonza). BM Purple은 비색 반응에 사용되었습니다.

ELISA P7.5 신장의 GDNF 단백질 수준은 이전에 보고된 바와 같이 ELISA를 통해 측정되었습니다(Kumar et al., 2015). GDNF Emax® Immunoassay(Promega)는 ELISA를 수행할 때 산 처리와 함께 사용되었습니다. 구체적으로, 각 유전자형에 대해 3개의 신장을 해부 직후에 용해시켰다. DC protein Assay(Bio-Rad)로 단백질 농도를 측정한 후 총 단백질 25μg을 ELISA 플레이트의 웰에 로딩했습니다. 각 샘플을 이중으로 분석했습니다.

이미징 HXP 120V 형광 광원이 장착된 Zeiss AxioImager, Hamamatsu Orca Flash 4.{8}} LT 흑백 카메라 및 Zeiss AxioCam 105 컬러 카메라를 사용하여 단면의 면역염색 및 제자리 하이브리드화를 이미징했습니다. 또는 Leica EL 6000 메탈 할라이드 광원 및 Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2 sCMOS 카메라가 장착된 Leica DM5000B와 함께 사용합니다. 전체 마운트 면역형광 염색은 Zeiss ApoTome 응용 프로그램과 함께 Zeiss AxioImager를 사용하여 이미지화되었습니다. 온전한 신장 크기 측정을 위한 전체 마운트 이미징은 Leica DFC7000T 카메라가 장착된 Leica MZFLIII를 사용하여 수행되었습니다. 면역염색 및 영상화에 기반한 정량적 분석 사구체 밀도의 정량화는 E18.5 및 P7 신장의 순차적 섹션에서 계산되었습니다. 신장을 절단하고 사구체 정량을 위한 절편을 사구체의 반복 횟수를 피하기 위해 125μm마다 선택했습니다. 각 섹션의 사구체 수를 수동으로 계산하고 Fiji ImageJ 소프트웨어(V1.51)로 윤곽선을 수동으로 표시하여 각 신장의 면적을 측정했습니다. 사구체 밀도를 계산하려면 사구체의 총 수

그림 9. 생쥐 신장 발달에 대한 과잉 GDNF 효과의 개략도. (A) 활성 성장 중인 배아 신장에서 네프론 전구 세포(NPC, 빨간색)는 NP 증식과 자가 재생의 균형을 제어하기 위해 요관 봉오리 끝(UBT, 진한 파란색)에서 분비된 안내 신호(예: Wnt11 및 Wnt9b)를 수신합니다. 및 관주위 응집체(PA, 핑크색 세포 클러스터)로의 분화. (B) 출생 후 신장에서 얇은 빨간색 문자로 표시된 Wnt9b, Wnt11, Crlf1 및 Etv4/5의 발현 감소에 의해 분자적으로 입증된 바와 같이 UB(UB, 연한 파란색)의 팁 ID가 손실됩니다. UB 유래 분비 인자(Wnt9b, Wnt11 및 Crlf1)의 점진적인 손실은 NP 증식 및 자가 재생의 약화에 기여합니다. 동시에 GDNF 및 FGF 수준이 감소하여 NP 분화가 가속화됩니다. 이들은 함께 NP 풀을 빠르게 고갈시켜 신생의 중단을 초래합니다. (C) 배아 신장에서 과도한 GDNF는 비정상적인 UBT 형태를 유도하고 새싹에서 파생된 분비 조절 분자(Crlf1, Sign, Wnt11 및 Wnt9b)의 발현을 증가시킵니다. 싹에서 유래한 분비 분자의 과발현은 NP 세포 주기에 억제 효과가 있어 증식과 자가 재생이 감소합니다. 감소된 Wnt4 발현에 의해 감지된 바와 같이 드롭인 전체 NP 수는 PA 분화를 늦춥니다. (D) 출생 후 신장에서 UBT 형태 및 이에 따라 NPS에 제공되는 틈새는 새싹 유래 분비 표적(Crlf1, Etv4/5 및 Lama1)의 WT 발현보다 더 높음에도 불구하고 정상화됩니다. 정규화된 Wnt9b 및 Wnt11(표시되지 않음)과 함께 이러한 분자 변화는 많은 NP 집단의 유지, 더 높은 Wnt4 발현 및 유사한 양의 네프론 전구체(분홍색 클러스터)의 유지로 입증되는 바와 같이 정상적인 NP 증식, 자가 재생 및 분화를 보조합니다. 세포의) WT 배아 신장에서와 같이. 이러한 메커니즘을 통해 자체 프로모터 아래의 구성적 GDNF 과잉은 신장 프로그램이 P7까지 계속될 수 있도록 합니다. 짙은 회색 텍스트, 변경되지 않은 표현; 빨간색 텍스트, 감소된 표현; 녹색 텍스트, 증가된 표현.

피질에 있는 사구체의 수는 별도로 계산되었습니다. 그런 다음 각 샘플에 대해 평균 총 신장 면적과 전체 및 피질 사구체 수를 계산했습니다. 평균 사구체 밀도는 평균 사구체 수를 평균 측정 면적으로 나누어 계산하였다. 전체 평균 면적 내에서 피질 사구체의 평균은 평균 피질 사구체 수를 평균 측정된 전체 면적으로 나누어 계산하였다. 온전한 모양의 사구체만 기록되었습니다. E11.5(WT의 경우 n=4, Gdnfhyper/hyper의 경우 n{4}}) 및 E12.5(n=10 신장/ 치료, 3개의 독립적인 실험)은 전체 마운트 면역형광 염색을 기반으로 했습니다. 이미지는 Zeiss ApoTome의 응용 프로그램으로 캡처된 다음 스팟 추적을 사용하여 Imaris Software(Bitplane)로 처리되었습니다. 모든 이미지는 동일한 분석 프로토콜로 처리되었습니다. 한배새끼 간의 변동을 정규화하기 위해 각 한배 새끼 내 WT 신장에서 6개의{9}양성 NP의 평균 양을 100%로 설정하고 Gdnfhyper에서 6개의{11}} 양성 NP의 양을 설정했습니다. /하이퍼 신장은 한배 새끼 내 WT 신장의 평균 양과 비교되었습니다. 외인성 GDNF로 배양된 E12.5 신장에서 6개의{12}}양성 NPS의 유사분열 지수(n{15}}개의 신장/처리, 3개의 독립적인 실험)는 한배 새끼 간의 변동을 정규화하기 위해 유사한 방식으로 계산되었습니다.

각 한배 내에서 외인성 GNDF 없이 배양된 WT 신장 및 신장에서 증식하는 SIX{0}}양성 NP의 평균 비율은 100퍼센트로 설정되었고 증식하는 SIX{{2 }}동일한 한배새끼에서 과량의 GDNF(Gdnfhyper/hyper 신장 및 외인성 적용)가 있는 경우 양성 NP가 WT 한배 새끼와 비교한 후 그림에 표시되었습니다. 외인성 GDNF와 함께 배양된 E11.5 신장에서 SIX{3}}양성 NPS의 유사분열 지수를 원래 데이터/값으로 표시했습니다. 신생 적소(E14.5 및 P0)당 평균 6개의{6}}양성 NPS 및 전구 세포가 있는 신생 적소(P{10}}P6)의 계산은 파라핀 섹션에서 면역형광 염색에 의해 수행되었습니다. 입자 분석을 사용하여 분석을 위해 선택한 각 섹션에서 6개의{12}}양성 NPS 수를 Fiji ImageJ 소프트웨어(V1.51)로 계산하고 해당 섹션에서 팁 수를 수동으로 계산했습니다. E14.5에서 분석된 샘플의 수는 WT 및 Gdnfhyper/hyper 신장의 경우 3개의 신장 및 Gdnfhyper/hyper의 경우 2개의 신장이었습니다. Wnt11 플러스 /-. E14.5에서 분석된 팁의 수는 WT에서 207개, Gdnfhyper/hyper에서 431개, Gdnfhyper/hyper에서 107개였습니다. Wnt11 플러스 /- 신장. P0에서 분석된 샘플의 수는 유전자형당 3개의 신장이었고, 해당 도면에 제시된 분석된 팁의 수는 10에서 315까지 다양하며 팁이 거의 존재하지 않는 WT P6 신장에서 가장 낮습니다. UB 팁 측정은 지정된 화학 물질이 있는 48시간 배양 후 Leica 현미경 운영 체제의 LAS X 프로그램을 사용하여 수행하고 E-cadherin 항체로 팁을 시각화했습니다(표 S1). 팁은 GDNF의 경우 101개, IWR1의 경우 131개, 75μM IWR1 및 50ng/ml GDNF의 경우 115개인 두 가지 독립적인 실험 세트의 각 조건에서 6개의 신장에서 측정되었습니다. Gdnfhyper/hyper 배경에서 Wnt11 삭제의 효과를 평가하는 실험에서 신장 크기 측정은 신장 윤곽의 수동 추적을 통해 전체 마운트 이미지에 대한 피지 ImageJ 소프트웨어(V1.51)로 수행되었습니다. 통계적 분석 Gdnf 및 Wnt11이 신장 크기에 미치는 주요 영향 분석을 제외하고 모든 값은 mean±sem으로 표시되며, 이는 mean±sd로 표시됩니다. 통계적 유의성은 P로 설정되었습니다.<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

감사의 글 이미지 분석 및 정량화 관련 기술에 귀중한 도움을 준 헬싱키 생명과학 연구소(HiLIFE)의 Biomedicum Imaging 및 Light Microscopy Units 직원에게 감사드립니다. Wnt11 마우스는 Seppo Vainio 교수(핀란드 오울루 대학교)가 친절하게 제공하여 헬싱키 대학교 HiLIFE의 실험 동물 센터로 보냈습니다.