PART Ⅰ: 스트렙토조토신-니코틴아미드 유도 당뇨병 쥐의 수컷 생식 기능에 대한 세뇨관 추출물의 효과
Mar 04, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He 및 Shu-Cheng Cheng
추상적인:당뇨병은 인슐린 수치가 감소하거나 조직이 인슐린을 효과적으로 사용하지 못하여 고혈당이 나타나는 만성 질환입니다. 불임은 당뇨병의 주요 결과로 알려져 있으며 정자 손상 및 생식선 기능 장애를 일으켜 남성 생식 기관에 영향을 미칩니다.시스탄체 튜불로사기억력, 면역력, 성기능을 향상시키고 발기부전을 감소시키며 변비를 최소화하는 기생식물입니다. 이 연구는 에키나코사이드(ECH)의 항염증 및 보호 효과에 대한 조사에 중점을 두었습니다.Cistanche tubulosa 추출물(CTE) 당뇨병 쥐의 남성 생식 기관에 대한. CTE의 항산화, 항염 및 보호 효과는 시험관 내 및 생체 내 방법으로 평가되었습니다. 시험관 내 결과는 ECH가 활성 산소 종(ROS) 생성을 억제하고 StAR, CYP11A1, CYP17A1 및 HSD17p3 단백질 발현을 개선했음을 보여줍니다. 생체 내 분석은 CTE에서 3가지 용량의 에키나코사이드(ECH)(8{10}}, 160, 320 mg/kg)로 수행되었습니다. 총 0.571 mg/kg의 rosiglitazone(RSG)이 양성 대조군으로 투여되었습니다. 당뇨병은 스트렙토조토신(STZ)(65mg/kg) 및 니코틴아미드(230mg/kg)와 고지방식(45%)의 조합으로 유발되었습니다. 생체 내 연구에 따르면 ECH는 혈당 수치, 인슐린 저항성, 렙틴 저항성 및 지질 과산화를 개선했습니다. 시상하부에서 키스펩틴 1(KiSS1), G 단백질 결합 수용체 GPR 54, 사이토카인 신호전달 3(SOCS{21}}) 및 시르투인 1(SIRT1) 메신저 리보핵산(mRNA) 발현을 회복시키고 성을 회복할 수 있습니다. 호르몬 수치. 따라서 본 연구는 CTE의 항산화, 항염 및 스테로이드 생성 효과를 확인하였다.
키워드:당뇨병; 불모;Cistanche tubulosa 추출물 (CTE); 에키나코사이드(ECH); 항염 작용; 항산화 활성; 스테로이드 생성 효과
당뇨병 치료:Cistanche tubulosa 추출물(CTE)
1. 소개
당뇨병(DM)은 췌장이 충분한 인슐린을 생산하지 못하거나 신체가 이를 효과적으로 사용하지 못하여 혈액 내 포도당 수치가 증가하는 상태입니다. WHO에 따르면 당뇨병 환자는 1980년 1억 800만 명에서 2014년 4억 2200만 명으로 늘었다[1]. 당뇨병 전단계(당뇨병 전 단계), 1형(췌장에서 인슐린 생성 실패), 2형(신체에서 인슐린 사용 실패), 임신성 당뇨병(임신 중 발생)의 네 가지 주요 범주가 있습니다. 산화 스트레스는 활성 산소종(ROS)과 항산화제의 생성 사이의 불균형으로 인해 발생하며[2] 결국 당뇨병 상태로 이어집니다. 당뇨병의 합병증에는 신장 기능 부전, 신경 손상, 실명, 뇌졸중, 심장 마비, 태아 사망 및 불임이 포함됩니다. [1]. 연구에 따르면 남성 당뇨병 환자에서 정자 핵, 디옥시리보핵산(DNA) 및 미토콘드리아가 크게 손상되었습니다[3]. 정자 수송 중 산화 스트레스는 남성 생식 기관의 과정을 변화시킵니다[4,5].
정자 생성 과정은 시상하부-뇌하수체-성선(HPG) 축에 의해 제어됩니다. 시상하부에서 생성되는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH)은 황체 형성 호르몬(LH)과 난포 자극 호르몬(FSH)의 생성을 자극합니다. Leydig 세포는 정세관에 인접하여 발견되며 LH의 제어하에 테스토스테론을 생성합니다. FSH는 남성 호르몬을 전달하는 데 도움이 되는 항원 결합 단백질(ABP)의 생성을 유발합니다. 따라서 주로 HPG 축에서 발생하는 교란으로 인해 불임 및 기타 문제가 발생합니다. 스트렙토조토신-니코틴아미드의 조합 투여는 실험 쥐에서 당뇨병을 유도합니다. 스트렙토조토신은 췌장에서 인슐린을 생성하는 p 세포에 유독한 화합물이며 니코틴아미드는 p 세포를 완전한 손상으로부터 보호하는 수용성 비타민입니다[6].
Cistanche tubulosa는 "Rou Cong-Rong"[7]으로도 알려진 사막 식물 종입니다. 주로 Calotropis Procera 나무의 뿌리에서 자라며 간쑤, 칭하이, 신장, 몽골, 이란, 인도의 건조한 땅에 널리 분포하는 비엽록소 기생 식물입니다. Cistanche tubulosa의 일반적인 이름은 "사막 히아신스"입니다. 그것은 중국 전통 의학에서 널리 받아 들여지며 "사막의 인삼"이라는 이름이 주어졌습니다. 병적인 백반증, 과다한 요실금, 만성 신장 질환, 변비, 발기 부전 및 불임 치료에 의약 분야에서 널리 사용됩니다. 의 화학 성분시스탄체 튜불로사비휘발성 페닐에타노이드 배당체(PHG), 이리도이드, 리그난, 휘발성 오일, 알디톨, 올리고당 및 다당류로 구성됩니다[8]. 연구에 따르면 이 허브의 에키나코사이드는 ROS 수준을 조절하여 손상된 섬유아세포를 보호합니다[9]. 이 화합물은 신경 보호 및 골다공증 예방과 함께 항산화, 혈관 이완 및 항염 활성을 생성합니다[10,11].
이 연구는 조사하는 것을 목적으로 하였다Cistanche tubulosa 추출물의 효과streptozotocin-nicotinamide로 유도된 당뇨병 쥐의 생식 기능 장애에 ECH 함유
시스탄체 튜불로사
2. 재료 및 방법
2.1.재료
ECH 및 CTE는 Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd(Yilan, Taiwan)에서 구입했습니다. 고급 당화 최종 산물(AGEs)은 Biovision(미국 캘리포니아주 샌프란시스코)에서 구입했습니다. LC{0}} 및 TM3 세포주는 Food Industry Research and Development Institute(대만 신주)에서 구입했습니다. 5주 된 Sprague-Dawley(SD) 수컷 쥐를 국립 실험 동물 센터(대만 타이페이)에서 구입했습니다. Feed Lab Diet®는 PMI Nutrition International, Inc.(대만 타이페이)에서 구입했습니다. 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH)은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 입수했습니다. 메탄올 및 4-(2-하이드록시에틸){10}}피페라진에탄설폰산(HEPES)도 Sigma에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/F12 및 트립신-EDTA는 GIBCO(New York, NY, USA)에서 입수했습니다. 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일){17}}, 5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), 디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA), 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 니트로블루 테트라졸륨(NBT)은 Sigma에서 구입했습니다. 포도당 효소 키트는 일본 도쿄의 Kyokutoseiyaku에서 구입했습니다. 인슐린 ELISA 키트는 Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A(Uppsala, Sweden)에서 구입했습니다. T-PER 조직 단백질 추출 시약은 Thermo Scientific(Chicago, IL, USA)에서 구입했습니다. 항-인간/마우스/쥐 핵 인자-카파 B NF-kB 다클론 항체는 미국 캘리포니아주 산타 크루즈에 소재한 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)에서 구입했습니다. 고급 당화 최종 생성물(RAGE) 다클론 항체용 항-마우스/쥐 수용체, 항-인간/마우스/쥐 StAR 다클론 항체 및 항-인간/마우스/쥐 사이토크롬 P450 17A1 단클론 항체는 Gene Tex에서 구매했습니다. (미국 캘리포니아주 어바인). 항-인간/마우스/쥐 CYP11A1 다클론 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, PA, USA)로부터 입수하였다. easy-Blue 시약은 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했습니다. Agarose 및 DNA 마커 100 bp는 Promega, Corporation(Madison, WI, USA)에서 구입했습니다. RNeasy Lipid Tissue Mini Kit는 독일 Hilden의 QIAGEN에서 구입했습니다.
2.2.방법
2.2.1. 체외 분석
LC{0}} 및 TM3 세포 배양: LC-540 세포주는 중탄산나트륨(1.5g/L)이 보충된 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS) 배지에서 370℃에서 배양되었습니다. -글루타민(2mM), 비필수 아미노산(0.1mM), 피루브산나트륨(1.{21}}mM), 소태아혈청(FBS)(10%) 퍼센트 CO2 인큐베이터(CO2 인큐베이터, Napco 5410, 대만). TM3 세포주는 포도당(4.5g/L), 피루브산나트륨(0.5mM), L-글루타민(2.5mM), 중탄산나트륨(1.2g/L), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES, 15mM) 및 소 태아 혈청(FCS, 10%) 또는 말 혈청(5%)을 37 OC에서 5 퍼센트 CO2 인큐베이터.
Echinacoside(ECH)의 세포 생존력 측정: 3-(4, 5-디메틸티아졸{3}}일)-2,5- 디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 시약은 세포 생존력 분석에 사용됩니다. 96-웰 플레이트에서 세포 농도를 2 x 105 cells/mL로 조정했습니다. 그런 다음, 20 L의 ECH(배지 2%로 희석)를 첨가하고 5% CO2 인큐베이터에서 37℃, 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 나중에, 100 L의 MTT 시약을 첨가하고 어두운 조건에서 4hat37 OC 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 570 nm에서 측정되었습니다(ELISA 판독기, Dynatech MR5000, Kloten, Switzerland).
Restive CeH viabiHiy(퍼센트)=[(570nm에서 샘플 — 570nm에서 Ablank)]/[(570에서 Acontrol — 570에서 Ablank)] x 100.
Nitroblue Tetrazolium(NBT) 환원 분석 및 2,{1}}디페닐{2}}피크릴히드라질(DPPH) 분석: 세포 수를 1x 1{{1{12}}}6 cells/mL로 조정했습니다. . 그런 다음, 50mg/mL의 ECH, 레스베라트롤(RES) 및 고급 당화 최종 생성물(AGE)(대조군)을 첨가하고 370℃에서 18시간 동안 공배양했습니다. 그런 다음, 0.3mL의 NBT 용액(0.1mg/mL NBT, 5% FBS, 10mL DMEM에 용해된 3% 디메틸 설폭사이드(DMSO))을 첨가하고 37℃에서 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 원심분리(800 xg에서 3분) 후 상층액을 제거하고 200μL DMSO를 첨가하고 초음파 발진기(Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan)에서 5분 동안 진탕했습니다. 흡광도는 630 nm에서 측정되었습니다. DPPH 라디칼 분석의 경우 Trolox(95% 알코올)를 표준으로 사용했습니다. 그런 다음 0.5mM DPPH 용액 75μL와 시료 25μL를 혼합하고 실온에서 어두운 곳에서 30분간 반응시켰다. 혼합물을 흔들고 흡광도를 517 nm에서 측정하였다.
반응성 산소 종(ROS) 함량 분석: 2% FBS를 함유하는 12-웰 플레이트에서 세포 수를 2 x 105 cells/mL로 조정했습니다. 그런 다음, 50 ㎕/mL의 ECH, RES 및 AGE를 플레이트에 첨가하고 370℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 2Z,7Z-디클로로플루오레세인-디아세테이트(DCFH-DA)를 첨가하고 370℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리(400x g, 5분) 후, 상층액을 제거하고 세포를 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척했습니다. 세포를 1 mL의 PBS에 현탁시킨 후 유세포 분석기(Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA)를 사용하여 ROS의 수준을 측정하였다.
단백질의 동정 및 정량 분석: 단백질 추출 시약(T-PER)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 12-웰 플레이트에서 세포 밀도를 2 x 105 cells/ml로 조정하고 ECH, RES 및 RAGE(Advanced glycation endproduct) 길항제 수용체를 50 ㎕/mL로 조정하고 AGE를 첨가하고 370℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 그 후, T-PER 400㎕를 첨가하고 세포를 긁어내고 125xg에서 20분(40℃) 동안 원심분리했습니다. 상청액을 수집하고 추가 분석을 위해 -80 OC({16}} OC Freezer, Nuaire, Plymouth, MN, USA)에 보관했습니다. Bicinchoninic acid(BCA) 키트는 단백질 정량에 사용되었습니다. 그런 다음, 표준 세포 용액 10L와 BCA 시약 200RL을 8-웰 플레이트에 첨가하고 5% CO2 인큐베이터에서 37O C에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 흡광도는 562 nm에서 측정되었습니다. 단백질 동정 분석은 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE) 전기영동으로 수행하였다. 단백질 로딩 완충액에 단백질 용해물을 첨가하여 샘플을 제조하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 특정 단백질을 검출하였다.
2.2.2.생체내 분석
동물 모델 디자인: 60마리의 {{0}}주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐를 국립 실험 동물 센터(대만 타이페이)에서 구입했습니다. 각 쥐는 12시간 명/12시간 암주기로 제어된 온도(23 土 1도) 및 습도(40-60%) 하에 소독제 스테인리스 스틸 케이지에 개별적으로 수용되었습니다. 음식과 물은 임의로 제공되었습니다. 각 쥐는 첫 주에 길들여지고 실험실 설치류 식단 5001이 주요 식단으로 주어졌습니다. 모든 절차는 대만 국립대만해양대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 승인 번호 101026)의 표준을 따랐습니다. 길들여진 후 쥐를 두 그룹으로 나누었습니다. 실험군 식이 5001을 먹인 대조군(Con)과 전체 실험 동안 고지방식이(HFD, 40%)를 먹인 당뇨병 환자였습니다. 4주 동안 HFD를 공급한 후, 당뇨병군 쥐에게 스트렙토조토신(65mg/kg)(STZ)을 주사하여 진성 당뇨병(DM)을 유도하였다. STZ를 주사한 지 15분 이내에 니코틴아미드(230mg/Kg 체중)를 주사했습니다. 주사 일주일 후, 당뇨병성 진성(DM)의 성공적인 유도를 결정하기 위해 경구 포도당 내성 검사(OGTT)가 수행되었습니다. 그 후, 동물을 6개의 그룹으로 나누었습니다: 대조군(실험실 식단 5001을 먹인); DM 그룹(DM + 45% HFD); DMR 그룹(DM + 로시글리타존: 0.571 mg/kg BW) + 45% HFD; DME1 그룹(DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; DME2 그룹(DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; 및 DME4 그룹(DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitazone(RSG)은 양성 대조군으로 사용되었습니다. 대만 식품의약국(TFDA) 건강 식품 기능 평가 지침의 권장 사항에 따라 CTE의 3가지 용량(80, 160 및 320 mg/kg)을 사용했습니다. 실험이 끝날 때까지 치료가 주어졌다. 모든 실험용 쥐는 6주 후에 희생되었습니다. 쥐로부터 채혈한 혈액은 4도에서 3000rpm으로 15분간 원심분리하였다.
관자미안 유효성분
다음 분석을 위해 상층액을 조사했습니다.
총 포도당, 트리글리세리드 및 콜레스테롤 측정: 포도당 측정은 포도당 효소 키트로 수행되었습니다. 그런 다음, 혈장 샘플 20개를 시약에 첨가하고 5분 동안 37도에서 유지하였다. 총 중성지방과 총 콜레스테롤 농도는 중성지방과 콜레스테롤 효소 키트를 이용하여 측정하였다. 그 다음, 10 μL의 혈장을 시약에 첨가하고 제조자의 지시에 따라 실험을 수행하였다. 흡광도는 510 nm에서 측정되었습니다.
혈장 총 포도당/중성지방/콜레스테롤(mg/dL)=(-ABlank)/(Astandard - ABlank) x 200.
A 시료: 혈액 시료의 흡광도, ABlank: 시료가 없는 키트의 흡광도 값, A 표준: 표준 시약의 흡광도 값, 200: 농도 200mg/dL의 표준 시약.
인슐린, 렙틴 및 항상성 모델 평가-인슐린 내성(HOMA-IR) 결정: 인슐린 수준은 인슐린 ELISA 키트에 의해 결정되었습니다. 여기에 혈장 25개를 시약에 첨가하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 렙틴 함량은 렙틴 효소 면역 측정 분석 키트를 사용하여 결정되었습니다. 그런 다음, 100개의 혈장을 분석하고 ELISA 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전체 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. HOMA-IR 값은 항상성 모델 평가 방정식=공복 혈장 인슐린 농도(mU/mL) x 공복 혈장 포도당 농도(mmol/L)/22.5로부터 결정되었습니다.
혈장 지질 과산화: 여기에서 {{0}}.5 mL의 혈장을 1 mL의 시약(15%, 0.25N 염산(HCl) 중 w/v 트리클로로아세트산 ) 및 0.375%, 0.25N HCl 중 w/v 티오바르비투르산)을 100℃에서 15분 동안 수조(Water Bath, BUCHI461, Zurich, Switzerland)에 두었다. 냉각 후, 1mL의 n-부탄올을 첨가하고, 격렬하게 진탕하고, 1500 xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 수집하고 흡광도를 532 nm에서 측정하였다[12].
말론디알데히드(MDA) 농도(nM/mL)=[(532 nm에서 A샘플 - 532 nm에서 Ablank)/(532 nm에서 표준물질 - 532 nm에서 Ablank)] x 5.
혈장 테스토스테론 및 황체형성 호르몬(LH) 수준 측정: 테스토스테론 ELISA 키트를 사용하여 혈장 내 테스토스테론 수준을 측정했습니다. RIA 키트를 사용하여 LH 농도를 결정했습니다. 그런 다음, 50 ㎕의 혈장을 추가하고 호르몬 LH-RP-3(표준)의 농도를 기준으로 계산했습니다. 제조업체의 지침에 따라 추가 단계를 수행했습니다.
종양 괴사 인자(TNF)-a 및 인터루킨-6(IL-6) 농도 측정: 포획된 항체를 코팅 완충액에서 250배 희석하고, {{4} }웰 플레이트(100 卩L/웰)에 넣고 4℃에서 밤새 보관하였다. 상청액을 흡인하고 세척 완충액(1회 PBS, 0.05% Tween 20)으로 5회 세척하였다. 200 μg의 분석 희석제로 배양(1시간) 후, 세포를 세척 완충액으로 5회 세척하고 100 μL의 TNF-α 표준 용액 또는 시험 샘플을 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 배양하였다. 세척 후 100 RL의 IL{18}} 검출된 항체를 첨가하고 실온에서 인큐베이션했습니다. 상층액을 흡인하고 5회 세척하였다. 그런 다음, 480 RL의 효소 아비딘-고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 흡인하고 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 그 다음, 기질 용액 100 RL을 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이후 각 well에 stop solution(1M phosphoric acid) 50 RL을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Cistanche Echinacoside의 이점: 항산화
정자 및 고환 매개변수 분석
정자 시료 채취: 정자 시료 채취는 [13]에 보고된 방법에 따라 수행하였다. 상층액에서 정자를 수집하여 추가 분석에 사용했습니다.
정자 수, 정자 운동성 및 비정상 정자 수: 혈구계산기와 트립판 블루 용액을 이용하여 정자 수를 계산하였다. 그런 다음 100 RL의 정자액을 트리판 블루 용액에 혼합하고 혈구계와 현미경을 이용하여 정자의 수, 운동성, 비정상 정자를 계산하였다[14].
Nitro blue Tetrazolium NBT 감소 및 정자 및 고환의 지질 과산화: 지질 과산화 및 NBT 감소는 혈장 분석과 동일한 절차에 따라 분석되었습니다.
슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 및 카탈라제 활성 측정: 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 활성은 RANSEL 키트를 사용하여 분석되었습니다. 여기서, {{0}.{6}}반응 용액 1.7mL({13}}.05mM 크산틴, 0.025mM 2-({ {9}}요오도페닐)- 3-(4-니트로페놀)-5-페닐테트라졸륨 클로라이드(INT)). 혼합 후 xanthine oxidase (80 U/L) 0.25 ml를 첨가하고 상온에서 30초 동안 상온에서 반응시켰다. 흡광도는 505 nm에서 측정되었습니다. 고환 균질액의 단백질 농도는 Bio-Rad DC 단백질 분석 키트로 측정하고 비활성(U/mg 단백질)을 계산했습니다. 카탈라아제(CAT) 활성은 이전에 보고된 방법에 따라 결정되었습니다[15].
H&E(헤마톡실린 및 에오신) 염색
고환을 10% 포르말린에 24시간 동안 담그고 4℃에서 보관하였다. 조직을 마이크로 크기로 슬라이스하여 슬라이드에 부착하였다. 고정(95% 메탄올 + 5% 초산) 후 슬라이드를 헤마톡실린에 3분간 담그고 흐르는 물에 5분간 세척한 후 50%, 70%, 90% 알코올에 1분간 담가두었습니다. 그 후, 슬라이드를 eosin으로 10초 동안 염색하고 100% 알코올에 1분 동안 색이 바랠 때까지 담가두었습니다. 마지막으로 슬라이드를 자일렌에 1분 동안 담가두었습니다. 나중에 슬라이드를 공기 건조하고 밀봉했습니다. 염색된 튜브를 도립 위상차 현미경(Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK{14}}, Tokyo, Japan)에 넣어 형태를 관찰하였다.
시상하부의 분석
마우스 KISS1, G-단백질 결합 수용체(GPR) 54, 사이토카인 신호전달 억제인자 3(SOCS{4}}) 및 시르투인 1(SIRT1) 유전자 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전자 데이터베이스에서 확인되었습니다. 특정 프라이머는 Primer 5를 사용하여 설계되었습니다.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA). 실험에 사용된 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다.
시상하부에서 리보핵산(RNA) 추출. 뇌의 시상하부에서 RNA 추출은 RNeasy Lipid Tissue Mini Kit를 사용하여 수행되었습니다. 얻어진 mRNA를 역전사(RT) 및 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 정량적으로 측정하였다. RT 분석에서 얻은 보완 DNA는 나중에 사용하기 위해 -20도에 저장되었습니다. 추출된 DNA는 Taq 중합효소를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR) 분석을 수행하였다. 그런 다음, 5~10 μL의 PCR 산물을 취하여 1.5% 한천 콜로이드 상에서 전기영동으로 분석하였다. 이미지는 UVP BioDoc-It 이미징 시스템에서 촬영되었습니다. 역전사된 cDNA(complementary deoxyribonucleic acid)를 채취하고 IQ SYBR Green Supermix Kit를 사용하여 PCR을 수행했습니다. 나중에 iQTM 5 광학 시스템 소프트웨어로 분석했습니다. 단백질 추출 시약(T-PER)을 사용하여 단백질을 추출하였다. 그런 다음, 20mg의 고환 균질액을 400μL의 T-PER에 첨가하고 4도(125,{15}} xg)에서 원심분리했습니다(High Speed Centrifuge, Hettich CR{12}}, Tuttlingen, Germany). 20분 하기 방법은 "단백질의 동정 및 정량분석" in vitro 분석과 유사하였다.
2.3.통계분석
실험 결과는 평균 土 표준편차(Mean 土 SD)로 표시되었으며 데이터는 Statistical Product & Service Solutions(SPSS) 11.{1}} 소프트웨어, IBM, Armonk, New York, NY, USA를 사용하여 분석되었습니다. 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 분석되었습니다. 다른 그룹의 다중 비교는 유의 수준으로 p < 0.05의="" 값에서="" duncan의="" 테스트에="" 의해="">
