행동 및 신경퇴행성 질환의 장내 미생물 연구를 위한 초파리 모델 1부
Aug 16, 2023
추상적인:
점점 더 많은 증거에 따르면 장내 미생물군이 포유류의 여러 생리학적 과정 및 질병 발달과 연관되어 있음이 나타납니다. 그러나 포유류 장내 미생물군집의 복잡성으로 인해 기본 메커니즘은 대부분 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 초파리인 Drosophila melanogaster는 번역 측면에서 숙주-장내 미생물 상호 작용을 연구하기 위한 귀중한 동물 모델입니다.
동물과 기억은 매우 흥미로운 관계입니다. 개의 충성심부터 생쥐의 지능에 이르기까지 동물에 대한 기억은 오랫동안 경이로움과 호기심의 대상이었습니다. 동물의 기억 능력은 다양하지만, 그들의 기억은 동물이 자기 보존에 대한 강한 본능을 가지고 있을 뿐만 아니라 경험을 통해 배울 수도 있다는 결론에 신빙성을 부여하며, 이는 기억이 중요하다는 것을 시사합니다.
우선, 개와 고양이는 사람이 키우기에 가장 적합한 두 가지 애완동물입니다. 그들은 모두 매우 똑똑하고 좋은 기억력을 가지고 있습니다. 주인과 환경의 냄새와 소리를 기억할 수 있고 특정 행동을 통해 감정을 표현할 수도 있습니다. 이 기억의 힘은 잃어버린 주인을 찾는 개와 고양이의 능력에 반영됩니다. 주인이 떠난 지 오랜 시간이 지났더라도 식별할 수 있는 장소와 냄새가 있는 한 계속해서 찾아다닌다.
둘째, 쥐도 특히 높은 IQ를 가진 동물 중 하나입니다. 쥐의 기억력은 상상보다 훨씬 뛰어납니다. 그들은 어디로 가는지, 음식이 어디에 있는지, 영토를 기억할 수 있으며, 자신에게 위험이 되었던 사람이나 동물도 인식하고 기억할 수 있습니다. 일부 연구자들의 실험에 따르면 생쥐도 음악과 음색을 통해 환경을 인식하고 반응하는 것으로 나타났습니다. 이는 동물의 기억에 감각적, 정서적, 논리적 지능이 포함되어 있음을 보여줍니다.
일반적으로 동물에 대한 기억은 사람들에게 많은 놀라움과 발견을 가져왔습니다. 그들은 자신을 보호할 수 있을 뿐만 아니라 인간과 더욱 긴밀한 신뢰와 관계를 구축할 수 있습니다. 또한 동물은 과학자들이 기억의 본질과 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 되는 다양한 실험과 연구에 영감을 주었습니다. 그럼, 동물의 지능과 기억력에 감탄하고, 그들의 영리하고 유연한 두뇌에 감탄해 봅시다. 인간이건 동물이건 기억은 매우 중요하다는 것을 알 수 있다. 시스탄체는 우리의 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 왜냐하면 시스탄체는 많은 독특한 효과를 지닌 중국의 전통 약재이기 때문입니다. 그 중 하나는 기억력을 향상시키는 것입니다. 다진 고기의 효능은 카르복실산, 다당류, 플라보노이드 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 다양한 경로를 통해 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.
초파리의 강력한 유전적 도구와 자원의 가용성을 통해 과학자들은 장내 미생물이 숙주의 체력, 건강 및 행동에 영향을 미치는 메커니즘을 밝힐 수 있었습니다.
초파리 모델은 과거 동물 행동(예: 구애, 공격성, 수면, 학습 및 기억)뿐만 아니라 일부 인간 관련 신경퇴행성 질환(예: 알츠하이머병 및 파킨슨병)을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 이 리뷰는 초파리의 장내 미생물에 대한 현재의 이해와 이것이 파리 행동, 생리학 및 신경변성 질환에 미치는 영향을 포괄적으로 요약합니다.
키워드:
초파리(Drosophila melanogaster); 미생물군; 장-뇌 축; 행동; 학습과 기억; 신경퇴행성 질환.
1. 소개
초파리(Drosophila melanogaster)는 생물의학 연구에 사용되는 중요한 실험 동물입니다. 초파리는 1901년 캐슬(Castle)과 1909년 모건(Morgan)에 의해 유전학 연구를 위해 처음으로 실험 유기체로 사용되었습니다. 초파리가 한 세기 넘게 모델 유기체로 사용된 이후, 특정 과학적 문제를 해결하기 위해 여러 가지 기술이 개발되었습니다.
초파리는 상대적으로 수명이 짧고 행동이 복잡합니다. 특정 조직이나 기관의 유전자 조작을 위한 강력한 도구의 가용성을 통해 과학자들은 선천적(구애, 공격성, 수면 등)뿐만 아니라 주변 환경에 대한 적응 반응과 같은 초파리의 행동을 조절하는 분자 메커니즘을 연구할 수 있었습니다. [1 –3] 및 학습된 행동(후각 기억 및 구애 기억)[4–6].
지난 20년 동안 초파리는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)과 같은 신경퇴행성 질환을 연구하기 위한 이상적인 생체 내 모델로 사용되어 왔습니다[7,8]. 인간의 신경 성장과 기능을 조절하는 주요 신호 전달 경로는 초파리에 보존되어 있어 인간의 신경퇴행성 질환을 연구하기 위해 이 모델 유기체를 사용할 수 있습니다.
예를 들어, 초파리 뇌에서 인간 A42 단백질을 이소적으로 발현하여 개발된 AD의 Drosophila 모델은 연령 의존적 단기 기억 장애, 학습 결함, 각성 증가 및 수면 장애와 같은 AD 환자와 관련된 임상 증상을 나타냅니다. ,9]. 이는 Drosophila가 AD 치료를 위한 새로운 약물을 스크리닝하기 위한 이상적인 생체 내 모델로 사용될 수 있음을 시사합니다.
점점 더 많은 증거가 균형 잡힌 장내 미생물군이 인간 건강에 필수적이라는 개념을 뒷받침합니다[10,11]. 장내 미생물총의 구성을 방해하면 숙주의 건강과 생리에 부정적인 영향을 미쳐 행동 이상, 신경퇴행성 질환, 신경정신 질환 등 다양한 신경 질환을 유발할 수 있습니다[12-14].
연구에 따르면 장내 세균은 도파민, 감마-아미노부티르산(GABA) 및 세로토닌을 포함한 여러 신경 전달 물질을 생성할 수 있는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 장과 중추신경계(CNS) 사이의 양방향 누화는 장내 미생물군을 통해 매개됩니다[16,17]. 최근 연구에 따르면 장내 미생물 구성의 변화가 특정 신경 질환과 관련이 있는 것으로 나타났습니다[18-20].
그러나 장내 세균이 장-뇌 축을 따라 의사소통에 영향을 주어 질병 진행을 조절하는 방법에 대한 자세한 메커니즘은 추가 조사가 필요합니다.
지난 20년 동안 대부분의 장내 미생물군 연구에서는 미생물군-장-뇌 축의 역할을 조사하기 위해 설치류 모델을 사용했습니다. 그러나 다재다능한 유기체인 초파리(Drosophila)는 과학자들이 장내 미생물이 뇌 기능에 영향을 미치는 메커니즘을 조사할 수 있는 강력한 연구 모델입니다(그림 1a,b). 미생물은 유전적으로 형광 단백질로 태그가 지정될 수 있으므로 초파리의 소화관 내 분포를 시각화할 수 있습니다(그림 1c) [21,22].
그림 1. 인간과 초파리의 소화관 비교. (a) 인간과 초파리의 소화관. 초파리와 인간의 소화관 기능 영역은 유사하며 식도, 전후 중장(소장), 대장(후장) 및 위(작물)를 포함합니다. (b) 전장, 중장 및 후장을 묘사하는 초파리 소화관의 하위 영역.
Foregut에는 작물과 프로벤트리큘러스가 포함되어 있습니다. 중장은 R1-R5 영역으로 더 나뉩니다. (c) GFP 태그가 붙은 락토바실러스는 성체 초파리에게 공급되었으며 공초점 이미지는 소화관의 여러 영역에서 락토바실러스(녹색)의 분포를 보여줍니다. 자르기, R2, R4 및 R5 영역의 확대 이미지는 c1 ~ c4에 표시됩니다. 샘플은 항인테그린-PS 항체(빨간색)로 면역염색되었습니다. 스케일 바, 500μm.
2. 초파리의 타고난 행동
타고난 행동은 동물의 뇌에 내장되어 있고 유전적으로 암호화되어 있으며 적절한 실행을 위해 사전 경험이 필요하지 않습니다. 타고난 행동은 동물의 내부 상태와 외부 환경에 대한 적응력이 뛰어나 동물이 다양한 환경 조건에 따라 행동을 수정할 수 있습니다 [23].
초파리는 파리와 인간 사이의 행동 표현형에 몇 가지 유사점이 있기 때문에 인간 타고난 행동의 분자 메커니즘을 연구하기 위한 훌륭한 동물 모델입니다. 초파리에서는 짝짓기 행동, 공격적 행동, 수면/운동 활동, 온도 관련 행동과 같은 다양한 선천적 행동이 연구되었습니다[3,24-28].
또한, 초파리 게놈은 인간의 게놈과 약 60% 상동성을 갖고 있으며, 인간 질병 관련 유전자의 약 75%도 파리에서도 상동성을 갖고 있습니다[29]. 예를 들어, 수면 행동에서 도파민 신호는 초파리뿐만 아니라 인간에서도 각성을 조절합니다 [30]. 여기에서는 몇 가지 중요한 Drosophila 선천적 행동을 소개하고 장내 미생물과의 관계에 대해 논의합니다(표 1).
2.1. 장내 미생물총과 짝짓기 행동
수컷 초파리의 짝짓기 행동에는 암컷을 향한 진행(방향), 암컷을 쫓는 것(따라가기), 암컷의 복부를 만지는 것(두드림), 일방적인 날개 확장 및 진동(노래), 암컷의 생식기를 핥는 것, 붙잡는 것 등 일련의 단계가 포함됩니다. 암컷의 등에 (교미 시도) 및 최종 교미 [3,26]. 수컷 파리 한 마리가 처녀 암컷 한 마리와 짝짓기를 시도하며 암컷에 대한 수컷 파리의 성적 열정을 측정한 것을 구애 지수(CI)라고 합니다.
CI는 수컷 초파리가 구애하는 데 보낸 시간을 총 실험 시간으로 나눈 값입니다. 짝짓기 행동을 조절하는 잘 알려진 신경 회로는 무익(fru) 발현 뉴런으로 구성됩니다. 구애를 유발하는 P1 클러스터 뉴런과 같은 1차 감각 구심성 및 중추 개재뉴런을 포함하는 fru 발현 뉴런은 남성 구애 회로의 핵심 부분을 형성할 수 있습니다[50].
적어도 3개의 연구에서 장내 미생물군이 초파리의 구애 행동에 영향을 미치지 않는다고 보고했습니다[33,35,51]. 그러나 각 연구에서는 서로 다른 야생형 파리를 사용했으며 무균 파리를 생성하기 위해 서로 다른 방법을 사용했다는 점에 유의해야 합니다.
이러한 연구와는 달리 Heys et al. 장내 미생물군은 암컷의 성적 신호를 변경하여 수컷의 이종 교배 전략에 대응하여 수컷 파리로부터의 정자 전달을 감소시키는 것으로 나타났습니다[31]. 초파리의 근친 교배는 자손의 유전적 다양성을 증가시키고, 면역 방어를 강화하며, 숙주 미생물군에 의해 영향을 받을 수 있습니다[31,52].
이전 연구에서는 짝짓기 후 1-일과 3-일에 파리 머리 조직의 유전자 발현 패턴이 변경되어 섭식 행동, 신진 대사 및 알 생산을 포함한 파리 행동에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. -교배 행동) [53]. Delbareet al. 는 처녀 파리와 짝짓기한 무균/재래식 초파리에 대한 대규모 RNA-seq 분석을 수행했으며 짝짓기한 암컷에서 생식 및 신경 기능 조절에 관여하는 전사체가 암컷의 미생물군에 따라 차별적으로 풍부하다고 보고했습니다[32].
더욱이 수컷의 미생물군 상태는 일반 암컷과 무균 암컷 모두의 번식력에 영향을 미쳤습니다. 그러나 이는 무축성 암컷에서만 전사 프로파일에 영향을 미쳤지만 전통적인 암컷에서는 영향을 미치지 않았습니다.
2.2. 장내 미생물총과 공격적인 행동
동물계에서 널리 관찰되는 공격적인 행동은 생존과 번식에 매우 중요합니다 [54]. 초파리의 공격적인 행동에는 날개 위협, 복싱, 앞다리 두드리기, 돌진, 머리 맞대기 등이 포함됩니다[2,33]. Jiaet al. 파리의 공격적인 행동을 분석하는 프로토콜을 설명했습니다.
이 분석에서는 두 마리의 수컷 또는 암컷 파리(5~7일령)를 전투 챔버에 넣은 다음 20mm × 20mm 유리 커버슬립으로 빠르게 덮습니다. 30분간의 싸움은 카메라를 이용해 녹화된다. 공격적인 행동은 남성의 돌진 횟수와 여성의 머리 맞대기 횟수를 계산하고 돌진 빈도/싸움 대기 시간을 평가하여 분석됩니다. 폐 빈도는 폐 시작 후 분당 폐의 횟수로 정의되는 반면, 전투 대기 시간은 기록 시작부터 첫 번째 폐 사이의 지속 시간으로 정의됩니다[33].
연구에 따르면 공격적인 행동은 시각, 후각, 미각, 기계 감각 및 청각 입력과 조화를 이룹니다. 이러한 입력은 뇌 버섯체(MB), 측면 뿔 및 중앙 복합 영역에 통합되고 최종적으로 날개와 다리 근육을 통해 모터 출력을 구동합니다.
연구에 따르면 옥토파민, 세로토닌, 도파민, 아세틸콜린, 신경펩티드 F(NPF)와 같은 신경전달물질과 신경펩티드도 공격적인 행동에 중요한 역할을 한다고 합니다[54].
최근 연구에 따르면 특정 장내 미생물군이 파리의 공격성과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. Jiaet al. 차아염소산나트륨과 일련의 세척 프로토콜을 사용하여 무균 파리를 생성했습니다[33].
기존의 파리(Canton-S)에 비해 무균 파리는 수컷간 공격성이 덜한 것으로 나타났는데, 이는 무균 파리가 수컷간 공격성을 감소시켰음을 나타냅니다. 또한 Acetobacter, Lactobacilli 및 Enterococci와 같은 공생 박테리아는 미생물 재집락화를 통해 무균 파리의 공격적인 행동을 촉진했습니다. 저자들은 또한 무균 파리에서 옥토파민 수준이 73% 감소했으며 옥토파민성 신경 활동의 유전적 조작이 무균 파리의 공격적인 행동을 회복했다고 보고했습니다.
같은 연구에서는 옥토파민 발현을 통한 공격성 조절과 관련된 두 가지 핵심 요소도 보고했습니다. 하나는 유충 단계(산란 후 48~98시간)의 중요한 발달 기간으로, 효모가 풍부한 식단을 보충하면 무균 파리의 공격적인 행동이 회복되었습니다. 또 다른 요인은 영양이었습니다. 이는 옥토파민 발현에도 중요하기 때문이며, 무성 파리에 적절한 영양을 제공하면 공격적인 행동이 정상화되었습니다.
이러한 발견은 중요한 발달 기간 동안 장내 미생물군과 영양이 성인 남성의 공격성을 조절하는 옥토파민 발현에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다[33].
2.3. 장내 미생물총과 수면 및 운동 활동
DAM(Drosophila Activity Monitor) 시스템은 파리의 수면 및 운동 행동을 연구하는 데 사용됩니다[55]. 이 분석에서, 파리는 12시간 명/12시간 암주기 조건 하에서 수용됩니다[56,57].
DAM 장치는 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. (1) 파리 한 마리가 자유롭게 이동할 수 있는 유리관, (2) 유리관의 중간점을 통과하는 적외선 빔, (3) 행동을 기록하는 컴퓨터 결과 [55]. 수면/운동 행동 분석에서 DAM 시스템은 유리관 내를 걷는 파리로 인한 적외선 빔 차단을 기록하여 수면 또는 운동을 감지합니다[58].
초파리 뇌의 잘 알려진 수면 행동 관련 회로는 일주기 뉴런으로 구성됩니다. 빛은 작은 복부측면 뉴런(s-vLN) 그룹을 자극하기 위해 색소분산인자(PDF)를 방출하는 큰 복부측면 뉴런(l-vLN) 그룹을 자극합니다. 마지막으로, s-vLN은 뇌 운동 제어 센터인 타원체를 조절하여 수면 행동을 억제합니다.
l-vLN과 s-vLN 모두 GABAA 수용체를 발현하는데, 이는 수면 촉진 GABA성 뉴런을 통해 각성을 억제할 수 있습니다. MB는 또한 수면 관련 cAMP 경로에 의해 활성화되는 효소인 단백질 키나제 A의 촉매 하위 단위를 통해 수면을 조절하는 중요한 뇌 영역입니다[59]. 운동 활동은 초파리의 생존에 중요하며 호르몬에 의해 제어되며 DAM 시스템을 사용하여 분석할 수도 있습니다. Kinget al.
최근 24시간 주기 시계를 운동 활동과 연결하는 펩티드 회로의 존재를 보고했습니다. s-vLN은 DN1 시계 뉴런을 자극하는 PDF를 방출하고, 이는 차례로 DH44 양성 PI(대뇌간 뇌간) 뉴런을 자극합니다. DH44-양성 PI 뉴런은 휴긴 양성 SEZ 뉴런을 자극하여 최종적으로 휴긴 신경펩타이드를 초파리의 운동 활동을 조절하는 복부 신경 코드의 운동 회로로 방출합니다[60].
Drosophila의 수면 행동에 대한 장내 미생물의 영향은 아직 불분명합니다. Selkriget al. 동종 Wolbachia가 없는 D. melanogaster Canton-S 균주를 야생형 파리로 사용하고 수면 및 운동 행동 분석을 수행했습니다. 저자들은 알을 NaClO로 세척하여 Wolbachia가 없는 Canton-S 무균 초파리를 생성하고 1세대를 F1으로, 다음 세대를 F2로 명명했습니다.
그들의 데이터에 따르면 무균 F1 파리나 무균 F2 파리 모두 수면 행동에 큰 변화를 보이지 않는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 무균 F1 파리는 운동 행동에 어떤 변화도 보이지 않았음에도 불구하고, 무균 F2 파리는 기존 파리에 비해 운동 활동이 약간 증가한 것으로 나타났습니다[35].
Silva 등의 또 다른 연구. Canton-S와 W1118을 야생형 파리로 사용하고 NaClO를 사용하여 파리 알을 3~5분 동안 세척하여 무균 파리를 생성했습니다[61]. 그들의 결과는 기존의 파리에 비해 무축파리가 더 오랫동안 잠을 자는 경향이 있었고 수면 부족 후 수면 반동이 감소한 것으로 나타났습니다[34]. 그러나 파리의 장내 미생물 상태는 운동 활동의 일주기 리듬에 작은 영향을 미쳤습니다.
Silvaet al. 및 Selkrig et al. 초파리의 수면과 운동을 조절하는 장내 미생물총의 역할을 이해하는 데 중점을 두었습니다. Schretteret al. 장내 미생물과 운동/수면 사이의 관계를 설명할 수 있는 메커니즘을 제안했습니다. 본 연구에서는 Oregon-R 균주를 야생형으로 사용하였고, 초파리는 항생제 처리(ABX) 초파리를 생성하기 위해 항생제 보충 식이를 받았습니다.
결과에 따르면 ABX 파리는 보행 속도를 높이고 일상 활동을 향상시키며 낮 시간 동안 수면을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 저자들은 또한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)에 존재하는 특정 당의 가역적 이성질체화를 촉매하는 효소 자일로스 이성질화효소가 옥토파민성 뉴런의 자극을 통해 당 대사를 조절함으로써 운동 활동을 감소시킨다고 보고했습니다. 그러나 이 효소는 수면에 영향을 미치지 않습니다 [36].
2.4. 장내 미생물총과 온도 관련 행동
환경 온도는 초파리와 같은 외온동물의 생리에 큰 영향을 미칩니다. 온도 선호 행동(파리는 뜨겁거나 차가운 환경을 피함)과 뜨겁거나 차가운 온도에 대한 내성은 초파리의 생존에 중요합니다. 온도 구배 분석은 파리의 온도 선호도를 연구하는 데 사용됩니다.
여러 연구에서 서로 다른 온도 구배 장치를 사용했지만 기본 원리는 동일합니다. 장치의 한쪽은 낮은 온도이고 다른 쪽은 높은 온도를 생성합니다. 양면 사이에 알루미늄 시트를 놓으면 온도 구배가 생성됩니다. 파리를 알루미늄 시트 위에 놓고 원하는 온도를 선택할 수 있습니다[62,63].
온도 회피 행동을 연구하는 방법에는 두 가지가 있습니다. 하나는 온도 구배 분석(위에 설명됨)을 사용하는 것이고, 다른 하나는 2선택 분석 기계를 사용하는 것입니다.
2선택 분석 기계에는 열전 냉각 칩과 알루미늄 시트로 제작된 4개의 사분면이 포함되어 있습니다. 온도 회피 분석을 수행할 때 2선택 분석 기계는 한 세트의 대각선 사분면에서 일정한 온도(25°C)를 설정하고 다른 대각선 사분면은 분석에 따라 실험 온도로 설정했습니다[64] .
냉각 혼수상태 회복은 온도 내성 행동을 연구하기 위한 프로토콜입니다. 이 분석에서 파리는 저온 스트레스에 대해 -3.5oC(실험 설계에 따라 다름)로 설정된 물-글리콜 욕조에 담그거나 열 스트레스에 대해 38.5oC 온도(실험 설계에 따라 다름)에 노출됩니다. 파리가 회복되도록 허용하고 회복 시간을 측정합니다[37,65].
최근 연구에 따르면 장내 미생물군은 초파리의 온도 내성에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 헨리 등. 탈염소에 의해 무산 파리를 생성했는데, 파리 알을 2.7% 차아염소산염에 2분, 70% 에탄올에 2분 동안 담근 후 최종적으로 고압멸균수로 2회 세척했습니다. 탈염소 처리 후, 파리를 고압증기멸균된 식품에서 사육했습니다. 그들의 결과는 무성 파리의 내한성이 기존 파리의 내한성에 비해 결함이 있음을 시사합니다. 그러나 무축파리에서는 내열성은 영향을 받지 않았습니다. 이는 미생물총의 파괴가 추위 스트레스에 대처하는 능력을 감소시킨다는 것을 의미합니다[37]. D. subobscura와 같은 다른 Drosophila 종에 대한 연구에 따르면 기존의 파리가 온화한 열 조건에 노출된 것으로 나타났습니다.<34 ◦C) exhibit higher thermal tolerance than axenic flies [38].
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