Cistanche:Echinacoside는 Mitogen-activated protein Kinase Pathway를 통해 세포자멸사를 유도하여 췌장 선암종 세포 성장을 억제합니다
Mar 05, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG 및 XINFENG LI
추상적인.
중국 전통 의학에서 파생된 천연물의 임상 적용은 암 화학 요법에서 주목을 받았습니다.에키나코사이드(ECH), 페닐에타노이드의 하나, 줄기에서 분리시스탄체(중국 약초)는 중추 신경계에 조직 보호 및 항 세포 사멸 효과가 있습니다. 그러나 ECH가 종양 억제 활성을 가지고 있는지 여부는 여전히 파악하기 어렵습니다. 본 연구에서, ECH는 활성산소의 생성과 미토콘드리아 막 전위의 교란을 유도하여 세포자멸사를 유발함으로써 췌장 선암종 세포의 증식을 현저하게 억제할 수 있음이 입증되었다. 또한 ECH가(에키나코사이드)MAPK 활성 조절을 통해 종양 세포 성장을 억제합니다. 결론적으로 이 연구는 ECH(에키나코사이드) 암 발병을 예방하고 ECH의 사용이 암에 대한 잠재적인 화학요법 전략이 될 수 있음을 암시합니다.
소개
종양 억제인자의 유도를 통한 p53 종양 억제인자 경로인 ARF는 발암성 E{1}}리가제 마우스 2분(MDM)2-매개 p53 분해를 완화합니다(3). 이것은 세포가 악성 형질 전환을 방지하는 자동 조절, 자기 보호 메커니즘입니다. 특히, p53은 예를 들어 miR-145를 표적으로 하는 전사적 활성화를 통해 Myc 활성을 억제할 수 있습니다.내 C번역 침묵을 위한 mRNA(4,5), 따라서 음성 피드백 조절 루프를 형성합니다.
암을 치료하는 가장 간단하고 효과적인 전략은 암세포를 죽이는 것입니다. 시스플라틴(6), 악티노마이신 D(7), 아드리아마이신(8)과 같은 일반적으로 사용되는 항암제는 세포자멸사를 촉진하여 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났습니다. 최근에 증가하는 증거는 많은 천연물 및 식물, 특히 중국 전통 의학(TCM)에 사용되는 약용 식물의 파생물이 암세포의 세포자멸사를 유도하여 종양 억제 기능을 나타내고 임상 적용 가능성이 있음을 보여줍니다. 암 치료에서 (9). 예를 들어, 천연 안트라퀴논 에모딘은 다양한 유형의 암세포에서 분리됩니다(10,11). 중국 '행복한 나무'에서 유래한 캄프토테신,캄프토테카 뾰족한, topo I 매개 가닥 파손 후 DNA의 결찰을 억제하는 귀중한 천연 산물입니다(12). 총 729명의 진행성 유방암 환자에 대한 또 다른 후향적 인구 기반 코호트 연구에서 TCM 요법이 암 치료에 기여할 수 있다고 제안되었습니다. 이 코호트 중 115명의 환자는 TCM 사용자였으며 614명의 환자는 TCM을 사용하지 않았습니다. 다변수 분석은 비사용자와 비교하여 TCM 사용이 모든 원인으로 인한 사망 위험을 유의하게 감소시키는 것과 관련이 있음을 보여주었습니다(13). 앞서 언급한 모든 발견은 TCM이 암 치료에 사용될 수 있는 중요한 보완 대체 의학임을 나타냅니다.
급성 폐 손상이 있는 마우스(16,17). 또한, ECH(에키나코사이드)신경 조직에 보호 효과가 있고 파킨슨병의 쥐 모델에서 행동 장애를 개선하는 것으로 나타났습니다(18). 특히, ECH는 마우스 장 상피 MODE-K 세포에서 세포 증식을 촉진하고 세포자멸사를 억제하는 것으로 밝혀졌습니다(19). 그러나 지금까지 암 예방에서 ECH의 잠재적인 역할에 대한 관심은 적었습니다.
이 연구에서는 ECH 치료가 종양 세포 성장과 증식에 영향을 미치는지 여부와 ECH가(에키나코사이드)세포 사멸을 유도하고 활성 산소 종(ROS)의 생산을 증가시키며 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 감소시켜 결과적으로 종양 세포 성장을 억제합니다. 또한, 본 연구는 ECH 매개 세포 성장 억제를 담당하는 분자 메커니즘을 확인하는 것을 목표로 하고 있습니다.
재료 그리고 행동 양식
셀 선, 시약, 그리고 항체.SW1990 췌장 선암종 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 10% 소 태아 혈청, 50U/ml 페니실린 및 0.1mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형 Eagle 배지에서 37˚C에서 배양되었습니다. 5% CO2 가습 대기. ECH(에키나코사이드)Jrdun Biotechnology Corp.(중국 상하이)에서 구입했습니다. AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 및 GAPDH에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입했습니다. anti-Bax 및 anti-Bcl{8}}은 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입했습니다. 항Caspase{10}}는 Abcam(중국 상하이)에서 구입했습니다.
셀 생존 능력시험. 종양 세포 성장 속도를 평가하기 위해 제조업체의 지침에 따라 Cell Counting kit{{0}}(CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA)를 사용했습니다. 세포 현탁액을 96 -웰 배양 플레이트에서 0, 12, 24, 48 또는 72시간 동안 ECH 처리로 웰당 5{3}}개의 세포로 시딩했습니다. 세포 성장 억제는 CCK-8 키트의 WST{10}} 시약을 각 웰에 최종 농도 10%로 첨가하여 결정했으며, 샘플의 흡광도는 마이크로플레이트 리더(Multiskan MK3; Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).
훽스트 33342 더럽히는 것.세포(60% 합류)는 1의 최종 농도에서 Hoechst 33342(Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China)로 처리되었습니다.µg/ml, 37˚C 인큐베이터에서 15분 동안 배양, 인산완충식염수로 2회 세척, 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하고 슬라이드에 장착합니다. 세포핵의 형태적 변화를 형광현미경(Olympus BX51, Melville, NY, USA)으로 관찰하였다. 정상 핵은 둥글고 밝은 파란색으로 염색된 반면, 세포사멸 핵은 수축되어 밝은 파란색으로 염색되었습니다.
형광 활성화 셀 정렬 (팩스) 복수.세포 사멸의 평가를 위해 fluorescein isothiocyanate (FITC)-Annexin V Apoptosis Detection kit (BD Biosciences, Shanghai, China)를 제조업체의 지침에 따라 사용했습니다. 간단히 말해서, 5x1{4}}4 세포를 빙냉 PBS로 세척하고 0.1ml 결합 완충액(Beyotime Institute of Biotechnology)에 재현탁하고 10ml의 FITC-컨쥬게이션된 Annexin V(10mg/ml) 및 10ml로 염색했습니다. ml 요오드화 프로피듐(PI)(50 mg/ml). 암실에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고 400ml 결합 완충액을 첨가한 후, 세포를 유세포 분석기(C6; BD Biosciences, Shanghai, China)로 분석했습니다.
측정 의 반응성 산소 종 (ROS).ROS의 생산을 평가하기 위해 Reactive Oxygen Species Assay kit(Vigorous Biotechnology, Beijing, China)를 제조업체의 지침에 따라 사용했습니다. 간단히 말해서, 세포(80% 합류)를 수확하고 PBS로 세척한 후 디하이드로에티듐(DHE) 용액(Beyotime Institute of Biotechnology)으로 염색했습니다. 그런 다음 세포를 유세포 분석으로 분석했습니다.
측정 의 미토콘드리아 막 잠재적인 (MMP).
테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM) 분석 키트(ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA)를 사용하여 MMP의 변화를 감지했습니다. 간단히 말해서, 세포(80% 합류)를 수확하고 PBS로 세척하고 37˚C 인큐베이터에서 15-20분 동안 TMRM으로 염색했습니다. 그런 다음 세포를 PBS로 한 번 세척하고 유세포 분석을 수행했습니다.
면역블롯팅복수. 세포(8% 합류)를 수확하고 50mM Tris-HCl, pH 7.4로 구성된 RIPA 완충액(Jrdun Biotechnology)에서 용해했습니다. 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP-40, 1% 소듐 데옥시콜산 및 0.1% SDS 및 새로 추가된 프로테아좀 억제제. 동일한 양의 투명 세포 용해물을 이전에 설명한 대로 면역블롯팅 분석에 사용했습니다(20).
통계 분석.정량적 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 통계적 차이는 통계적 SPSS 15.{2}} 소프트웨어를 사용하여 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정에 의해 평가되었습니다. 피<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
결과
ECH (에키나코사이드)억제하다 종양 셀성장. ECH가 보고되었지만(에키나코사이드)신경 세포 및 장 상피 세포({0}})와 같은 체세포에서 세포자멸사 및 염증 신호를 억제함으로써 보호 역할을 나타내지만 ECH가 암 세포 성장 및 증식을 제어하는지 여부는 여전히 파악하기 어렵습니다. 이를 테스트하기 위해 2등급 췌장 선암종에서 유래한 SW1990 세포를 그림 1과 같이 적정 용량의 ECH로 처리하여 세포 생존 분석을 수행했습니다. 특히, ECH는 용량에서 종양 세포 증식을 유의하게 지연시키는 것으로 입증되었습니다. 5-일 배양 기간 동안 -의존적 방식(그림 1).ECH 방아쇠아폽토시스. apoptosis의 손실은 췌장암 세포의 통제되지 않은 증식을 뒷받침하는 주요 원인 메커니즘 중 하나이기 때문에(21), 본 연구는 ECH가 apoptosis를 유발하는지 여부를 결정하기 위해 일련의 실험을 수행했습니다. 첫째, Hoechst 33342로 종양 세포의 핵을 염색하여 ECH가 용량 의존적 방식으로 세포자멸사를 초래한다는 것이 입증되었습니다(그림 2A). 또한, FACS 분석은 Annexin V/PI 염색을 사용하여 수행하여 ty ECH의 세포자멸사 효과를 추가로 확인했습니다(그림 2B). 세포 사멸 세포의 평균 백분율은 정상 배양 조건에서 1.1%인 반면, 이 백분율은 용량 의존적 방식으로 ECH 처리에 반응하여 10.6, 21.4 및 51.3%로 유의하게 증가했습니다(그림 2C). 이러한 결과는 그림 1에 표시된 세포 생존력 분석과 함께 ECH 처리가 세포 사멸을 유발하여 종양 세포의 증식을 억제한다는 것을 보여줍니다.
이 연구에서 ROS 생산을 평가하기 위해 DNA와 삽입되는 ethidium을 생성했습니다. 다른 항암제와 마찬가지로 ECH도 ECH 치료 시 증가된 형광 강도에서 볼 수 있듯이 용량 의존적 방식으로 ROS 생성을 자극하는 것으로 밝혀졌습니다(그림 3).
ECH (에키나코사이드)감소 MMP.미토콘드리아 기능 장애는 세포 사멸의 유도와 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개방은 막횡단 전위의 탈분극과 세포자멸사 촉진 인자의 방출을 유도하는 것으로 입증되었습니다(23). 따라서 TMRM 형광의 강도는 막 전위에 비례하므로 ECH가 잘 정립된 접근 방식인 TMRM 분석을 수행하여 종양 세포에서 MMP의 손실을 유도할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. ECH 처리는 MMP를 용량 의존적으로 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 4).ECH 통제 수단 종양 셀 성장 ~을 통해 미토겐 활성화 단백질ECH 매개 종양 세포 사멸의 분자적 기초, 세포 생존 및 사멸을 제어하는 MAPK 및 AKT(24,25)와 같은 여러 중요한 신호 전달 경로의 활성을 조사했습니다. MAPK는 세포외 신호 조절 키나제(ERK), c-Jun NH{6}}말단 키나제(JNK) 및 3-단계를 통해 활성화되는 p38 계열 구성원을 포함하여 진화적으로 보존된 프롤린 유도 Ser/Thr 단백질 키나제입니다. 계층 키나아제 신호 전달 캐스케이드(26,27). 이 연구에서는 MAPK와 AKT의 발현과 활성화된 인산화 형태를 평가했으며 ECH가 JNK와 ERK1/2 활성을 현저하게 억제하지만 p38 활성은 향상시키는 것으로 나타났습니다(그림 5). 특히, 세포 증식에 결정적으로 중요한 AKT 활성이 ECH 처리에 의해 영향을 받지 않는다는 것이 입증되었다(도 5). 또한 ECH 처리는 Bax와 Caspase{16}}의 발현을 증가시키는 반면 Bcl{17}} 발현은 감소시키는 것으로 나타났으며(그림 5), 이는 그림 2와 일치합니다. 따라서 결과는 다음과 같습니다. ECH는 MAPK 경로를 통해 종양 세포 사멸을 유발합니다.
논의
우리가 아는 한, 이것은 ECH가 세포 사멸을 유발하고(그림 2), ROS 생성을 촉진하고(그림 3) 미토콘드리아 막 전위 탈분극을 유도함으로써(그림 4) 종양 억제 기능이 있음을 보여주는 첫 번째 연구입니다. , 결과적으로 종양 세포 성장 억제로 이어진다(그림 1). 또한 ECH 매개 종양 세포 사멸의 분자적 기반은 MAPK 신호 전달 경로를 조절함으로써 발생하는 것으로 나타났습니다(그림 5). 이러한 발견은 종양 형성을 예방하는 ECH의 새로운 기능을 입증하고 따라서 그것이 암 치료를 위한 후보 약제가 될 수 있음을 시사합니다.
대부분의 항암제는 종양 세포 사멸, 노화 및/또는 세포 주기 정지를 유도하여 종양 세포 성장 및 증식을 억제할 수 있습니다. 세포 주기 정지는 복제 DNA 합성 또는 유사분열을 시작하기 전에 세포가 손상된 DNA를 복구할 수 있도록 하는 약한 스트레스 신호에 대한 세포 반응이며, 반면에 회복할 수 없거나 악성 세포를 제거하는 스트레스 신호에 대한 반응으로 아폽토시스 및 노화(영구적 세포 주기 정지)가 발생합니다. 28,29). 따라서 암세포를 죽이는 것이 항암제의 효능을 평가하는 주요 기준이기 때문에 이 연구에서는 종양 세포에 대한 ECH의 세포자멸사 효과만을 평가했습니다. 특히, ECH가 의 발현을 유도한다는 것이 입증되었다.백스(그림 5), 종양 억제 인자 p53(30)에 의해 전사적으로 활성화된 pro-apoptotic 유전자. 따라서 ECH가 p53 신호 전달 경로를 활성화할 수 있는지 여부를 테스트할 가치가 있습니다. 그렇다면 ECH는 p53-의존적 세포 주기 정지, 노화, 세포자멸사 또는 자가포식을 유도할 수도 있습니다. 본 연구에서는 SW1990 췌장 선암종 세포주에서 ECH의 종양 억제 기능을 규명하였다. 그러나 더 많은 췌장암 세포주를 관찰하는 추가 연구가 필요합니다. 발암성 단백질인 RAS와 종양 억제인자 p53의 돌연변이가 췌장암 발병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다(31). 그러나 IARC p53 데이터베이스(http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx)에 따르면 SW1990 세포주는 p53 돌연변이를 포함하지 않습니다. 따라서 ECH가 다른 p53 돌연변이를 가진 다른 췌장암 세포주의 성장과 증식에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하는 것이 중요합니다. 또한 ECH가 세포자살을 촉진하고 다른 유형의 종양의 성장을 억제할 수 있는지 여부를 결정하는 것이 흥미로울 것입니다.
ECH 치료로 인한 ROS 상승 및 MMP 감소는 세포 사멸 유도에 필수적인 것으로 나타났습니다 (22). 또한, ROS는 시토크롬 방출에 기여하는 미토콘드리아 공극의 산화를 유도할 수 있음이 밝혀졌습니다.c, MMP의 파괴로 인한 세포 사멸의 중간체(22). 따라서 ECH가 ROS의 유도를 통해 간접적으로 MMP를 방해하는지 여부를 결정해야 합니다. 또한, ROS 유발 산화 스트레스는 p53, NF-κB, HIF 및 PI3K를 포함한 수많은 세포 성장 제어 신호를 조절하는 데 관여하는 것으로 나타났습니다(32). ECH가 이러한 중요한 신호 전달 경로를 조절하는지 여부와 만약 그렇다면 어떻게 조절하는지 결정해야 합니다. 특히, 산화 스트레스는 높은 산소 소비량, 약한 항산화 시스템 및 중추 신경계의 말단 분화 특성으로 인해 다양한 신경 퇴행성 질환을 유발합니다 (33). 그러나 여러 연구에서 ECH가 신경 조직에 대한 보호 및 항-세포자멸 효과가 있음을 보여주었습니다. 이와 관련하여 ECH가 말단 분화 신경 세포에서 ROS 생성을 감소시킬 수 있다고 가정하는 것이 합리적입니다. 따라서 ECH에 의한 ROS 생산의 조절이 세포 분화 상태에 의존하는지 여부도 결정해야 합니다. 따라서 현재의 결과는 다른 연구와 함께 널리 사용되는 한의학인 ECH가 신경퇴행성 질환뿐만 아니라 악성 암종 치료에 중요한 화학요법 전략이 될 수 있음을 보여줍니다.
최근, 암 치료에 TCM을 사용하는 것이 점점 더 주목을 받고 있습니다. TCM에서 사용되는 약용 식물의 천연 제품의 잠재력은 서구 세계에서도 과학계에 의해 인정되었습니다(9). 이러한 천연물의 근본적인 작용 기전을 밝히기 위한 노력이 필요하며, 이는 궁극적으로 암 치료를 위한 효율적이고 안전한 의약품의 개발로 이어질 수 있습니다.
결론적으로, 본 연구는 ECH의 종양 억제 기능을 입증하고 ECH 매개 종양 억제의 분자적 기초를 정교화하여 암 치료에서 ECH의 잠재적인 임상 적용을 제안합니다.
감사의 말
이 연구는 FMU의 과학 연구 핵심 프로그램(보조금 번호 09ZD014)의 지원을 받았습니다. 저자는 원고 편집에 도움을 주신 Biomedworld(중국 상하이)에 감사드립니다.
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