다양한 효모 항바이러스 시스템이 LA 마이코바이러스로 인한 치명적인 발병을 예방합니다

최근 연구에 따르면 항바이러스 시스템은 박테리아에서 포유류에 이르기까지 현저하게 보존되어 있으며, 이는 미생물 유기체를 연구함으로써 이러한 시스템에 대한 독특한 통찰력을 얻을 수 있음을 보여줍니다. 그러나 파지 감염이 치명적일 수 있는 박테리아와는 달리, 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae에서는 LA라고 불리는 이중 가닥 RNA 마이코바이러스에 만성적으로 감염되어 있음에도 불구하고 세포 독성 바이러스 결과가 알려져 있지 않습니다. 이는 LA 복제를 제한하는 보존된 항바이러스 시스템이 이전에 확인되었음에도 불구하고 여전히 그렇습니다. 여기에서는 이러한 시스템이 협력하여 고온에서 성장한 세포에 치사율을 유발하는 만연한 LA 복제를 방지한다는 것을 보여줍니다. 이 발견을 활용하여 우리는 과발현 스크린을 사용하여 인간의 바이러스 선천적 면역에 관여하는 폴리A 결합 단백질(PABPC1)과 La 도메인 함유 단백질 Larp1의 효모 동족체에 대한 항바이러스 기능을 식별합니다. 보완적인 기능 손실 접근 방식을 사용하여 보존된 RNA 엑소뉴클레아제 REX2 및 MYG1에 대한 새로운 항바이러스 기능을 식별합니다. SAGA 및 PAF1 염색질 조절 복합체; 그리고 단백질 증식 억제 스트레스 반응의 주요 전사 조절자인 HSF1. 이러한 항바이러스 시스템에 대한 조사를 통해 우리는 LA 발병이 활성화된 단백질 증식 억제 스트레스 반응 및 세포 독성 단백질 응집체의 축적과 연관되어 있음을 보여줍니다. 이러한 발견은 단백질 독성 스트레스가 LA 발병의 근본 원인임을 확인하고 효모를 보존된 항바이러스 시스템의 발견 및 특성화를 위한 강력한 모델 시스템으로 더욱 발전시켰습니다.

모든 실험실 균주와 대부분의 환경적으로 분리된 신아 효모 S. cerevisiae는 LA라고 불리는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 바이러스에 감염됩니다(1, 2). LA는 광범위하게 분산된 내인성 dsRNA 바이러스인 Totiviridae 계열에 속합니다. 이 계열의 모든 바이러스와 마찬가지로 LA dsRNA 게놈은 숙주 매개 소화로부터 보호하는 비리온 내에 포장되어 있습니다. 비리온의 구멍은 대부분의 입자를 구성하는 캡시드 단백질인 Gag를 암호화하는 세포질로 RNA 전사체의 압출을 허용합니다. LA 전사체는 또한 Gag 단백질보다 훨씬 낮은 수준으로 생성되며 RNA 의존성 RNA 중합효소 활성을 보유하는 Gag-pol 융합 단백질을 암호화합니다. 각 비리온에는 입자 내 LA 복제 및 전사를 설명하는 Gag-pol 단백질이 포함되어 있습니다. 초기 입자 내에 바이러스 전사체를 캡슐화하고 Gag-pol에 의한 음성 RNA 가닥을 합성하여 dsRNA 게놈을 형성하면 LA 복제 주기가 완료됩니다(2). 이러한 단백질을 생산하기 위해 LA는 LA 전사물에 5'-메틸 캡을 제공하는 "캡 날치기" 메커니즘과 Gag 및 Gag-pol 융합 단백질을 생성하는 리보솜 프레임 이동 메커니즘을 포함하여 인간에서 발견되는 RNA 바이러스의 전형적인 특징을 사용합니다. 단일 성적표(3, 4).

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박테리아 항바이러스 시스템에 대한 최근 연구에서는 이들이 인간과 놀라운 진화적 보존을 공유하고 있으며, 이는 바이러스 선천 면역에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 미생물 유기체의 잠재력을 드러내는 것으로 나타났습니다(5-11). 실제로 LA와 관련된 초기 연구를 통해 포유류의 다양한 RNA 바이러스에 대한 선천적 면역에 기여하는 것으로 밝혀진 두 가지 항바이러스 시스템이 발견되었습니다(12-17). 이러한 항바이러스 시스템 중 첫 번째는 LA에 의해 인코딩된 것과 같은 폴리(A) 꼬리가 없는 전사체의 번역에 반대하는 보존된 리보솜 관련 복합체의 하위 단위를 인코딩하는 SKI2, 3 및 8 유전자를 포함합니다(18-23). LA 감쇠의 별도 경로는 캡이 없는 mRNA를 분해하는 5'-3' 엑소리보뉴클레아제인 Xrn1(SKI1이라고도 함)을 통해 발생합니다(24-26).

우리는 최근 미토콘드리아 DNA/RNA 엔도뉴클레아제 Nuc1이 포자 형성 세포에서 LA의 축적을 억제한다는 사실을 발견했는데, 이는 새로운 효모 항바이러스 경로를 나타냅니다(27). Nuc1은 모든 진핵생물과 많은 원핵생물에서 발견되는 엔도뉴클레아제 G(EndoG)의 상동체이며 바이러스 방어의 중요한 최후 수단 메커니즘인 포유동물의 프로그램화된 세포 사멸 동안 게놈 단편화를 촉진하는 역할로 가장 잘 알려져 있습니다(28, 29). 흥미롭게도, 프로그램된 세포 사멸은 효모 포자형성에 내재되어 있으며, Nuc1은 생존 포자에 의해 유전되는 LA 바이러스 수준을 약화시키는 역할 외에도 이 과정 동안 죽어가는 감수분열 산물로부터 DNA를 단편화합니다(27, 30, 31).

실험실 계통에 LA가 어디에나 존재함에도 불구하고 이에 따른 건강상의 결과는 없었으므로 LA는 대체로 무해한 공생균으로 간주됩니다. 여기에서 우리는 LA 감염이 실제로 효모에 치명적이며 생존력을 보존하기 위해 바이러스 선천 면역을 통해 적극적으로 약화되어야 함을 보여줍니다. 특히, 병렬 작용하는 NUC1 및 SKI 항바이러스 경로가 결여된 균주에서는 LA 복제 수가 엄청나게 증가하여 고온에서 치사율을 초래합니다.

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우리는 LA의 추가 특성화와 낮은 수준에서 복제를 유지하는 요인이 새로운 항바이러스 시스템을 드러낼 수 있다고 판단했습니다. LA 병인으로 이어지는 조건을 식별함으로써 우리는 생물정보학 및 유전자 스크리닝 접근법을 사용하여 새로운 항바이러스 유전자를 발견할 수 있었습니다. nuc1Δ ski3Δ 조건부 치사율을 억제하는 과발현 유전자에 대한 스크린을 사용하여 우리는 폴리(A) 결합 단백질(PABPC1)의 효모 동족체와 La 도메인 함유 단백질 Larp1에 대한 항바이러스 기능을 식별합니다. 둘 다 바이러스 선천적 감염에 관여합니다. 인간의 면역 (32, 33). 또한, 기능 상실 유전 연구를 통해 12개의 새로운 항바이러스 유전자가 확인되었습니다. 이들 중에는 고도로 보존된 SAGA 전사 보조활성인자 복합체와 REX2 및 MYG1을 포함한 여러 RNA 엑소뉴클레아제가 있는데, 둘 다 뚜렷하지만 특성이 좋지 않은 인간 및 박테리아 상동체를 가지고 있습니다(34-37).

마지막으로, 우리는 세포 생물학적 방법을 사용하여 LA 병인을 특성화하고 높은 바이러스 부하가 단백질 정체 스트레스를 유발한다는 것을 발견했습니다. 고온이 단백질 정체 스트레스를 악화시키는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 이러한 관찰은 치명적인 단백질 정체 스트레스가 LA로 인한 치사율의 원인임을 시사합니다. 이 가설과 일관되게, 우리는 nuc1Δ ski3Δ 돌연변이가 기립 스트레스를 유발하는 것으로 알려진 프롤린 유사체인 아제티딘-2-카르복실산(AZC)에 대해 LA 의존적 민감성을 나타냄을 보여줍니다(38). 또한, 우리는 기립성 스트레스에 대한 반응을 감지하고 지시하는 보존된 전사 인자인 HSF1에 대한 항바이러스 기능을 입증합니다. 흥미롭게도 인간 Hsf1은 메커니즘이 불분명하지만 HIV, SARS-Cov-2 및 뎅기열 바이러스를 비롯한 다양한 바이러스의 복제 및/또는 병원성에서도 중요한 역할을 합니다(39). 이러한 발견은 미생물에서 인간까지 선천적 면역 보존의 새로운 예를 제공하고 나아가 새로운 항바이러스 시스템 발견을 위한 강력한 모델 시스템으로서 가벼운 효모를 강조합니다.

결과

NUC1, SKI 및 XRN1 효모 항바이러스 시스템이 협력하여 LA 발병을 예방합니다.

NUC1에 대한 이전 연구는 감수분열 세포에 초점을 맞추었습니다(27). 영양 성장 효모에서 NUC1 항바이러스 기능을 조사하기 위해 참조 BY4742 균주 배경에서 유사분열 반수체 세포의 LA 사본 수를 조사했습니다. 우리는 전기영동된 RNA의 ethidium bromide 염색을 사용하여 LA dsRNA 수준을 관찰한 결과 nuc1Δ ski3Δ 이중 돌연변이가 LA dsRNA의 큰 증가를 나타냄을 발견했습니다(그림 1A). 우리는 복제 RNA 바이러스를 검출하는 데 사용되는 dsRNA 항체를 사용한 면역형광 현미경을 사용하여 이러한 발견을 확증했습니다(40, 41). 이러한 이미지는 LA dsRNA가 인간 세포에서 관찰된 바이러스 복제의 "바이러스 공장" 부위를 연상시키는 초점에 축적되었음을 보여줍니다(그림 1B 및 SI 부록, 그림 S1)(42). 다른 균주 배경(24, 27, 43)의 이전 연구 결과와 일치하여 Western blotting을 통해 Gag 단백질 수준이 nuc1Δ 및 ski3Δ 돌연변이에서 증가한 것으로 나타났습니다(그림 1C). 또한, 우리는 nuc1Δski3Δ 이중 돌연변이가 대량으로 증가된 Gag 수준을 축적했음을 보여주었습니다(그림 1C). 이러한 데이터는 NUC1과 SKI3가 별도의 항바이러스 경로에 참여하고 두 경로가 모두 손실되면 LA 바이러스 부하가 크게 증가한다는 것을 보여줍니다.

높은 LA 바이러스 부하가 세포 적합도에 영향을 미치는지 확인하기 위해 스팟 테스트 성장 분석을 사용하여 효모 성장을 조사했습니다. 효모가 미토콘드리아 호흡에 의존하는 조건인 포도당 대신 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 세포를 성장시켰을 때 nuc1Δ 및 ski3Δ 단일 돌연변이의 미묘한 성장 결함이 37도에서 관찰되었습니다(그림 1D). 놀랍게도 nuc1Δski3Δ 이중 돌연변이는 30도에서 정상적으로 성장했지만 탄소원에 관계없이 37도에서 조건부 치사율을 나타냈습니다(그림 1D). 예상한 대로, 고온에서의 생존력은 NUC1-발현 플라스미드에 의해 nuc1Δski3Δ 이중 돌연변이체로 회복되었으며, 이는 Gag 수준의 상응하는 감소를 유도했습니다(그림 1C 및 D). nuc1Δski3Δ 이중 돌연변이체의 성장 결함이 LA에 의해 발생했음을 확인하기 위해 LA(LA0)를 치료한 동질유전자 균주를 구축하고 고온에서의 성장을 분석했습니다. 우리는 성장 결함이 완전히 완화되었음을 발견했는데, 이는 조건부 치사율이 무제한 LA 복제의 결과임을 암시합니다(그림 1D). 최적의 성장 조건에서 세포 적합성에 대한 높은 LA 사본 수의 영향을 평가하기 위해 액체 배양에서 증식 속도를 측정했습니다. 이 연구에서는 L-A0 계통에서는 역전된 30도 야생형과 비교하여 nuc1Δ ski3Δ 이중 돌연변이의 성장률이 감소한 것으로 나타났으며, 이는 스트레스를 받지 않은 세포에서도 높은 LA 부하가 체력에 해롭다는 것을 입증합니다(SI 부록, 그림 1). S2).

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NUC1이 알려진 항바이러스 경로와 어떻게 상호작용하는지 더 특성화하기 위해 XRN1과의 관계를 테스트했습니다. 우리는 nuc1Δ xrn1Δ 이중 돌연변이가 단일 돌연변이와 비교하여 크게 높은 수준의 Gag를 축적하고 고온에서 LA 의존적 조건부 치사율을 나타냄을 발견했습니다(SI 부록, 그림 S3 A ​​및 B). 이는 NUC1과 XRN1이 LA를 감쇠시키는 평행 경로. 벌크 mRNA 조절에서 핵심적인 비중복 역할을 반영하면 xrn1Δski3Δ 이중 돌연변이는 LA가 없는 계통에서도 생존할 수 없습니다(44). XRN1이 NUC1 및 SKI3과 독립적인 항바이러스 시스템을 나타내는지 여부를 확인하기 위해 우리는 nuc1Δski3Δ 이중 돌연변이에서 XRN1을 과발현하기 위해 고카피 플라스미드를 사용했습니다. 실제로 우리는 플라스미드 구동 XRN1 과발현을 사용하여 Gag 수준의 실질적인 감소와 nuc1Δ ski3Δ 조건부 치사율의 억제를 관찰했습니다 (그림 1 C 및 D). 우리는 Nuc1, Ski3 및 Xrn1이 LA 복제에 수렴적으로 반대하고 nuc1Δ ski3Δ 또는 nuc1Δ xrn1Δ 돌연변이에서 LA 바이러스 부하가 엄청나게 증가하여 고온에서 치명적인 병인이 발생했다고 결론지었습니다 (그림 1E).

생물정보학 기반의 유전적 화면으로 새로운 항바이러스 인자를 식별합니다.

nuc1Δski3Δ 이중 돌연변이의 LA 의존적 조건부 치사율은 조합 돌연변이 연구를 통해 다른 항바이러스 인자를 확인할 수 있는 가능성을 높였습니다. 새로운 후보 항바이러스 인자를 식별하기 위해 우리는 최소 2개의 고처리량 스크리닝 연구에서 nuc1Δ와 결합될 때 합성 성장 결함을 일으키는 유전자 결실에 대해 선별된 유전적 상호작용 데이터베이스를 검색했습니다(45). 이 데이터 세트에서 예상되는 XRN1 및 SKI 삭제 존재 외에도 16개의 추가 유전자를 발견했습니다. 우리는 유전자 교차를 사용하여 이들 16개 유전자 각각의 결실을 nuc1Δ ski3Δ와 결합한 삼중 돌연변이를 만들었고 심각한 성장 결함을 유발하는 6개를 확인했습니다(표 1). 우리는 이들 유전자 각각에 의해 유발된 합성 성장 표현형이 LA0 균주에서 역전되었음을 확인했으며, 이는 이들이 항바이러스 단백질을 코딩한다는 것을 시사합니다(표 1). 아래에서는 이러한 화면 조회 중 몇 가지에 대한 확인을 새로운 항바이러스 요인으로 설명합니다.

우리 화면에서 확인된 한 유전자인 REX2는 박테리아에서 인간에게 보존된 3'-5' RNA 엑소뉴클레아제를 암호화합니다(35). Rex2와 인간 상동체 REXO2는 둘 다 미토콘드리아에 위치하며 인터페론 자극 항바이러스 단백질 ISG2{40}}(36, 37, 46-48)를 포함하여 원핵 및 진핵 단백질에서 널리 발견되는 EXOIII 도메인을 포함합니다. 우리는 rex2Δ nuc1Δ 이중 돌연변이 균주가 단일 돌연변이에 비해 크게 증가된 수준의 Gag를 축적하고 고온에서의 치사율을 포함하여 LA 의존성 성장 결함을 나타냄을 발견했습니다(그림 2 A 및 B, SI 부록, 그림 2). S2). rex2Δ 단일 돌연변이 균주는 Gag 수준이 약간 증가했지만 이 효과는 미미했습니다(그림 2B). LA 사본 수에 대한 rex2Δ의 결과를 엄격하게 조사하기 위해 RT-qPCR을 사용하여 LA RNA를 정량화했습니다. 이러한 측정은 rex2Δ nuc1Δ 균주가 크게 증가된 수준의 LA를 축적한다는 것을 확인시켜 주었지만 rex2Δ 단일 돌연변이가 증가된 LA RNA를 축적하지 않았다는 것도 밝혀졌습니다(그림 2C). 이러한 발견은 Rex2의 항바이러스 역할이 NUC1 기능이 없는 경우에만 명백하다는 것을 시사합니다. 놀랍게도 nuc1Δ ski3Δ rex2Δ 및 nuc1Δ xrn1Δ rex2Δ 삼중 돌연변이는 모든 성장 조건에서 생존할 수 없었으며 이러한 결함은 L-A0 균주에서 반전되었습니다 (그림 2D). 이러한 발견은 LA 마이코바이러스의 심각한 병원성 잠재력을 입증하고 고도로 보존된 미토콘드리아에 국한된 RNA 엑소뉴클레아제에 대한 새로운 항바이러스 역할을 확인합니다.

그림 1. LA 약독화는 효모를 치명적인 발병으로부터 보호합니다. (A) 표시된 균주로부터 제조된 총 RNA의 에티듐 브로마이드 염색 젤이 표시되며, 4.6kb LA dsRNA 밴드는 화살표로 표시됩니다. (B) 면역형광은 표시된 유전자형의 세포에서 LA dsRNA(주황색)를 시각화하는 데 사용되었습니다. 이들 균주는 배경 염색을 제거하기 위해 약하게 풍부한 L-BC dsRNA 바이러스를 치료했습니다(방법 세부 사항). DNA의 DAPI 염색은 파란색입니다. (스케일 바, 1 μm.) (C) 표시된 균주에서 LA Gag 및 3-포스포글리세레이트 키나제(Pgk1) 단백질 수준의 웨스턴 블롯팅이 표시됩니다. 분자량 마커는 오른쪽에 표시됩니다. (D) 1C의 균주에 대한 스팟 테스트 성장 분석이 표시됩니다. 포도당이나 글리세롤을 함유한 -Leu 배지에 균주를 발견하고 지정된 온도에서 성장시켰습니다. (E) 미토콘드리아 단백질 Nuc1은 세포질 단백질 Xrn1 및 SkiC와 협력하여 LA 단백질 수준을 조절하고 세포 적합성을 보장합니다.

우리 화면에서 확인된 또 다른 유전자는 모든 분류군에서 상동성을 갖는 3'-5' RNA 엑소뉴클레아제인 인간 MelanocYte 증식 유전자 1의 효모 상동체인 MYG1이었습니다(34). myg1Δ와 nuc1Δ를 결합한 돌연변이 균주는 단일 돌연변이에 비해 Gag 단백질과 LA RNA가 크게 증가했으며 고온 및 액체 배양에서 심각한 LA 의존성 성장 결함을 나타냈습니다(그림 2C 및 SI 부록, 그림 S2, S4). A와 C). rex2Δ와 마찬가지로 myg1Δ 단일 돌연변이 균주는 Gag 수준이 거의 증가하지 않았고 LA RNA에는 변화가 없었습니다(그림 2C 및 SI 부록, 그림 S4C). 우리는 nuc1Δ ski3Δ myg1Δ 삼중 돌연변이를 복구할 수 있었습니다. 그러나 이 돌연변이는 30도에서 극도로 느리게 성장하고 더 높은 수준의 Gag를 축적했습니다(SI 부록, 그림 S4 A 및 C). 이러한 성장 결함은 L-A0 균주에서도 역전되었습니다 (SI 부록, 그림 S4A). 따라서 MYG1은 NUC1 및 SKI 복합체와 병행하여 작용하는 새로운 항바이러스 인자를 나타냅니다.

표 1. 생물정보학 접근법을 사용한 새로운 항바이러스 인자 후보 식별

인간 MYG1의 과발현으로 이어지는 돌연변이는 자가면역 질환 백반증과 연관되어 있으며, 이는 MYG1이 인간 선천 면역에서 어떤 역할을 할 수 있음을 시사합니다(49, 50). 우리는 구성적 효모 프로모터의 제어 하에 인간 MYG1을 발현하는 플라스미드를 사용하여 이 가능성을 조사했으며(34), 인간 MYG1이 nuc1Δ myg1Δ 돌연변이의 조건부 성장 결함을 구제했다는 것을 발견했습니다(SI 부록, 그림 S4D). 이러한 발견은 효모 MYG1의 항바이러스 기능이 인간 MYG1에 의해 달성될 수 있음을 보여주며, 이는 인간에서 MYG1에 대한 잠재적인 항바이러스 기능을 시사합니다.

그림 2. LA 발병기전을 이용하여 새로운 항바이러스 인자를 식별합니다. (A) NUC1 및 REX2에 결함이 있는 균주에 대한 스팟 분석이 표시됩니다. 포도당이나 글리세롤을 함유한 SC 배지에 균주를 발견하고 지정된 온도에서 성장시켰습니다. (B) 그림 2A의 LA Gag 및 Pgk1 단백질 수준의 균주에 대한 웨스턴 블랏. 분자량 마커는 오른쪽에 표시됩니다. (C) LA RNA를 qPCR에 의해 정량화하고 내인성 ACT1 RNA로 정규화했습니다. 평균 RNA 수준과 SD가 표시됩니다. n=5. *P < {{10}}.05, **P < 0.01, ***P < 0.001(페어링되지 않은 스튜던트 t 테스트). (D) NUC1을 발현하는 플라스미드를 포함하는 3개의 병렬 항바이러스 경로에 결함이 있는 균주의 스팟 분석이 표시됩니다. 균주는 -URA 배지 또는 0.1% 5-플루오로로틴산(5-FOA)이 보충된 합성 완전(SC) 배지에서 발견됩니다.

우리의 생물정보학 화면을 사용하여 확인된 또 다른 유전자 범주는 유전자 발현이었습니다. CDC73 및 SPT3은 각각 보존된 염색질 관련 복합체 PAF1 및 SAGA의 하위 단위를 인코딩합니다. cdc73Δ와 spt3Δ는 모두 nuc1Δ ski3Δ와 결합했을 때 LA 의존적 치사율을 유발했습니다(표 1). SAGA(SptAda-Gcn5-아세틸트랜스퍼라제)가 밤나무 마름병 곰팡이 Cryphonectria parasitica에서 항바이러스 유전자 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났기 때문에 우리는 이 복합체를 추가로 조사했습니다(51). spt3Δ nuc1Δ 이중 돌연변이 균주는 증가된 Gag 수준을 축적하고 고온에서 LA 의존 치사율을 나타냈습니다(SI 부록, 그림 S4 B 및 C). SAGA는 대규모 단백질 복합체이며 다른 여러 SAGA 하위 단위 코딩 유전자의 결실이 spt3Δ와 동일한 표현형 결과를 나타냄을 확인했습니다(SI 부록, 표 S1 및 S4C). C. parasitica의 발견과 함께 이러한 결과는 SAGA 복합체가 다양한 곰팡이 종에서 항바이러스 유전자 발현을 조절한다는 것을 시사합니다.

높은 복사 억제 스크리닝을 통해 인간에게도 항바이러스 효과가 있는 효모 항바이러스 인자를 식별합니다.

XRN1 과발현은 nuc1Δski3Δ 균주의 성장 결함을 억제했기 때문에 다른 항바이러스 인자의 과발현이 유사한 효과를 생성할 것이라는 가설을 세웠으며 이는 새로운 항바이러스 시스템을 식별하기 위한 스크린으로 사용될 수 있습니다. 우리는 과발현이 nuc1Δski3Δ 균주의 조건부 치사율을 완화시키는 유전자를 검출하기 위해 고카피 플라스미드 억제 스크린을 사용했습니다(방법 세부 정보). 이 화면을 사용하여 우리는 SRO9, SLF1 및 PAB1을 nuc1Δski3Δ의 고카피 억제자로 식별했으며, 이들 모두는 리보솜 관련 RNA 결합 단백질을 코딩합니다(그림 3A)(52, 53). Sro9 및 Slf1은 진핵생물에서 광범위하게 발견되는 파라로그 루푸스-자가항원(La) 도메인 함유 단백질입니다. 특히, 이들의 인간 상동체인 Larp1은 최근 SARS-Cov-2와 가닥 ssRNA 또는 뉴클레오캡시드에 결합된 단백질에 대한 스크린에서 확인되었습니다(32, 54). Larp1은 이러한 연구 중 하나에서 주요 초점이었으며 인간 세포에서 SARS-Cov-2 복제를 약화시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 그 메커니즘은 알려져 있지 않습니다(32). PAB1은 다양한 메커니즘을 통해 인간에서 바이러스 억제의 공통 표적인 고도로 보존된 PolyA 결합 단백질을 암호화합니다(33). 우리는 PAB1 또는 SRO9의 과발현이 nuc1Δ ski3Δ 돌연변이에서 Gag 수준을 현저하게 감소시켜 구조 표현형을 설명한다는 것을 발견했습니다 (그림 3B). 흥미롭게도 SLF1의 과잉 발현이 SRO9와 마찬가지로 nuc1Δ ski3Δ 성장 결함을 구제했지만 Gag 수준의 감소로 이어지지는 않았습니다 (그림 3 A 및 B). 이러한 발견은 PAB1과 SRO9가 LA 복제를 억제하여 세포를 구출하고 SLF1이 증가된 바이러스 복제의 병원성 결과로부터 세포를 보호한다는 것을 시사합니다.

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높은 LA 카피수는 세포독성 단백질 정체 스트레스를 유발합니다.

Sro9 및 Slf1 항바이러스 활동의 다양한 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 우리는 LA 병인의 생리학적 결과가 무엇인지, 그리고 SRO9/SLF1이 이에 어떻게 차별적으로 영향을 미칠 수 있는지 고려했습니다. 우리는 NUC1 또는 SKI-복합체 유전자의 결실이 단백질 증식 억제 스트레스를 감지하고 유전자 발현 반응을 활성화하는 보존된 전사 인자인 Hsf1(55)에 의해 제어되는 GFP 리포터 유전자의 약한 유도를 초래한다는 이전 연구에 주목했습니다(56-58). ). 이 리포터(HSE-GFP)를 이용한 유동 세포 계측법을 사용하여 우리는 이러한 결과를 확인하고 nuc1Δ ski3Δ 이중 돌연변이가 HSE-GFP의 상승적 및 LA 의존적 활성화를 유발한다는 것을 확인했습니다(그림 3C 및 SI 부록, 그림 S5). 우리는 nuc1Δ ski3Δ 돌연변이에서 관찰된 Gag의 대량 생산이 이러한 단백질 정체 스트레스 반응을 설명한다고 가정했습니다. 이를 뒷받침하는 nuc1Δ ski3Δ 이중 돌연변이의 HSE-GFP 활성화는 PAB1 또는 SRO9 과발현에 의해 되돌려졌으며 이는 Gag 축적에 대한 이러한 유전자의 결과를 반영합니다 (그림 3 B 및 C). 특히, SRO9 파라로그 SLF1의 과발현은 HSE-GFP 활성화를 예방하지 못했습니다. 따라서 유사 SRO9 및 SLF1 유전자의 진화적 분기로 인해 SRO9가 바이러스 단백질 축적 및 관련 단백질 정체 스트레스를 억제하고 SLF1이 바이러스 유발 단백질 정체 스트레스의 독성 결과로부터 세포를 보호하는 것처럼 보이는 등 다양한 항바이러스 메커니즘이 발생했습니다.

그림 3. 번역 조절 인자의 과발현은 LA 발병을 완화시킵니다. (A) 고카피 억제자 SRO9, SLF1 및 PAB1의 스팟 테스트 성장 분석이 표시됩니다. 균주는 포도당이나 글리세롤을 함유한 -LEU 배지에 발견되었고 표시된 온도에서 성장했습니다. (B) 3A 균주의 LA Gag, Pgk1, Sro9 및 Slf1 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯팅. 분자량 마커는 오른쪽에 표시됩니다. (C) 표시된 균주(n{{1{11}}}})에서 HSE GFP 발현을 측정하기 위해 유세포 분석을 사용했습니다. 첫 번째 및 세 번째 사분위수는 회색 상자로 표시됩니다. 중앙값 GFP 강도는 내부의 검은색 막대로 표시됩니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001(페어링되지 않은 스튜던트 t 테스트). (D) 표시된 균주에서 Hsp104-GFP의 형광 현미경 검사. 핵을 시각화하기 위해 세포를 DAPI로 염색했습니다. (스케일 바, 1 μm.) 3+ GFP 초점이 있는 세포의 백분율이 오른쪽에 표시됩니다. n=3. 각 반복에 대해 75~140개의 세포가 계산되었습니다.

단백질 정체 스트레스는 종종 단백질 응집체와 함께 위치하는 것으로 알려진 Hsf1 전사 활성화의 직접 표적인 단백질 분리효소 Hsp104에 융합된 GFP를 사용하여 시각화할 수 있는 세포독성 단백질 응집체의 축적과 관련이 있습니다(59, 60). LA 병인과 관련된 단백질 생성 억제 결함을 더 자세히 조사하기 위해 형광 현미경을 사용하여 다양한 균주의 Hsp104-GFP 초점을 시각화했습니다. 예상한 대로, 30도에서 성장한 야생형 세포는 관찰 가능한 Hsp104-GFP 초점을 거의 축적하지 않았습니다. nuc1Δ 및 ski3Δ 단일 돌연변이는 야생형과 유사했지만, 놀랍게도 nuc1Δ ski3Δ 이중 돌연변이는 3개 이상의 Hsp104-GFP 초점을 갖는 세포의 25% 이상을 나타냈습니다(그림 3D). nuc1Δ ski3Δ에 대해 관찰한 다른 모든 표현형과 마찬가지로 Hsp104-GFP 초점의 축적은 LA의 존재에 따라 달라졌습니다(그림 3D). 이러한 발견은 NUC1 및 SKI3의 결실로 인한 높은 바이러스 부하가 세포독성 단백질 응집을 나타내는 Hsp{24}}GFP 초점의 축적을 초래한다는 것을 보여줍니다.

LA 병인은 단백질 증식 억제 결함과 상관관계가 있기 때문에 우리는 Hsf1이 항바이러스 인자로 기능할 것이라는 가설을 세웠습니다. HSF1의 결실은 치명적이므로 이전에 발표된 균주 모음에서 가져온 온도 민감성 대립유전자 hsf1-848를 활용했습니다(61). hsf1-848 대립유전자는 39도에서 성장이 없었고, 37도에서 중간 성장 표현형을 보였으며, 35도에서는 뚜렷한 성장 결함이 없었습니다(그림 4A). 스팟 테스트 분석에서는 nuc1Δ 또는 ski3Δ와 결합할 때 35도 및 37도에서 hsf1-848 성장 표현형이 크게 향상되었으며 LA 바이러스가 없는 균주에서는 이러한 성장 결함이 역전되었음을 보여주었습니다(그림 4A). . 예상한 대로, 모든 hsf1-848 돌연변이 균주의 생존성은 LA의 존재와 관계없이 39도에서 성장한 세포에서 지속되었습니다. 또한, 사분면 해부를 사용하여 우리는 hsf1-848 nuc1Δ ski3Δ 삼중 돌연변이가 LA에 감염된 경우 허용 온도에서 생존할 수 없지만 LA0 계통에서 파생된 경우 건강한 것으로 나타났습니다(SI 부록, 그림 S6). Western blotting을 사용하여 hsf1-848 nuc1Δ 및 hsf1-848 ski3Δ가 단일 돌연변이에 비해 LA Gag의 축적량이 증가한 것을 확인했습니다(그림 4B). 우리의 세포 생물학 연구와 함께, 이러한 발견은 Hsf{34}}조절 단백질 정체 스트레스 반응이 효모의 항바이러스 시스템으로 기능하여 만연한 LA 복제의 병원성 결과에 반대한다는 것을 시사합니다.

단백질 생성 억제 결함은 고온에서 악화되고 세포 독성을 유발하는 것으로 알려져 있으므로(59), 간단한 모델은 고온에서 LA 병인의 치명적인 결과를 치명적인 단백질 생성 억제 스트레스로 간주합니다. 이 모델을 추가로 테스트하기 위해 우리는 기립성 스트레스를 유발하는 단백질에 통합되는 프롤린 유사체인 아제티딘-2-카르복실산(AZC)으로 균주를 처리했습니다(38). 이 실험에서는 nuc1Δski3Δ가 LA 바이러스에 의존하는 방식으로 AZC에 대해 강한 민감성을 나타냄을 보여주었습니다(그림 4C 및 SI 부록, 그림 S6). 또한, 우리는 nuc1Δ ski3Δ가 단백질 정체 결함을 유발하는 조건인 5% 에탄올에 대한 민감도를 나타내었지만 삼투압 스트레스를 유발하는 0.5 M NaCl에는 민감하지 않음을 발견했습니다(SI 부록, 그림 S6). 이러한 발견은 LA 병인의 치명적인 결과가 특히 압도적인 단백질 합성 스트레스에 기인함을 시사합니다.

그림 4. 열충격 반응은 LA 발병을 억제합니다. (A) LA 유무에 관계없이 HSF1, NUC1 및 SKI3에 결함이 있는 균주에 대한 스팟 분석이 표시됩니다. 균주를 포도당을 함유한 SC 배지에 스폿팅하고 지정된 온도에서 성장시켰습니다. (B) 표시된 균주의 LA Gag 및 Pgk1 단백질 수준에 대한 웨스턴 블랏. 분자량 마커는 오른쪽에 표시됩니다. (C) 단백질 독성 프롤린 유사체인 아제티딘-2-카르복실산(AZC)으로 처리된 균주의 스팟 분석이 표시됩니다. 0.1mg/mL의 AZC가 첨가되거나 첨가되지 않은 포도당을 함유한 SC 배지에서 균주를 발견하고 30도에서 성장시켰습니다.

논의

실험실 균주에 편재되어 있음에도 불구하고 LA dsRNA 바이러스에 대한 연구는 명백히 양성인 특성으로 인해 제한적이었습니다. 여기에서 우리는 복제가 통제되지 않을 때 LA가 효모에 심각한 영향을 미치고 다양한 선천적 면역 시스템이 LA 복제를 허용 가능한 수준으로 유지한다는 것을 보여줍니다. 특히, 우리는 병렬 작용 NUC1 및 SKI3 항바이러스 유전자가 결여된 균주에서 LA 복제가 대규모로 상향 조절되어 고온에서 기립성 스트레스와 조건부 치사율을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 새로운 발견을 활용하여 우리는 생물정보학 및 전진 유전 스크린을 사용하여 LA 복제를 제한하거나 제한되지 않은 LA 복제의 병원성 결과로부터 세포를 보호하는 기능을 하는 새로운 효모 유전자를 식별했습니다. 이러한 스크린이 포화되지 않았기 때문에 효모 게놈은 수많은 다른 항바이러스 인자를 암호화할 가능성이 높습니다. 다른 유기체로부터 외인성으로 도입된 바이러스 RNA의 복제를 연구하는 효모에 대한 많은 통찰력 있는 연구가 수행되었으며 LA 항바이러스 인자가 이러한 바이러스 RNA에 유사하게 작용하는지 확인하는 것은 흥미로울 것입니다(62, 63).

LA 감염의 명백한 위험을 감안할 때, 항상 존재하는 항바이러스 활동에도 불구하고 이것이 어떻게 지속되는지는 수수께끼입니다. 이 역설에 대한 설명은 LA가 균형을 맞추는 이점을 제공한다는 것일 수 있습니다. LA의 한 가지 가능한 이점은 일부 균주가 감염되지 않은 이웃 세포를 죽이는 분비 독소를 암호화하는 위성 바이러스를 유지할 수 있다는 것입니다. 그러나 LA는 "킬러" 위성이 없는 많은 계통에 존재하므로 이 설명은 LA 감염의 지속성을 설명하기에는 불충분합니다. 따라서 우리는 LA가 해로운 잠재력을 상쇄하는 비밀스러운 이점을 가질 수 있다고 추측합니다.

바이러스 감쇠 인자로서 Rex2에 대한 우리의 발견은 Nuc1을 넘어 알려진 미토콘드리아 항바이러스 인자의 무기고를 확장하고 미토콘드리아가 효모의 주요 항바이러스 허브임을 시사합니다. 실제로 미토콘드리아는 프로그래밍된 세포사멸 조절자이자 인간의 항바이러스 신호 전달을 위한 플랫폼으로서 바이러스 방어에서 중심 역할을 합니다. 미토콘드리아 뉴클레아제는 어떻게 효모의 세포질에 존재하는 바이러스를 약화시킵니까? 한 가지 가능성은 이러한 효소가 미토콘드리아를 표적으로 하지만 그럼에도 불구하고 LA 감쇠를 직접 달성하기 위해 세포질에 낮지만 충분한 수준으로 축적될 수 있다는 것입니다. 이 가설과 일관되게, 우리는 이전에 Nuc1이 감수 분열 세포의 세포질에 축적된다는 것을 보여 주었지만 우리의 방법은 유사 분열 세포의 세포질에서 이를 감지할 수 없었습니다(27). 또 다른 가설은 LA 복제 주기의 일부 측면이 미토콘드리아와 밀접하게 연관되어 발생한다는 것입니다. 예를 들어, LA 성적표는 미토콘드리아와 연결되거나 이를 통과하여 Nuc1 및/또는 Rex2에 노출될 수 있습니다. 우리의 결과는 진핵생물의 바이러스 선천 면역에 대한 미토콘드리아의 잠재적인 일반적인 중요성을 강조하고 효모-LA 시스템을 이 주제에 대한 추가 연구를 위한 강력한 모델로 자리매김합니다.

리보솜 번역과 관련된 항바이러스 SKI 복합체와 LA 병인의 높은 복제 억제자인 Pab1, Sro9 및 Slf1의 식별은 번역 리보솜이 효모 항바이러스 활동의 핵심 허브임을 더욱 드러냅니다. PAB1(폴리A 결합 단백질)이 LA를 억제한다는 발견은 LA 전사체에 폴리A 꼬리가 없다는 점을 고려하면 놀라운 일이며, 이는 Pab1이 LA에 직접적으로 작용하지 않는다는 것을 시사합니다. 이전 연구 결과에 따르면 LA 전사체는 번역하는 80S 복합체를 형성하기 위해 60S 리보솜 하위 단위를 포착하기 위해 폴리A+ 효모 mRNA와 경쟁하는 것으로 나타났습니다(64). 우리 연구 결과를 설명하는 한 가지 모델은 Pab1이 폴리A 꼬리가 포함된 mRNA의 번역을 향상시켜 번역을 위한 LA 전사체에 대한 60S 하위 단위의 가용성을 고갈시킨다는 것입니다. 번역에서 Sro9와 Slf1의 역할은 잘 이해되지 않았지만 그 기능은 60S 하위 단위에 대한 LA 성적표의 경쟁과 유사하게 관련될 수 있습니다. 중요한 것은 Pab1과 Sro9/Slf1의 상동체가 인간 바이러스 방어에 관여하며 효모에서 이들 유전자에 대한 추가 연구를 통해 효모에서 인간까지 보존된 항바이러스 메커니즘이 밝혀질 것입니다.

시스탄체 식물의 면역 체계 증가

우리는 세포독성 단백질 응집체의 HSF1-활성화 마커인 Hsp104-GFP foci의 축적과 관련된 LA 유발 단백질 정체 스트레스 반응과 함께 보존된 전사 인자 HSF1에 대한 항바이러스 역할을 확인했습니다. 이러한 결과는 LA 발병이 단백질 독성 스트레스에 의해 유발된다는 모델을 뒷받침합니다. 우리는 또한 열충격 이후 Hsf1 표적 유전자 유도의 보조활성화 인자로 작용하는 것으로 밝혀진 SAGA 복합체에 대한 항바이러스 기능을 발견했습니다(65, 66). 이러한 관찰은 높은 수준의 LA가 항바이러스 기능을 수행하는 Hsf1 표적 유전자의 SAGA 의존적 활성화로 이어져 신진 효모에서 잠재적인 항바이러스 유전자 발현 프로그램을 조명한다는 것을 시사합니다. 이 모델은 다른 유기체의 바이러스 발병과 관련될 수 있는 많은 테스트 가능한 예측을 제공합니다. 실제로 인간 HSF1은 단백질 분해 조절 인자의 발현도 조절합니다. 인간 HSF1의 항바이러스 기능이 설명되었지만 기립성 스트레스 반응이 어떤 역할을 하는지는 불분명합니다(39). 우리의 발견은 단백질 증식 억제 스트레스 반응의 활성화에 있어서의 역할과 관련하여 Hsf1의 항바이러스 기능을 식별하는 강력한 시스템을 조명합니다.

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