Streptozotocin-Nicotinamide로 유발된 당뇨병 쥐의 남성 생식 기능에 Cistanche Tubulosa 추출물이 미치는 영향-Ⅰ

1. 소개

당뇨병(DM)은 당뇨병이 증가된 상태입니다.포도당 수준충분한 인슐린을 생산하는 췌장의 비효율성 또는 신체가 인슐린을 효과적으로 사용할 수 없기 때문에 혈액에 존재합니다. WHO에 따르면 당뇨병 환자의 수는 1980년 1억 800만 명에서 2014년 4억 2200만 명으로 증가했습니다[1]. 당뇨병 전단계(당뇨병 전 단계), 제1형(췌장이 인슐린을 생산하지 못하는 경우), 제2형(신체가 인슐린을 사용하지 못하는 경우), 임신성 당뇨병(임신 중에 발생함)의 네 가지 주요 범주가 있습니다. 산화 스트레스는 활성 산소종(ROS)과 항산화 물질의 생성 사이의 불균형으로 인해 발생하며[2] 결국 당뇨병 상태로 이어집니다. 당뇨병의 합병증으로는 신장 부전, 신경 손상, 실명, 뇌졸중, 심장마비, 태아 사망, 불임 등이 있습니다. [1]. 연구에 따르면 남성 당뇨병 환자에서는 정자 핵, DNA(디옥시리보핵산) 및 미토콘드리아가 크게 손상되었습니다[3]. 정자 이동 중 산화 스트레스는 남성 생식 기관의 과정을 변화시킵니다[4,5].

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정자 형성 과정은 시상하부-뇌하수체-생선(HPG) 축에 의해 제어됩니다. 시상하부에서 생성되는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH)은 황체 형성 호르몬(LH)과 난포 자극 호르몬(FSH)의 생성을 자극합니다. 라이디히 세포는 정세관 근처에서 발견되며,테스토스테론을 생산하다LH의 통제 하에 있다. FSH는 남성 호르몬의 전달을 돕는 항원 결합 단백질(ABP)의 생성을 촉발합니다. 따라서 불임 및 기타 문제는 주로 HPG 축에서 발생하는 교란으로 인해 발생합니다. 스트렙토조토신-니코틴아미드 병용 투여는 실험용 쥐에서 당뇨병을 유발합니다. 스트렙토조토신은 췌장의 인슐린 생산 세포에 독성이 있는 화합물이고 니코틴아미드는 세포가 완전히 손상되지 않도록 보호하는 수용성 비타민입니다[6].

Cistanche tubeulosa는 "Rou Cong-Rong"으로도 알려진 사막 식물 종입니다 [7]. 주로 Calotropis procera 나무의 뿌리에 자라는 비엽록소 기생식물로 간쑤성, 칭하이성, 신장성, 몽골, 이란, 인도 등의 건조한 땅에 널리 분포합니다. Cistanche tubeulosa의 일반적인 이름은 "Desert Hyacinth"입니다. 그것은 중국 전통 의학에서 널리 받아들여지고 있으며 "사막의 인삼"이라는 이름이 주어졌습니다. 그것은 병적인 백혈병, 과도한 자궁출혈, 만성 신장 질환, 변비, 발기 부전 및 불임을 치료하기 위해 의약 분야에서 널리 사용됩니다. 화학 성분Cistanche tubeulosa는 비휘발성 페닐에타노이드 배당체로 구성됩니다.(PHG), 이리도이드, 리그난, 휘발성 오일, 알디톨, 올리고당 및 다당류 [8]. 연구에 따르면에키나코시드이 허브의 성분은 ROS 수준을 조절하여 손상된 섬유아세포를 보호합니다[9]. 이 화합물은 신경보호 및 골다공증 예방과 함께 항산화, 혈관이완, 항염증 활성을 나타냅니다[10,11].

본 연구는 의 효과를 조사하는 것을 목적으로 했다.시스탄체 튜불로사 추출물스트렙토조토신-니코틴아미드 유발 당뇨병 쥐의 생식 기능 장애에 대한 ECH 함유.

2. 재료 및 방법

2.1. 재료

ECH와 CTE는 Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd(대만 이란)에서 구입했습니다. 고급 당화 생성물(AGE)은 Biovision(San Francisco, CA, USA)에서 구입했습니다. LC-540 및 TM3 세포주는 식품 산업 연구 개발 연구소(대만 신주)에서 구입했습니다. 5주령 Sprague-Dawley(SD) 수컷 쥐를 국립실험동물센터(대만 타이페이)에서 구입했습니다. Feed Lab Diet®은 PMI Nutrition International, Inc.(대만 타이페이)에서 구입했습니다. 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH)은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 메탄올과 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)도 Sigma에서 구입했습니다. Dulbecco 변형 Eagle 배지/F12 및 트립신-EDTA는 GIBCO(New York, NY, USA)에서 구입했습니다. 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), 디클로로-디히드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA), DMSO(디메틸 설폭사이드) 및 NBT(니트로블루 테트라졸륨)는 Sigma에서 구입했습니다. 포도당 효소 키트는 일본 도쿄의 Kyokutoseiyaku에서 구입했습니다. 인슐린 ELISA 키트는 Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A(스웨덴 웁살라)에서 구입했습니다. T-PER 조직 단백질 추출 시약은 Thermo Scientific(Chicago, IL, USA)에서 구입했습니다. 항인간/마우스/랫트 핵 인자-카파 B NF-κB 다클론 항체는 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 Santa Cruz Biotechnology에서 구입했습니다. RAGE(Advanced Glycation End Products) 다클론 항체, 항Human/Mouse/Rat StAR 다클론 항체 및 항Human/Mouse/Rat Cytochrome P450 17A1 단클론 항체에 대한 항-Mouse/Rat 수용체는 Gene에서 구입했습니다. 텍스(미국 캘리포니아주 어바인). 항-인간/마우스/쥐 CYP11A1 다클론 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, PA, USA)에서 구입했습니다. Easy-Blue 시약은 Thermo Fisher Scientific(Carlsbad, CA, USA)의 Invitrogen에서 구입했습니다. Agarose와 DNA marker 100bp는 Promega, Corporation(Madison, WI, USA)에서 구입했습니다. RNeasy Lipid Tissue Mini Kit는 독일 힐덴 소재 QIAGEN에서 구입했습니다.

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2.2. 행동 양식

2.2.1. 체외 분석

LC{{0}} 및 TM3 세포 배양: LC-540 세포주는 중탄산나트륨(1.5 g/L)이 보충된 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS) 배지에서 37oC에서 배양되었습니다. L-글루타민(2mM), 비필수 아미노산(0.1mM), 피루브산나트륨(1.{21}}mM), 소태아혈청(FBS)(10%) 5% CO2 인큐베이터(CO2 인큐베이터, Napco 5410, 대만). TM3 세포주를 포도당(4.5g/L), 피루브산나트륨(0.5mM), L-글루타민(2.5mM), 중탄산나트륨(1.2g/L), {{ 28}}(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES, 15mM) 및 송아지 태아 혈청(FCS, 10%) 또는 말 혈청(5%), 37°C에서 5% CO2 인큐베이터.

세포 생존 가능성의 결정에키나코사이드(ECH): 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5- 디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 시약을 세포 생존율 분석에 사용했습니다. 96-웰 플레이트에 세포 농도를 2×105 세포/mL로 조정하였다. 그런 다음 ECH(2% 배지로 희석) 20μL를 첨가하고 5% CO2 인큐베이터에서 37oC에서 24시간 동안 배양했습니다. 나중에 100 µL의 MTT 시약을 첨가하고 어두운 조건에서 37oC에서 4시간 동안 배양했습니다. 흡광도는 570nm에서 측정되었습니다(ELISA 리더, Dynatech MR5000, Kloten, Switzerland).

상대 세포 생존율(%)=[(570nm에서 샘플 − 570nm에서 공백)]/[(570에서 Acontrol − 570에서 공백)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium(NBT) Reduction Assay 및 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) Assay: 세포 수를 1×1{{1{12}}}}6개 세포/로 조정했습니다. mL. 그런 다음 50 mg/mL의 ECH, 레스베라트롤(RES) 및 고급 당화 최종 생성물(AGE)(대조군)을 첨가하고 37oC에서 18시간 동안 공동 배양했습니다. 그런 다음 0.3 mL의 NBT 용액(10 mL DMEM에 용해된 0.1 mg/mL NBT, 5% FBS 및 3% 디메틸 설폭사이드(DMSO))을 첨가하고 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양했습니다. 원심분리(800×g에서 3분간) 후 상층액을 제거하고 200μL DMSO를 첨가한 후 초음파 발진기(Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan)에서 5분간 흔들었습니다. 흡광도는 630 nm에서 측정되었습니다. DPPH 라디칼 분석을 위해 Trolox(95% 알코올 중)를 표준으로 사용했습니다. 그런 다음 0.5mM DPPH 용액 75μL를 시료 25μL와 혼합하고 실온, 어두운 곳에서 30분간 반응시켰다. 혼합물을 흔들고 517 nm에서 흡광도를 측정했습니다.

활성산소종(ROS) 함량 분석: 2% FBS가 포함된 12-웰 플레이트에서 세포 수를 2 x 105 세포/mL로 조정했습니다. 그런 다음 50 µL/mL의 ECH, RES 및 AGE를 플레이트에 첨가하고 37oC에서 24시간 동안 배양했습니다. 24시간 후, 20,70 -디클로로플루오레세인-디아세테이트(DCFH-DA)를 첨가하고 37oC에서 30분 동안 배양했습니다. 원심분리(400×g, 5분) 후 상청액을 제거하고 세포를 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 그 후, 세포를 1 mL의 PBS에 현탁시키고 ROS 수준을 유세포 분석기(Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA)를 사용하여 측정했습니다.

단백질의 동정 및 정량분석: 단백질 추출시약(T-PER)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 12-웰 플레이트에서 세포 밀도를 2 x 105 세포/mL로 조정하고 ECH, RES 및 RAGE(Advanced Glycation End Product) 길항제에 대한 수용체를 50 μL/mL로 조정하고 AGE를 첨가하여 배양했습니다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안. 그 후, 400 µL의 T-PER를 첨가하고 세포를 긁어낸 후 125000×g에서 20분(4°C) 동안 원심분리했습니다. 추가 분석을 위해 상층액을 수집하여 -80°C(-80°C 냉동고, Nuaire, Plymouth, MN, USA)에 보관했습니다. 단백질 정량에는 BCA(bicinchoninic acid) 키트가 사용되었습니다. 그런 다음 표준 세포 용액 10μL와 BCA 시약 200μL를 8-웰 플레이트에 첨가하고 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 30분간 배양했습니다. 흡광도는 562nm에서 측정되었습니다. 단백질 식별 분석은 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE) 전기영동에 의해 수행되었습니다. 단백질 로딩 완충액에 단백질 용해물을 첨가하여 샘플을 준비하고 특정 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다.

2.2.2. 생체 내 분석

동물 모델 디자인: 60마리의 {{0}주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐를 국립 실험실 동물 센터(대만 타이페이)에서 구입했습니다. 각 쥐는 온도(23 ± 1oC)와 습도(40~60%)가 12시간 명/12시간 암주기로 조절되는 소독용 스테인레스 스틸 케이지에 개별적으로 보관되었습니다. 음식과 물은 자유롭게 제공되었습니다. 각 쥐는 첫 주에 길들여졌고 실험실 설치류 식단 5001을 주요 식단으로 제공했습니다. 모든 절차는 대만 국립대만해양대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 승인 번호 101026)의 표준을 따랐습니다. 가축화 후 쥐를 두 그룹으로 나누어 실험 내내 실험실 식단 5001을 먹인 대조군(Con)과 고지방식(HFD, 40%)을 먹인 당뇨병 그룹으로 나누었습니다. 당뇨병이 있는 쥐에게 HFD를 4주 동안 먹인 후 streptozotocin(65 mg/kg)(STZ)을 주사하여 당뇨병(DM)을 유도했습니다. STZ 주입 후 15분 이내에 니코틴아미드(230mg/Kg 체중)를 주입했습니다. 주사 후 1주일 후에 당뇨병(DM)의 성공적인 유도를 확인하기 위해 경구당부하검사(OGTT)를 실시했습니다. 그 후, 동물을 6개 그룹으로 나누었습니다: 대조군(실험실 식단 5001을 먹였습니다); DM 그룹(DM + 45% HFD); DMR 그룹(DM + 로시글리타존: 0.571 mg/kg BW) + 45% HFD; DME1 그룹(DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; DME2 그룹(DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; 및 DME4 그룹(DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitazone(RSG)을 양성 대조군으로 사용했습니다. 대만 식품의약청(TFDA) 건강식품 기능성 평가 지침의 권장 사항에 따라 3가지 용량의 CTE(80, 160 및 320mg/kg)를 사용했습니다. 실험이 끝날 때까지 치료를 실시했습니다. 모든 실험 쥐는 6주 후에 희생되었습니다. 쥐로부터 채취한 혈액은 4℃에서 15분간 3000rpm으로 원심분리하였다. 다음 분석을 위해 상청액을 검사했습니다.

총 포도당, 트리글리세리드 및 콜레스테롤 측정: 포도당 측정은 포도당 효소 키트로 수행되었습니다. 그런 다음 혈장 샘플 20μL를 시약에 첨가하고 37oC에서 5분간 유지했습니다. 총 중성지방과 총 콜레스테롤 농도는 중성지방과 콜레스테롤 효소 키트를 사용하여 결정되었습니다. 그 후 시약에 혈장 10 μL를 첨가하고 제조사의 지시에 따라 실험을 진행하였다. 흡광도는 510 nm에서 측정되었습니다.

혈장 총 포도당/중성지방/콜레스테롤(mg/dL)=(Asample − ABlank)/(Astandard − ABlank) × 200.

Asample: 혈액 샘플의 흡광도, ABlank: 샘플이 없는 키트의 흡광도 값, Astandard: 표준 시약의 흡광도 값, 200: 200 mg/dL 농도의 표준 시약.

인슐린, 렙틴 및 항상성 모델 평가 - 인슐린 저항성(HOMA-IR) 결정:인슐린 수준은 인슐린 ELISA 키트에 의해 측정되었습니다. 여기, 25µ혈장 L을 첨가하였다.시약을 사용하고 450 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 총 렙틴 함량은 다음을 사용하여 결정되었습니다.렙틴 효소 면역 측정 분석 키트.그러면 100µL의 혈장을 분석하고 흡광도를ELISA 리더를 사용하여 450 nm에서 측정되었습니다. 전체 실험은 다음에 따라 수행되었습니다.제조업체의 지침. HOMA-IR 값은 항상성 모델로부터 결정되었습니다.평가 방정식=공복 혈장 인슐린 농도(mg/mL)× 공복 혈장 포도당농도(mmol/L)/22.5.

혈장 지질 과산화: 여기서 {{0}}.5 mL의 혈장을 1 mL의 시약(15%, w/v 트리클로로아세트산 중 0.25 N 염산(HCl)과 혼합했습니다. ) 및 0.375%, w/v thiobarbituric acid in 0.25 N HCl)을 수조(Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Switzerland)에 넣어 100 ◦C에서 15분 동안 유지합니다. 식힌 후 n-부탄올 1 mL를 첨가하고 세게 흔든 후 1500 x g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 수집하고 532nm에서 흡광도를 측정했습니다[12].

말론디알데히드(MDA) 농도(nM/mL)=[(532 nm의 샘플 – 532 nm의 공백)/(532 nm의 표준 – 532 nm의 공백)] × 5.

532 nm에서 표준 - 532 nm에서 공백)] × 5. 혈장 테스토스테론 및 황체형성 호르몬(LH) 수준 측정: 테스토스테론 ELISA 키트를 사용하여 혈장 내 테스토스테론 수준을 측정했습니다. RIA 키트를 사용하여 LH 농도를 측정했습니다. 그런 다음 혈장 50μL를 추가하고 호르몬 LH-RP-3(표준)의 농도를 기준으로 계산했습니다. 추가 단계는 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다.

종양 괴사 인자(TNF)- 및 인터루킨-6(IL-6) 농도 측정: 포획된 항체를 코팅 완충액에 250배 희석하고 96- 웰 플레이트(100 µL/well)를 넣고 밤새 4°C에 보관했습니다. 상층액을 흡인하고 세척 완충액(1회 PBS, 0.05% Tween 20)으로 5회 세척했습니다. 200μg의 분석 희석액과 함께 배양(1시간)한 후, 세포를 세척 완충액으로 5회 세척하고 100μL의 TNF- 표준 용액 또는 시험 샘플을 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 배양했습니다. 세척 후 IL{18}} 검출 항체 100μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 상등액을 흡인하고 5회 세척하였다. 그런 다음, 480 μL의 효소 아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양했습니다. 상청액을 흡인하고 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 그런 다음 기질 용액 100 μL를 첨가하고 실온에서 15분간 배양하였다. 이후 각 웰에 정지 용액(1M 인산) 50μL를 첨가하고 450nm에서 흡광도를 측정했습니다.

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정자와 고환 매개 변수 분석

정자 샘플 수집: 정자 샘플 수집은 이전에 보고된 방법([13])에 따라 수행되었습니다. 정자는 상청액으로부터 수집되어 추가 분석에 사용되었습니다.

정자 수, 정자 운동성 및 비정상 정자: 혈구계산기와 트립판 블루 용액을 사용하여 정자 수를 계산했습니다. 그런 다음 정자액 100 μL를 트리판 블루 용액과 혼합하고 혈구계산기와 현미경을 사용하여 정자 수, 운동성 및 비정상 정자의 수를 계산했습니다[14].

Nitro blue Tetrazolium NBT 감소 및 정자와 고환의 지질 과산화: 혈장 분석과 동일한 절차에 따라 지질 과산화 및 NBT 감소를 분석했습니다.

슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 및 카탈라제 활성의 측정: 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 활성은 RANSEL 키트를 사용하여 분석되었습니다. 여기서는 {{0}}.05 mL의 고환 균질액을 1.7 mL의 반응 용액(0.05 mM xanthine, 0.025 mM 2-({ {9}}요오도페닐)- 3-(4-니트로페놀)-5-페닐테트라졸륨 클로라이드(INT)). 혼합 후, 0.25 mL의 xanthine oxydase (80 U/L)를 첨가하고 실온에서 30초 동안 반응시켰다. 흡광도는 505 nm에서 측정되었습니다. 고환 균질액의 단백질 농도는 Bio-Rad DC 단백질 분석 키트로 측정하고 비활성(U/mg 단백질)을 계산했습니다. 카탈라아제(CAT) 활성은 이전에 보고된 방법에 따라 측정되었습니다[15].

H&E(헤마톡실린 및 에오신) 염색

고환을 10% 포르말린에 24시간 동안 담가둔 후 4℃에 보관했습니다. 조직은 마이크로 크기로 되어 슬라이드에 부착되었습니다. 고정 후(95% 메탄올+ 5% 아세트산) 헤마톡실린에 슬라이드를 3분간 담그고 흐르는 물에 5분간 세척한 후 50%, 70%, 90% 알코올에 담가서 1분간 담갔다. 1분. 그 후, 슬라이드를 10초 동안 에오신으로 염색하고 100% 알코올에 1분 동안 희미해질 때까지 담가 두었습니다. 마지막으로 슬라이드를 자일렌에 1분간 담가 두었습니다. 나중에 슬라이드를 공기 건조시키고 밀봉했습니다. 염색된 튜브를 도립 위상차 현미경(Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Japan)에 넣어 형태를 관찰했습니다.

시상하부의 분석

마우스 KISS1, G-단백질 결합 수용체(GPR) 54, 사이토카인 신호 전달 억제 인자 3(SOCS-3) 및 시르투인 1(SIRT1) 유전자 서열이 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전자 데이터베이스에서 확인되었습니다. Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.)를 사용하여 특정 프라이머를 설계했습니다. 실험에 사용된 프라이머는 표 1과 같다.

시상하부에서 리보핵산(RNA) 추출. 뇌의 시상하부로부터 RNA 추출은 RNeasy Lipid Tissue Mini Kit를 이용하여 진행하였습니다. 얻은 mRNA를 역전사(RT)와 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 정량적으로 측정하였다. RT 분석에서 얻은 Complement DNA는 나중에 사용하기 위해 -20oC에 보관했습니다. 추출된 DNA를 Taq 중합효소를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR) 분석을 실시하였다. 그런 다음 PCR 산물 5~10 µL를 취하여 1.5% 한천 콜로이드에서 전기영동하여 분석하였습니다. 이미지는 UVP BioDoc-It 이미징 시스템에서 촬영되었습니다. 역전사된 상보적 디옥시리보핵산(cDNA)을 채취하고 IQ SYBR Green Supermix Kit를 사용하여 PCR을 수행했습니다. 나중에 iQTM 5 광학 시스템 소프트웨어로 분석되었습니다. 단백질 추출 시약(T-PER)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 그런 다음 고환 균질액 20mg을 T-PER 400μL에 첨가하고 4°C에서 원심분리했습니다(High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Germany)(125,000× g ) 20분 동안. 하기 방법은 in vitro 분석의 "단백질 동정 및 정량 분석"과 유사하였다.

2.3. 통계 분석

실험 결과는 평균±표준편차(Mean ±SD)로 표현하였고, 데이터는 Statistical Product & Service Solutions(SPSS) 11.{1}} 소프트웨어, IBM, Armonk, New York, NY, USA를 이용하여 분석하였다. 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석(ANOVA)으로 분석되었습니다. 다양한 그룹의 다중비교는 p < 0.05 값을 유의수준으로 하여 Duncan's test를 통해 분석하였다.

3. 결과

3.1. 체외 분석

3.1.1. ECH, CTE, RES의 항산화 활성 비교

장기 시간높은 산화 스트레스와 만성 염증은 당뇨병의 주요 원인입니다합병증 [16]. CTE에는 다양한 내용이 포함되어 있습니다.에키나코사이드와 같은 페닐에타노이드 배당체(ECH) 및 액티오사이드, 항산화 활성 가능성이 있음 [17]. DPPH 라디칼 소거ECH의 항산화 활성을 평가하기 위해 분석을 수행했습니다. 트롤록스와 레스베라트롤(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES)를 각각 표준 및 양성 대조군으로 사용했습니다. 보여진 바와 같이그림에서1, ECH는 더 나은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며 활성도가 상당히 높았습니다.양성대조군(RES)보다

3.1.2. LC-540 및 TM3 Leydig 세포에서 ECH의 세포 생존 가능성

다양한 농도의 ECH의 세포 생존성을 평가하기 위해 MTT 분석을 수행했습니다. LC-540 Leydig 세포와 TM3 Leydig 세포는 ECH 처리 후 80% 이상의 생존율을 보여주었습니다(그림 2). 다른 농도와 비교하여, ECH의 100-μM 농도(2% FBS에서 100μM의 희석)는 TM3 Leydig 세포에서 더 나은 세포 생존력을 보여주었습니다. 결과는 증가된 ECH 농도가 세포에 어떠한 심각한 독성에도 기여하지 않는다는 것을 나타냅니다.

3.1.3. LC-540 및 TM3 Leydig 세포에서 NBT 분석을 통한 AGE 유발 초산화물 생성에 대한 ECH의 영향

AGE는 포도당의 산화와 O2-, 하이드록실 라디칼, 카르보닐기와 같은 자유 라디칼의 형성으로 인해 체내 산화 손상을 유발합니다[18]. 50 ug/mL의 AGE로 자극한 후, LC{3}}(그림 3a) 및 TM3(그림 3b) 세포를 ECH 및 RES(각각 5 μM 및 10 μM)로 처리했습니다. 그 결과, 대조군(자극된 AGE)에서는 과산화물 음이온의 생성이 증가하였으나, 대조군(자극된 AGE) 이후에는 과산화물 음이온의 생성이 감소하였으나, 과산화물 생성 후 과산화물 음이온의 생성이 감소하여 보호되는 것으로 나타났다. 산화 손상으로부터 세포. LC-540 세포의 경우 10 µM ECH가 정상군과 거의 유사한 활성을 나타냈습니다. ECH와 RES의 농도가 증가함에 따라 두 세포 모두의 초과산화물 생성이 감소했습니다.

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3.1.4. AGE 자극 LC-540 Leydig 세포에서 H2O2 생산에 대한 ECH의 효과

DCFH-DA 분석을 실행하여 산화종의 존재를 검출했습니다. 형광염료 DCFH-DA는 세포 안으로 들어간 후 세포내 H2O2에 의해 산화되어 디클로로플루오레세인(DCF)을 형성합니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이, AGE 자극 그룹(대조군)에서 세포 내 H2O2 생산이 크게 증가한 반면, 10μM ECH와 RES를 첨가하면 세포에서 H2O2 생산이 크게 감소했습니다. 10μM ECH를 투여하면 H2O2 생산량이 약 47.1%에 불과해 대조군에 비해 상당히 낮습니다.

3.1.5. AGE 자극 LC{5}} 레이디히 세포에서 RAGE 및 NF-κB 단백질 발현 수준에 대한 ECH의 영향

LC{0}} Leydig 세포에서 RAGE의 존재를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. AGEs 자극 Leydig 세포에서 RAGE(그림 5a) 및 NF-κB(그림 5b) 단백질 발현 수준에 대한 ECH의 효과는 그림 5에 나와 있습니다. 결과는 50 µg/mL 농도의 AGE가 더 높은 RAGE 및 NF-를 유도하는 것으로 나타났습니다. LC-540 Leydig 세포의 κB 발현과 10μM 농도의 ECH 및 RES는 RAGE 및 NF-κB의 발현을 크게 감소시켰습니다. NF-κB의 발현은 RAGE 길항제보다 RES와 ECH에서 유의하게 낮았습니다. 따라서 ECH가 RAGE와 NF-κB의 수준을 감소시켜 염증 수준을 감소시키는 결과를 확인했습니다.

3.1.6. AGE 자극 LC{4}} Leydig 세포에서 테스토스테론 합성 경로에 대한 ECH의 효과.

정자 형성과 남성 불임의 과정은 테스토스테론의 존재에 달려 있습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 StAR(그림 6a), CYP11A1(그림 6b), CYP17A1(그림 6c) 및 HSD17 3(그림 6d) 단백질의 발현은 AGE 자극 LC{{11 }} 라이디히 세포(대조군). StAR, CYP11A1, CYP17A1 및 HSD{16}} 단백질의 발현은 RAGE 길항제, RES 및 ECH를 첨가했을 때 유의하게 증가되었습니다. StAR 및 CYP11A1 단백질의 발현 증가는 ECH 및 RES 처리 그룹 모두에서 나타났습니다. CYP17A1의 발현 수준은 RES와 ECH 그룹에서 거의 유사했습니다. ECH 처리된 Leydig 세포에서 HSD17 3 단백질의 발현은 RES 및 RAGE 길항제 처리된 세포의 발현보다 훨씬 높았습니다. StAR, CYP11A1, CYP17A1 및 HSD{30}} 단백질의 발현 증가는 테스토스테론의 정상적인 생산을 나타냅니다.